Quantifizierung der Besiedlungsrate von arbuskulären Mykorrhizapilzen bei der Erforschung invasiver gebietsfremder Pflanzen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet einen einfachen und leicht anzuwendenden Ansatz zur Bestimmung der Besiedlungsrate von Arbuskulären Mykorrhizapilzen (AMF) in den Wurzeln invasiver Pflanzen.

Zusammenfassung

Arbuskuläre Mykorrhizapilze (AMF) sind weit verbreitete Bodenpilze in Ökosystemen und können mit den Wurzeln der meisten Landpflanzen symbiotische Assoziationen (Mykorrhiza) bilden. Pflanzen liefern durch Mykorrhiza-Assoziationen Kohlenstoffquellen für AMF, während AMF-Hyphen den Bereich der Nährstoffaufnahme durch die Wurzeln erweitern und die Nährstoffaufnahme der Pflanzen fördern können. Es gibt viele verschiedene Arten von AMF, und die symbiotischen Beziehungen zwischen verschiedenen AMF-Arten und verschiedenen Pflanzen variieren. Invasive Pflanzen können AMF-Arten durch Wurzelexsudate mit besseren symbiotischen Fähigkeiten bereichern, ihr Wachstum fördern und dadurch ihre Besiedlung in invasiven Pflanzenwurzeln erhöhen. Gleichzeitig können invasive Pflanzen auch die symbiotische Beziehung zwischen AMF und einheimischen Pflanzen stören und die lokale Pflanzengemeinschaft beeinträchtigen, was einer der Mechanismen für eine erfolgreiche Pflanzeninvasion ist. Die Besiedlungsrate von AMF in den Wurzeln invasiver und einheimischer Pflanzen spiegelt indirekt die Rolle von AMF im Prozess der invasiven Pflanzeninvasion wider. Bei dieser Methode können gesammelte Pflanzenwurzeln direkt verarbeitet oder in einem Fixiermittel für die spätere Chargenverarbeitung aufbewahrt werden. Durch Entfärbung, Ansäuerung, Färbung und Entfärbung der Wurzeln können die Hyphen, Sporen und arbuskulären Strukturen von AMF im Wurzelsystem deutlich beobachtet werden. Diese Methode kann in einem Grundlagenlabor durchgeführt werden, um die Besiedlungsrate von AMF im Wurzelsystem invasiver Pflanzen zu beobachten und zu berechnen.

Einleitung

Mykorrhizapilze sind in natürlichen Ökosystemen weit verbreitet und gehen symbiotische Beziehungen mit den Wurzeln der meisten Pflanzen ein, wodurch Mykorrhiza^{gebildet wird 1}. Diese Assoziationen sind für beide Seiten von Vorteil, da Pflanzen photosynthetisch fixierte Kohlenstoffverbindungen wie Fettsäuren und Zucker liefern, um das Wachstum von Mykorrhizapilzen zu unterstützen, während die Pilze im Gegenzug mineralische Nährstoffe wie Phosphor und Stickstoff an die Wirtspflanzen liefern und so das Pflanzenwachstum fördern². Basierend auf ihren Mykorrhizatypen, die mit Pflanzenwurzeln gebildet werden, können Mykorrhizapilze in vier Haupttypen unterteilt werden: Ektomykorrhizapilze (ECM), ericoide Mykorrhizapilze (ERM), Orchideenmykorrhizapilze (ORM) und arbuskuläre Mykorrhizapilze (AM)¹. Unter ihnen haben arbuskuläre Mykorrhizapilze (AMF) die größte Verbreitung und können mit über 80 % der Pflanzenarten Mykorrhiza-Assoziationen bilden ^3,4.

AMF spielen eine entscheidende Rolle bei der Verbesserung des Nährstoffkreislaufs^{im Boden 5}, der Verbesserung der Nährstoffaufnahme^{der Pflanzen 6} und der Regulierung der Pflanzenkonkurrenz und -sukzession. Sie spielen eine wichtige Rolle bei der Invasion invasiver Pflanzenarten ^7,8. Die AMF, die dem Stamm Mucoromycota⁹ zugeordnet ist, umfasst mehr als 250 Arten¹⁰. Die spezifischen symbiotischen Beziehungen zwischen verschiedenen AMF-Arten und verschiedenen Pflanzen können variieren. Invasive Pflanzenarten haben das Potenzial, die AMF-Diversität zu verändern und die Anreicherung von AMF-Arten mit besseren symbiotischen Fähigkeiten zu fördern, die zu ihrem Wettbewerbsvorteil während des Wachstums und der Besiedlung beitragen 8,11,12,13. Das Verständnis der Dynamik von AMF und ihrer Wechselwirkungen mit invasiven Pflanzenarten ist essentiell, um die Mechanismen zu verstehen, die der Pflanzeninvasion und ihren ökologischen Auswirkungen zugrunde liegen.

Qualitative Studien an AMF-Spezies umfassen in der Regel zwei Hauptmethoden. Eine davon ist die morphologische Identifizierung, wie z. B. das Sammeln von AMF-Sporen aus dem Boden mit Methoden wie Nasssiebung-Saccharose-Zentrifugation, gefolgt von der Klassifizierung und Quantifizierung der Sporen auf der Grundlage ihrer Morphologie¹⁴. Die andere Methode umfasst molekulare Techniken, bei denen konservierte Regionen von AMF-Genen amplifiziert und zur Identifizierung sequenziert^{werden 15}. Diese Methoden erfordern jedoch oft umfangreiche Erfahrungen mit der morphologischen Identifizierung oder höhere finanzielle Ressourcen. Auf der anderen Seite liefern quantitative Studien der AMF-Besiedlungsraten zwar keine Veränderungen in der AMF-Spezies und -Zusammensetzung, aber dennoch eine umfassende Bewertung der symbiotischen Beziehung zwischen AMF und Pflanzen. Solche Studien sind sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der anschließenden Validierungsarbeit für Impfexperimente unverzichtbar.

Die Besiedlung von AMF spielt eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung der Ressourcenverteilung zwischen koexistierenden Pflanzenarten⁷. Es spiegelt die Etablierung und Stärke der symbiotischen Beziehung zwischen AMF und den Wurzeln der Wirtspflanze wider. Im gleichen Lebensraum weisen invasive Pflanzenarten im Vergleich zu heimischen Pflanzen oft höhere Besiedlungsraten auf^16,17. Diese verstärkte Besiedlung durch AMF trägt zur erfolgreichen Invasion invasiver Arten wie Ambrosia artemisiifolia¹⁸, Solidago canadensis¹⁹, Sapium sebiferum²⁰, Ageratina adenophora²¹, Sphagneticola trilobata²² und Flaveria bidentis⁷ bei. Das Verständnis der Besiedlungsrate von AMF in den Wurzeln invasiver Pflanzen bildet die Grundlage für die Entschlüsselung der mikrobiellen Mechanismen im Boden, die der erfolgreichen Invasion dieser Arten zugrunde liegen. Die Untersuchung der Besiedlungsrate von AMF in invasiven Pflanzenwurzeln wirft Licht auf die ökologischen Implikationen von Pflanzen-Mikroben-Interaktionen und trägt zu unserem Verständnis der Mechanismen bei, die die Pflanzeninvasion antreiben.

Die Bestimmung der AMF-Besiedlungsrate umfasst eine Färbemikroskopietechnik, die mehrere Schritte umfasst: Wurzelerhaltung, Klärung, Ansäuerung, Färbung, Entfärbung und mikroskopische Untersuchung (Ergänzende Abbildung 1). In den letzten Jahrzehnten haben Forscher verschiedene Beobachtungsmethoden für AMF erforscht und verschiedene Färbetechniken entwickelt. In den frühen Stadien war die Trypanblau-Färbung weit verbreitet^23,24. Diese Methode hat jedoch aufgrund der Toxizität von Trypanblau Einschränkungen. Die saure Fuchsinfärbung hingegen ist eine häufig verwendete Methode, die helle Farben liefert und zuverlässige und stabile Färbeergebnisse liefert²⁵. Darüber hinaus kann die Färbelösung wiederverwendet werden, was sie kostengünstiger macht. Die Besiedlungsrate wird mit Hilfe der Gitterlinien-Schnittektionsmethode bestimmt, die im Vergleich zu anderen Ansätzen objektivere statistische Ergebnisse liefert²⁶. Diese Methode zeichnet sich durch ihre Einfachheit, ihre geringen Kosten und minimalen Geräteanforderungen aus, so dass sie in einfachen Laborumgebungen durchgeführt werden kann. Es bietet einen praktischen und zugänglichen Ansatz zur Beurteilung der Besiedlungsrate von AMF und trägt zu unserem Verständnis der symbiotischen Assoziationen zwischen AMF und Pflanzenwurzeln bei.

Protokoll

Wir führten Experimente mit einer invasiven Pflanze , F. bidentis , und einer einheimischen Pflanze, Setaria viridis, durch. Beide Pflanzen wurden auf Versuchsparzellen an der Langfang Scientific Research Pilot Base der Chinesischen Akademie der Agrarwissenschaften (CAAS) in Hebei, China, angebaut. Jede Pflanzenart wurde einzeln in separaten Parzellen gepflanzt, wobei jede Parzelle 2 m x 3 m groß war und einen Abstand von 1 Meter zwischen den Parzellen hatte. Die Pflanzen wurden auf natürliche Weise wachsen gelassen und nach etwa zwei Monaten wurden Wurzelproben entnommen.

1. Wurzelvorbereitung und -konservierung

1. Wählen Sie für jede Parzelle nach dem Zufallsprinzip drei Pflanzen mit ähnlichen Wachstumsbedingungen aus. Lockern Sie die Erde um die Pflanzen herum mit einer Schaufel auf und ziehen Sie die Pflanzen vorsichtig heraus. Nachdem Sie die Erde von den Wurzeln abgeschüttelt haben, schneiden Sie das gesamte Wurzelsystem ab und bringen Sie es ins Labor. Spülen Sie die gesammelten Wurzelproben gründlich unter fließendem Wasser ab und mischen Sie die Wurzeln von drei Pflanzen aus derselben Parzelle zu einem Replikat.
   HINWEIS: Um die Beschreibung des Betriebsprozesses zu erleichtern, enthält dieses Protokoll Anweisungen für ein biologisches Replikat. Um die Zuverlässigkeit der Versuchsergebnisse zu gewährleisten, wird empfohlen, während des realen Betriebs Proben von mindestens drei biologischen Replikaten gemäß dem Versuchsplan zu entnehmen.
2. Verwenden Sie ein Filterpapier, um überschüssige Feuchtigkeit von den gereinigten Wurzeln zu entfernen und lassen Sie sie an der Luft trocknen.
3. Schneiden Sie beschädigte Wurzeln mit einer Schere ab, schneiden Sie intakte feine Wurzeln ab und bewahren Sie sie für die Lagerung auf oder fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Wenn Sie innerhalb von 2 Tagen mit dem nächsten Schritt fortfahren, lagern Sie sie im Kühlschrank bei 4 °C. Um die Wurzelproben für die spätere Verwendung zu konservieren, lagern Sie sie in einer Fixierlösung, wie z. B. Formalin-Acetoalkohol-Lösung (FAA, 5 ml 38% Formalin + 5 ml Essigsäure + 90 ml 70% Alkohol).
   HINWEIS: Das FAA-Fixiermittel ist NICHT obligatorisch. Wenn es nur eine geringe Anzahl von Proben gibt und die Wurzeln innerhalb kurzer Zeit nach der Entnahme fleckig und gezählt werden können, überspringen Sie den FAA-Fixierschritt und fahren Sie direkt nach dem Abwaschen der Erde von den Wurzeln fort. Wenn Sie FAA-Fixiermittel verwenden, stellen Sie sicher, dass die Operation aufgrund des Vorhandenseins von Formaldehyd in einem gut belüfteten Bereich durchgeführt wird.

2. Verfärbung der Wurzeln

1. Entfernen Sie die konservierten Wurzeln aus der Aufbewahrungslösung und spülen Sie die Wurzeln sauber. Legen Sie die Wurzeln in ein 100-ml-Becherglas und fügen Sie etwa 50 ml 10%ige KOH-Lösung (10 g KOH + 100 mL Wasser) hinzu, wobei Sie darauf achten sollten, dass alle Wurzeln vollständig in die Lösung eingetaucht sind. Den Becher bei 90 °C 30 Min. erhitzen.
   HINWEIS: Passen Sie die Aufheizzeit an die Reife der Wurzeln an. Dieser Schritt entfernt Pigmente von den Wurzeln und macht sie für die mikroskopische Betrachtung transparent.
2. Gießen Sie die KOH-Lösung aus dem Becherglas ab und spülen Sie die Wurzelprobe 3x-6x vorsichtig mit Leitungswasser ab, um eventuelle KOH-Reste zu entfernen. Gießen Sie das überschüssige Wasser ab.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Becherglas und alle verwendeten Werkzeuge gründlich von KOH-Rückständen gereinigt werden, da Reste im nächsten Schritt zu einer unvollständigen Ansäuerung führen können, wodurch die Färbewirkung des sauren Fuchsins beeinträchtigt wird.
3. Geben Sie eine 2%ige HCl-Lösung in das Becherglas und stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeit die Wurzeln vollständig bedeckt. Lassen Sie die Wurzeln 10 min in der sauren Lösung bei Raumtemperatur einweichen.
4. Die HCl-Lösung aus dem Becherglas verwerfen und etwa 50 ml 0,01%ige saure Fuchsinlösung (874 ml Milchsäure, 63 ml Glycerin, 63 ml destilliertes Wasser, 0,1 g saures Fuchsin) hinzufügen. Die Wurzeln bei 90 °C für 20-60 min färben. Nach dem Färben kann die saure Fuchsinlösung zurückgewonnen und für zukünftige Färbungen wiederverwendet werden.
   ANMERKUNG: Die Färbezeit kann je nach Alter und Zustand der Wurzeln variieren, wobei jüngere und zarte Wurzeln möglicherweise über Nacht bei Raumtemperatur gefärbt werden müssen.

3. Entfärbung und Mikroskopie

1. Legen Sie die gefärbten Wurzeln in etwa 50 ml Milchsäure (85%) Lösung, um das saure Fuchsin aus den Wurzelzellen zu entfernen. Die Trennungsbehandlung führt dazu, dass das AMF-Gewebe rot gefärbt wird, während die Wurzelzellen ungefärbt bleiben oder hellrot gefärbt werden. Der zentrale Zylinder kann rot erscheinen.
2. Beobachten Sie das Wurzelgewebe und das Pilzgewebe unter einem 200-fachen Mikroskop, um eine klare Unterscheidbarkeit zu gewährleisten, bevor Sie die Entfärbung stoppen. Wenn die AMF-Struktur und die Wurzelzellen eindeutig unterschieden werden konnten, konnte der Entfärbungsprozess abgeschlossen werden.
   HINWEIS: Passen Sie die Entfärbungszeit basierend auf der Wurzelreife an. Wählen Sie während des Prozesses einige Wurzeln für die Kürbisvorbereitung aus, um sie unter dem Mikroskop zu betrachten.
3. Entfernen Sie die Wurzeln aus der Milchsäurelösung und geben Sie sie in etwa 50 ml Glycerinlösung (99%). Das saure Fuchsin in der AMF-Struktur und den Wurzelzellen trennt sich nicht mehr ab und kann für die anschließende mikroskopische Untersuchung verwendet werden.
4. Geben Sie einen Tropfen Glycerin auf einen Objektträger. Wählen Sie für jedes Replikat nach dem Zufallsprinzip 30-50 Wurzeln aus und schneiden Sie aus jeder Wurzel 1 cm lange Wurzelsegmente ab. Ordnen Sie sie auf Objektträgern mit Glycerin parallel zur kurzen Seite des Objektträgers an und platzieren Sie sie parallel zueinander (Ergänzende Abbildung 1). Platzieren Sie 10 Wurzelabschnitte auf jeder Folie, was zu 3 bis 5 Wiederholungen für jede Wiederholung führt.
   HINWEIS: In diesem Schritt wird die Anzahl der für die Beobachtung verwendeten Stammsegmente beschrieben, wobei die Anzahl der technischen Replikate für jedes Replikat angegeben wird. Die Anzahl der für jede Probe beobachteten Wurzelsegmente sollte auf der Grundlage der Pflanzenart und der Wurzelmorphologie angemessen angeordnet werden. Bei feinen Wurzeln ist die Beobachtung von 30-50 Wurzelsegmenten von je 1 cm Länge pro Probe ausreichend. Bei größeren Wurzeln, wie z. B. denen von Mais, ist es jedoch notwendig, die Anzahl der Beobachtungen entsprechend zu erhöhen. Um die Zuverlässigkeit der statistischen Ergebnisse zu gewährleisten, sollte jede Behandlung mindestens 3 biologische Replikate haben, und jedes biologische Replikat sollte nach der oben genannten Methode betrieben werden.
5. Abdeckung mit Deckglas. Vermeiden Sie nach dem Platzieren des Deckglases ein horizontales Verschieben der Proben, um Reibung oder Verformung der Wurzeln zu vermeiden. Dadurch wird sichergestellt, dass der Normalzustand der Hyphenmorphologie störungsfrei beobachtet werden kann, wodurch die Genauigkeit der Berechnungen der Besiedlungsrate erhalten bleibt.
6. Verwenden Sie ein 200x-Mikroskop, um die Besiedlungsrate mit der Kreuzzählmethode in Bezug auf das schematische Diagramm zu bestimmen (Ergänzende Abbildung 2).
   1. Installieren Sie ein Mikrometer mit Fadenkreuz im Okular des Mikroskops. Verschieben Sie das Sichtfeld auf ein Ende der Wurzel und richten Sie eines der Fadenkreuze parallel zur Wurzel aus. Beobachten Sie, ob die andere Linie die Hyphen, Arbuskeln oder Vesikel kreuzt.
   2. Verschieben Sie das Sichtfeld entlang der Wurzelrichtung zum anderen Ende, wobei Sie jedes Mal die gleiche Entfernung basierend auf den Koordinaten des Mikroskoptisches verschieben. Notieren Sie die Schnittpunkte in jedem Sichtfeld mit einem binären Ansatz (0 oder 1). Wenn sich das andere Fadenkreuz mit AMF-Hyphen, Arbuskeln oder Vesikeln schneidet, wird es in der entsprechenden Zelle der Tabelle als 1 aufgezeichnet. Andernfalls wird sie als 0 aufgezeichnet. Wenn es keine Schnittpunkte mit einer der AMF-Strukturen gibt, wird dies als 1 im negativen Bereich aufgezeichnet. Beobachten Sie 10 Sichtfelder für jedes Wurzelsegment, so dass insgesamt 100 Beobachtungen pro Objektträger erhalten werden, was zu 300 bis 500 Beobachtungen pro Pflanzenprobe führt.

4. Berechnung der Besiedlungsrate

1. Basierend auf der aufgezeichneten Anzahl von Schnittpunkten mit Hyphen (H), Arbuskeln (A) und Vesikeln (V) und Nicht-Mykorrhiza (N) in den 10 Wurzeln jedes Objektträgers (wie in Tabelle 1 gezeigt) berechnen Sie die Besiedlungsraten wie folgt:
   
   Hyphenbesiedlungsrate = (A_H / _{A T}) × 100%
   Arbuskuläre Besiedlungsrate = (A_A / _{A T}) × 100%
   Vesikuläre Besiedlungsrate = (A_V / _{A T}) × 100%
   Gesamtbesiedlungsrate = [(_{A T} - A_N) / A_T] × 100%
   
   Wo:
   A_H: Anzahl der Schnittpunkte mit Hyphen
   A_A: Anzahl der Schnittpunkte mit Arbuskeln
   A_V: Anzahl der Schnittpunkte mit Vesikeln
   A_T: Gesamtzahl der Schnittpunkte
   A_N: Anzahl der Schnittpunkte mit nicht-mykorrhizafarbenen Wurzeln
   
   Diese Berechnungen liefern die Besiedlungsraten für jede Struktur (Hyphen, Arbuskeln und Vesikel) und die Gesamtbesiedlungsrate, die die Summe der Besiedlungsraten für alle Strukturen ist.

Behandlung	Gleiten	Anzahl der Schnittpunkte
		Negativ	Hyphen	Arbuskeln	Bläschen	Gesamt
Beispiel 1	Folie 1	AN1	AH1	AA1	AV1	AT1
	Folie 2	AN2	AH2	AA2	AV2	AT2
	Folie 3	AN3	AH3	AA3	AV3	AT3
Gesamt		AN	AH	AA	EinV	EinT

Tabelle 1: Statistische Tabelle der Besiedlungsraten von arbuskulären Mykorrhizapilzen. Abkürzungen: A_H = Anzahl der Schnittpunkte mit Hyphen; A_A = Anzahl der Schnittpunkte mit Arbuskeln; A_V = Anzahl der Schnittpunkte mit Vesikel; A_T = Gesamtzahl der Schnittpunkte; A_N = Anzahl der Schnittpunkte mit nicht-mykorrhizafarbenen Wurzeln.

Ergebnisse

Die Färbeergebnisse der invasiven Pflanzenwurzeln mit dieser Methode sind in Abbildung 1 dargestellt. Die Strukturen (Hyphen, Arbuskeln, Sporen und Vesikel) von AMF werden rot gefärbt, die Wurzelrindenzellen werden nach dem Entfärben hellrot gefärbt und der zentrale Zylinder wird rot gefärbt. Dieses Färbeergebnis reicht aus, um die Pilzstrukturen zu unterscheiden, da AMF hauptsächlich in der Rinde der Pflanze vorkommt. Aus dem Färbeergebnis können k...

Diskussion

Die Wechselwirkungen zwischen invasiven Pflanzen und AMF sind komplex und vielfältig. Die Untersuchung dieser Wechselwirkungen ist entscheidend für das Verständnis des Erfolgs invasiver Pflanzen und ihrer ökologischen Auswirkungen. Sie können die Invasivität von Pflanzen, die Struktur und Funktion von Bodenökosystemen und die Wettbewerbsfähigkeit heimischer Pflanzen beeinflussen. Die Besiedlungsrate dient als wichtiger Indikator, um den Zusammenhang zwischen invasiven Pflanzen un...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% Alcohol	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd	R433197
Acetic acid solution	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd	A116166
Acid fuchsin	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd	A104917
Formaldehyde solution, Formalin	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd	F111941
Glycerol	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd	G116203
Hydrochloric acid, HCl	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd	H399657
Lactic acid	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd	L432769
Manual System Microscope BX43	Olympus (China) co., Ltd
Potassium hydroxide, KOH	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd	P112284