Quantificazione del tasso di colonizzazione dei funghi micorrizici arbuscolari nello studio delle piante aliene invasive

Riepilogo

Questo protocollo fornisce un approccio semplice e facile da usare per determinare il tasso di colonizzazione dei funghi micorrizici arbuscolari (AMF) nelle radici delle piante invasive.

Abstract

I funghi micorrizici arbuscolari (AMF) sono funghi del suolo ampiamente distribuiti negli ecosistemi e possono formare associazioni simbiotiche (micorrize) con le radici della maggior parte delle piante terrestri. Le piante forniscono fonti di carbonio all'AMF attraverso associazioni micorriziche, mentre le ife dell'AMF possono espandere la gamma di assorbimento dei nutrienti da parte delle radici e promuovere l'assorbimento dei nutrienti da parte delle piante. Esistono molte specie diverse di AMF e le relazioni simbiotiche tra le diverse specie di AMF e le diverse piante variano. Le piante invasive possono arricchire le specie di AMF con migliori capacità simbiotiche attraverso gli essudati radicali, favorendone la crescita e aumentando così la loro colonizzazione nelle radici delle piante invasive. Allo stesso tempo, le piante invasive possono anche interrompere la relazione simbiotica tra AMF e piante autoctone, influenzando la comunità vegetale locale, che è uno dei meccanismi per il successo dell'invasione delle piante. Il tasso di colonizzazione dell'AMF nelle radici delle piante invasive e autoctone riflette indirettamente il ruolo dell'AMF nel processo di invasione delle piante invasive. In questo metodo, le radici delle piante raccolte possono essere lavorate direttamente o salvate in un fissativo per una successiva lavorazione in lotti. Attraverso la decolorazione, l'acidificazione, la colorazione e il trattamento di decolorazione delle radici, le ife, le spore e le strutture arbuscolari dell'AMF nell'apparato radicale possono essere osservate chiaramente. Questo metodo può essere completato in un laboratorio di base per osservare e calcolare il tasso di colonizzazione dell'AMF negli apparati radicali delle piante invasive.

Introduzione

I funghi micorrizici sono prevalenti negli ecosistemi naturali e stabiliscono relazioni simbiotiche con le radici della maggior parte delle piante, formando micorrize¹. Queste associazioni sono reciprocamente vantaggiose, poiché le piante forniscono composti di carbonio fissati fotosinteticamente come acidi grassi e zuccheri per sostenere la crescita dei funghi micorrizici, mentre i funghi ricambiano fornendo nutrienti minerali come fosforo e azoto alle piante ospiti, promuovendo così la crescita delle piante². Sulla base dei loro tipi micorrizici formati con radici di piante, i funghi micorrizici possono essere suddivisi in quattro tipi principali: funghi ectomicorrizici (ECM), funghi micorrizici ericoidi (ERM), funghi micorrizici orchidee (ORM) e funghi micorrizici arbuscolari (AM)¹. Tra questi, i funghi micorrizici arbuscolari (AMF) hanno la distribuzione più ampia e possono formare associazioni micorriziche con oltre l'80% delle specie vegetali ^3,4.

Gli AMF svolgono un ruolo cruciale nel migliorare il ciclo dei nutrienti del suolo⁵, migliorare l'assorbimento dei nutrienti da parte delle piante⁶ e regolare la competizione e la successione delle piante. Svolgono un ruolo importante nel processo di invasione di specie vegetali invasive ^7,8. L'AMF, classificato con il phylum Mucoromycota⁹, comprende più di 250 specie¹⁰. Le relazioni simbiotiche specifiche tra le diverse specie di AMF e le diverse piante possono variare. Le specie vegetali invasive hanno il potenziale per alterare la diversità degli AMF e promuovere l'arricchimento delle specie AMF con migliori capacità simbiotiche che contribuiscono al loro vantaggio competitivo durante la crescita e la colonizzazione 8,11,12,13. Comprendere le dinamiche dell'AMF e le loro interazioni con le specie vegetali invasive è essenziale per comprendere i meccanismi alla base delle invasioni vegetali e il loro impatto ecologico.

Gli studi qualitativi delle specie di AMF coinvolgono tipicamente due metodi principali. Uno è l'identificazione morfologica, come la raccolta di spore di AMF dal suolo utilizzando metodi come la centrifugazione a umido setacciatura-saccarosio, seguita dalla classificazione e quantificazione delle spore in base alla loro morfologia¹⁴. L'altro metodo prevede tecniche molecolari, amplificando le regioni conservate dei geni AMF e sequenziandole per l'identificazione¹⁵. Tuttavia, questi metodi richiedono spesso una vasta esperienza di identificazione morfologica o maggiori risorse finanziarie. D'altra parte, gli studi quantitativi sui tassi di colonizzazione dell'AMF, sebbene non siano in grado di determinare i cambiamenti nelle specie e nella composizione dell'AMF, forniscono comunque una valutazione completa della relazione simbiotica tra AMF e piante. Tali studi sono indispensabili sia nella ricerca di base che nel successivo lavoro di convalida per gli esperimenti di inoculazione.

La colonizzazione dell'AMF svolge un ruolo cruciale nel determinare la distribuzione delle risorse tra le specie vegetali coesistenti⁷. Riflette l'instaurazione e la forza della relazione simbiotica tra l'AMF e le radici delle piante ospiti. Nello stesso habitat, le specie vegetali invasive mostrano spesso tassi di colonizzazione più elevati rispetto alle piante autoctone^16,17. Questa maggiore colonizzazione dell'AMF contribuisce al successo dell'invasione di specie invasive come Ambrosia artemisiifolia¹⁸, Solidago canadensis¹⁹, Sapium sebiferum²⁰, Ageratina adenophora²¹, Sphagneticola trilobata²² e Flaveria bidentis⁷. Comprendere il tasso di colonizzazione dell'AMF nelle radici delle piante invasive fornisce una base per svelare i meccanismi microbici del suolo alla base del successo dell'invasione di queste specie. Lo studio del tasso di colonizzazione dell'AMF nelle radici delle piante invasive fa luce sulle implicazioni ecologiche delle interazioni pianta-microbi e contribuisce alla nostra comprensione dei meccanismi che guidano le invasioni delle piante.

La determinazione del tasso di colonizzazione dell'AMF comporta una tecnica di microscopia a colorazione, che comprende diverse fasi: conservazione delle radici, chiarificazione, acidificazione, colorazione, decolorazione ed esame microscopico (Figura 1 supplementare). Negli ultimi decenni, i ricercatori hanno esplorato vari metodi di osservazione per l'AMF e hanno sviluppato varie tecniche di colorazione. Nelle prime fasi, la colorazione con blu di tripano era ampiamente utilizzata ^23,24. Tuttavia, questo metodo ha dei limiti a causa della tossicità del blu di tripano. La colorazione con fucsina acida, d'altra parte, è un metodo comunemente usato che fornisce colori brillanti e mostra risultati di colorazione affidabili e stabili²⁵. Inoltre, la soluzione colorante può essere riutilizzata, rendendola più conveniente. Il tasso di colonizzazione è determinato utilizzando il metodo dell'intersezione della griglia, che fornisce risultati statistici più oggettivi rispetto ad altri approcci²⁶. Questo metodo è caratterizzato dalla sua semplicità, dal basso costo e dai requisiti minimi di apparecchiature, che lo rendono fattibile da eseguire in ambienti di laboratorio di base. Offre un approccio pratico e accessibile per valutare il tasso di colonizzazione dell'AMF e contribuisce alla nostra comprensione delle associazioni simbiotiche tra AMF e radici delle piante.

Protocollo

Abbiamo condotto esperimenti utilizzando una pianta invasiva F. bidentis e una pianta autoctona Setaria viridis. Entrambe le piante sono state coltivate in appezzamenti sperimentali presso la Langfang Scientific Research Pilot Base dell'Accademia cinese delle scienze agricole (CAAS), Hebei, Cina. Ogni specie di pianta è stata piantata individualmente in appezzamenti separati, con ogni appezzamento che misura 2 m x 3 m e uno spazio di 1 metro tra gli appezzamenti. Le piante sono state lasciate crescere naturalmente e, dopo circa due mesi, sono stati raccolti campioni di radici.

1. Preparazione e conservazione delle radici

1. Per ogni appezzamento, seleziona casualmente tre piante con condizioni di crescita simili. Allenta il terreno intorno alle piante con una pala ed estrai delicatamente le piante. Dopo aver scrollato via il terreno dalle radici, taglia l'intero apparato radicale e portalo in laboratorio. Rifilare accuratamente i campioni di radici raccolti sotto l'acqua corrente e mescolare le radici di tre piante all'interno dello stesso appezzamento per formare una replica.
   NOTA: Per facilitare la descrizione del processo operativo, questo protocollo fornisce istruzioni per una replica biologica. Per garantire l'affidabilità dei risultati sperimentali, si raccomanda di raccogliere campioni da almeno tre repliche biologiche secondo il disegno sperimentale durante le operazioni effettive.
2. Usa una carta da filtro per rimuovere l'umidità in eccesso dalle radici pulite e lasciale asciugare all'aria.
3. Usa le forbici per tagliare le radici danneggiate, tagliare le radici fini intatte e conservarle per la conservazione o procedere al passaggio successivo. Se si procede con il passaggio successivo entro 2 giorni, conservarli in frigorifero a 4 °C. Per conservare i campioni di radice per un uso successivo, conservarli in una soluzione fissativa, come la soluzione di formalina-aceto-alcol (FAA, 5 mL di formalina al 38% + 5 mL di acido acetico + 90 mL di alcol al 70%).
   NOTA: Il fissativo FAA NON è obbligatorio. Se c'è solo un piccolo numero di campioni e puoi macchiare e contare le radici entro un breve periodo dopo la raccolta, salta la fase fissativa FAA e procedi direttamente dopo aver lavato via il terreno dalle radici. Quando si utilizza il fissativo FAA, assicurarsi che l'operazione venga condotta in un'area ben ventilata a causa della presenza di formaldeide.

2. Colorazione delle radici

1. Rimuovi le radici conservate dalla soluzione di conservazione e sciacquale per pulirle. Mettere le radici in un becher da 100 ml e aggiungere circa 50 ml di soluzione di KOH al 10% (10 g KOH + 100 ml di acqua), assicurandosi che tutte le radici siano completamente immerse nella soluzione. Scaldare il bicchiere a 90 °C per 30 min.
   NOTA: Regolare il tempo di riscaldamento in base alla maturità delle radici. Questo passaggio rimuove i pigmenti dalle radici, rendendole trasparenti per l'osservazione microscopica.
2. Versare la soluzione di KOH dal becher e sciacquare delicatamente il campione di radice con acqua di rubinetto 3x-6x per rimuovere eventuali residui di KOH. Versare l'acqua in eccesso.
   NOTA: Assicurarsi che il becher e tutti gli strumenti utilizzati siano accuratamente puliti dai residui di KOH, poiché eventuali residui possono causare un'acidificazione incompleta nella fase successiva, compromettendo così l'efficacia della colorazione dell'acido fucsina.
3. Aggiungere una soluzione di HCl al 2% nel becher, assicurandosi che il liquido copra completamente le radici. Lasciare le radici in ammollo nella soluzione acida a temperatura ambiente per 10 minuti.
4. Scartare la soluzione di HCl dal becher e aggiungere circa 50 mL di soluzione di fucsina acida allo 0,01% (874 mL di acido lattico, 63 mL di glicerolo, 63 mL di acqua distillata, 0,1 g di fucsina acida). Colorare le radici a 90 °C per 20-60 min. Dopo la colorazione, la soluzione di fucsina acida può essere recuperata e riutilizzata per future colorazioni.
   NOTA: Il tempo di colorazione può variare a seconda dell'età e delle condizioni delle radici, con radici più giovani e tenere che potrebbero richiedere una colorazione notturna a temperatura ambiente.

3. Decolorazione e microscopia

1. Mettere le radici colorate in circa 50 ml di soluzione di acido lattico (85%) per rimuovere l'acido fucsina dalle cellule radicolari. Il trattamento di separazione comporterà la colorazione di rosso dei tessuti AMF, mentre le cellule radicolari rimangono incolorate o colorate di rosso chiaro. Il cilindro centrale può apparire rosso.
2. Osservare i tessuti radicali e fungini al microscopio 200x per garantire una chiara distinguibilità prima di interrompere la decolorazione. Quando la struttura dell'AMF e le cellule radicali possono essere chiaramente distinte, il processo di decolorazione può essere completato.
   NOTA: Regolare il tempo di decolorazione in base alla maturità delle radici. Durante il processo, seleziona alcune radici per la preparazione della zucca da osservare al microscopio.
3. Rimuovere le radici dalla soluzione di acido lattico e trasferirle in circa 50 ml di soluzione di glicerolo (99%). La fucsina acida nella struttura dell'AMF e nelle cellule radicali non si separerà più e potrà essere utilizzata per il successivo esame microscopico.
4. Metti una goccia di glicerolo su un vetrino. Per ogni replica, selezionare casualmente 30-50 radici, tagliare segmenti di radice lunghi 1 cm da ciascuna radice. Disporli su vetrini con glicerolo, paralleli al lato corto del vetrino, e posizionarli parallelamente tra loro (Figura supplementare 1). Posizionare 10 sezioni radice su ogni vetrino, ottenendo da 3 a 5 repliche per ogni replica.
   NOTA: Questo passaggio descrive il numero di segmenti radice utilizzati per l'osservazione, facendo riferimento al numero di repliche tecniche per ciascuna replica. Il numero di segmenti radicali osservati per ciascun campione dovrebbe essere ragionevolmente organizzato in base alla specie vegetale e alla morfologia delle radici. Per le radici fini, è sufficiente osservare 30-50 segmenti radicali, ciascuno lungo 1 cm, per campione. Tuttavia, per radici più grandi, come quelle del mais, è necessario aumentare il numero di osservazioni in modo appropriato. Per garantire l'affidabilità dei risultati statistici, ogni trattamento dovrebbe avere almeno 3 repliche biologiche e ogni repliche biologiche dovrebbe essere operato seguendo il metodo sopra menzionato.
5. Coprire con un vetrino coprioggetti. Dopo aver posizionato il vetrino coprioggetti, evitare di spostare orizzontalmente i campioni per evitare sfregamenti o deformazioni delle radici. Ciò garantisce che lo stato normale della morfologia ifali possa essere osservato senza interferenze, mantenendo così l'accuratezza dei calcoli del tasso di colonizzazione.
6. Utilizzando un microscopio 200x, utilizzare il metodo del conteggio incrociato per determinare il tasso di colonizzazione con riferimento al diagramma schematico (Figura 2 supplementare).
   1. Installare un micrometro con mirino nell'oculare del microscopio. Spostare il campo visivo su un'estremità della radice e allineare uno dei mirini parallelamente alla radice. Osserva se l'altra linea si incrocia con le ife, gli arbuscoli o le vescicole.
   2. Spostare il campo visivo lungo la direzione della radice fino all'altra estremità, spostandosi ogni volta della stessa distanza in base alle coordinate del tavolino del microscopio. Registra le intersezioni in ciascun campo visivo utilizzando un approccio binario (0 o 1). Se l'altro mirino si interseca con ife, arbuscoli o vescicole AMF, viene registrato come 1 nella cella corrispondente della tabella. In caso contrario, viene registrato come 0. Se non ci sono intersezioni con nessuna delle strutture AMF, viene registrato come 1 nell'area negativa. Osservare 10 campi visivi per ogni segmento radicolare, per un totale di 100 osservazioni per vetrino, con un risultato da 300 a 500 osservazioni per campione di pianta.

4. Calcolo del tasso di colonizzazione

1. Sulla base del numero registrato di intersezioni con ife (H), arbuscoli (A) e vescicole (V) e non micorriziche (N) nelle 10 radici di ciascun vetrino (come mostrato nella Tabella 1), calcolare i tassi di colonizzazione come segue:
   
   Tasso di colonizzazione ifali = (A_H / A_T) × 100%
   Tasso di colonizzazione arbuscolare = (A_{, A} / A_{, T}) × 100%
   Tasso di colonizzazione vescicolare = (A_V / A_T) × 100%
   Tasso di colonizzazione totale = [(A_T - A_N) / A_T] × 100%
   
   Dove:
   A_H: Numero di intersezioni con ife
   A_A: Numero di intersezioni con arbuscoli
   A_V: Numero di intersezioni con vescicole
   A_T: Numero totale di incroci
   A_N: Numero di intersezioni con radici non micorriziche
   
   Questi calcoli forniscono i tassi di colonizzazione per ciascuna struttura (ife, arbuscoli e vescicole) e il tasso di colonizzazione complessivo, che è la somma dei tassi di colonizzazione per tutte le strutture.

Trattamento	Diapositiva	Numero di incroci
		Negativo	Ife	Arbuscoli	Vescicole	Totale
Campione 1	Diapositiva 1	AN1	AH1	AA 1	AV1	AT1
	Diapositiva 2	AN2	AH2	AA2	AV2	AT2
	Diapositiva 3	AN3	AH3	AA3	AV3	AT3
Totale		AN	AH	AA	AV	AT

Tabella 1: Tabella statistica dei tassi di colonizzazione dei funghi micorrizici arbuscolari. Abbreviazioni: A_H = Numero di intersezioni con ife; A_A = Numero di intersezioni con arbuscoli; A_V = Numero di intersezioni con vescicole; A_T = numero totale di intersezioni; A_N = Numero di intersezioni con radici non micorriziche.

Risultati

I risultati della colorazione delle radici delle piante invasive utilizzando questo metodo sono mostrati nella Figura 1. Le strutture (ife, arbuscoli, spore e vescicole) dell'AMF sono colorate di rosso, le cellule della corteccia radicolare sono colorate di rosso chiaro dopo la decolorazione e il cilindro centrale è colorato di rosso. Questo risultato di colorazione è sufficiente per distinguere le strutture fungine poiché l'AMF esiste principalmente nell...

Discussione

Le interazioni tra piante invasive e AMF sono complesse e diversificate. Lo studio di queste interazioni è fondamentale per comprendere il successo delle piante invasive e i loro effetti ecologici. Possono influenzare la capacità invasiva delle piante, la struttura e la funzione degli ecosistemi del suolo e la competitività delle piante autoctone. Il tasso di colonizzazione funge da indicatore importante per studiare la relazione tra piante invasive e AMF. Fornisce una misura quantita...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% Alcohol	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd	R433197
Acetic acid solution	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd	A116166
Acid fuchsin	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd	A104917
Formaldehyde solution, Formalin	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd	F111941
Glycerol	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd	G116203
Hydrochloric acid, HCl	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd	H399657
Lactic acid	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd	L432769
Manual System Microscope BX43	Olympus (China) co., Ltd
Potassium hydroxide, KOH	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd	P112284