マウスにおける白内障手術のモデリング

要約

この方法は、成体マウスから水晶体線維細胞を採取し、水晶体上皮細胞(LEC)が付着した莢膜バッグを残すことにより、 in vivo での白内障手術をモデル化します。その後、損傷反応は、分子的および形態学的基準を使用して、手術後のさまざまな時点で評価されます。

要約

白内障手術(CS)は、世界中の視覚障害の主な原因である白内障の有効な治療法です。しかし、CS は眼の炎症を引き起こし、長期的には、水晶体上皮細胞 (LEC) の術後の異常増殖と筋線維芽細胞および/または異常な線維細胞への変換によって引き起こされる後嚢混濁症 (PCO) および/または水晶体脱臼を引き起こす可能性があります。しかし、ほとんどの in vitro モデルではin vivoで見られるLECの創傷治癒応答を再現していないのに対し、ウサギなどの従来の白内障手術の動物モデルでは、遺伝子発現の遺伝子操作によるメカニズムの試験ができないため、CSが炎症やPCOを引き起こす分子メカニズムはまだ不明瞭です。最近、当研究室らは、遺伝子改変マウスを用いて、炎症誘発性シグナル伝達の誘導やLEC上皮から間葉系への移行を促進する分子機構の研究に成功し、PCOの病因に関する新たな知見につながっています。ここでは、マウスの白内障手術をモデル化するための確立されたプロトコルを報告します。これにより、RNAseqを介した水晶体線維細胞の除去に対するLECの応答の堅牢な転写プロファイリング、半定量的免疫蛍光法によるタンパク質発現の評価、および炎症のような急性後遺症の病因に関与すると仮定される遺伝子の機能をテストするための最新のマウス遺伝学ツールの使用と、その後のLECの筋線維芽細胞への変換に関与していると仮定されていますおよび/または異常なレンズファイバーセル。

概要

水晶体は高度に組織化された透明な組織であり、光を屈折させて網膜^1,2,3にはっきりと焦点を合わせた画像を生成します。この特殊な器官は、途切れることのない基底膜(カプセル)に囲まれており、水晶体を目の他の部分から隔離しています。カプセルの内側の前面は、水晶体上皮細胞(LEC)の単層を固定し、水晶体上皮細胞(LEC)は、水晶体赤道で水晶体線維細胞に分化し、水晶体^の大部分を構成する3。白内障は、老化、遺伝子変異、紫外線、酸化ストレス、眼の外傷などの要因により、水晶体が透明度を失ったときに^{発生します4。}白内障は、世界中で、特に医療が不十分な国では、失明の主な原因です⁵。しかし、この状態は現在、中央の水晶体包と付着した水晶体上皮を切除する水晶体超音波乳化吸引術による不透明な水晶体細胞の外科的除去によって容易に治療され、続いて振動プローブを使用して水晶体の細胞塊を吸引可能な小さな断片に分解します。赤道儀LECが取り付けられたカプセルバッグを置き去りにする¹.その後、最も一般的には、人工眼内レンズ(IOL)の術後移植によって視力が回復します。

白内障手術(CS)は白内障に対して非常に効果的で低侵襲な治療法ですが、眼の炎症^5,6,8の発症により、患者の術後の回復が急激に妨げられる可能性があります。この炎症は、術後の痛み、網膜浮腫を引き起こし、網膜剥離を引き起こすだけでなく、ブドウ膜炎や緑内障などの他の炎症性および線維性状態の悪化を引き起こす可能性があります4,7,8,9。CS 後の眼の炎症 (PCS) は、一般に抗炎症点眼薬で治療されますが、これは患者のコンプライアンスの低下や、飛蚊症の有病率の増加につながる可能性のある点眼薬なし白内障手術に悩まされています ^8,10,11。長期的には、後部被膜混濁症 (PCO) の発症により、CS の結果が損なわれる可能性があります¹²。PCOは、手術後に残された残留LECが創傷治癒反応を起こし、増殖し、数か月から数年で後レンズカプセルに移動するときに発生しますPCSは二次視覚閉塞に寄与します^13,14。

CS がこのような急性および慢性の反応を引き起こす分子メカニズムを理解することは、この分野で大きな課題であり、PCO を調査する文献の多くが、活性形質転換成長因子ベータ (TGFβ) ^12,15 による治療による培養中の筋線維芽細胞への LEC 変換の誘導に依存しています。in vitroで培養された死体レンズから作成されたヒトカプセルバッグモデルは、LECが天然の基底膜で培養されるため、レンズPCSの生物学をよりよく反映していますが、機構的に操作することは困難であり、眼内環境を再現せず、レンズ間(またはドナー間)の変動性により本質的に変動します^16,17。ウサギ^1,18および非ヒト霊長類^19,20の白内障手術のin vivoモデルは、これらの問題のいくつかを克服するが、それでも機構研究のために操作することは容易ではない。特に、哺乳類の水晶体再生に関する先行研究では、マウスから水晶体線維細胞を採取した後、4週間以内に有意な水晶体再生が見られ、水晶体上皮細胞と被膜が残されたが、水晶体全体を除去した場合、水晶体の再増殖は起こらなかった^21,22。その後、この手順を合理化し、水晶体線維細胞の除去に対するLECの急性応答と、その後の筋線維芽細胞と線維細胞特性を持つ細胞の混合集団への変換の研究に最適化しました。 

この白内障手術のマウスモデルを用いて、水晶体上皮細胞は、6時間PCSでトランスクリプトームを劇的に再構築して多数の炎症性サイトカインを産生することを示しました²³、一方、標準的なTGFβシグナル伝達の開始に先立つ24時間^PCS12,23という早い時期に線維性マーカーを発現し始めます。このモデルを用いたノックアウトマウスでの機構実験により、LECによる細胞フィブロネクチンの発現が持続的な線維性応答PCSに必要であることが明らかになったが、これはおそらく、線維性ECMの組み立てにおけるその役割と細胞シグナル伝達の両方によるものと思われる¹²。他の研究では、αVβ8-インテグリンはTGFβ活性化におけるその機能のためにLECの筋線維芽細胞への移行に必要であることが示され、このアプローチが抗PCO治療リードを特定する可能性が確認され^ました。

ここでは、白内障手術に対するLEC応答をモデル化するために、水晶体カプセルとLECを残しながら、生きたマウス(図1および図4)から水晶体繊維細胞を取り外す方法を説明する詳細なプロトコルを提供します。

プロトコル

以下のプロトコルは、デラウェア大学の動物管理・使用委員会によってプロトコル#1039-2021-1に基づいて承認されました。Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research²⁴ に準拠して、すべての眼サバイバル手術は片眼でしか行えません。このプロトコルで使用される試薬および機器の詳細については、 Table of Materials を参照してください。水晶体繊維の抽出と縫合のための代替アプローチを 図2と図3に示します。

1. 動物たち

1. この手順には、眼が無傷のレンズを持つ野生型または遺伝子組み換え実験用マウスを使用してください。
   1. C57BL/6マウスを出発点として用いると、その応答は形態学的レベルと分子レベルの両方で高い再現性を持つ^25,26。
      注:C57BL/6または任意のマウス系統を使用できます。ビデオプロトコルでは、FVBマウスを使用して、視覚的なデモンストレーションを改善します。
   2. 株が一致したコントロールを持つ他のマウス系統に対する変異体の応答の研究を実施します。
      注:練習を重ねると、この手順は、レンズカプセルが無傷で、レンズが重大な液状化を受けていない限り、レンズが白内障を持つマウスで実行できます。転写因子Sip1のレンズ条件付き欠失を有するマウスの研究を参照の^こと27。
2. この手術は、8週間の若いマウスから24か月^の25,26までの性別のマウスに行ってください。
   1. この手術は、さらに若いマウス(まぶたを開いた後)で練習しながら行いますが、これらの目はかなり小さくなるため、より困難になります。
   2. 高齢マウスの手術は、麻酔に対する耐性が低いため、特に注意が必要です^25,26。
      注:手術反応の性差は、高齢マウスでより一般的です²⁶。

2.溶液と手術器具の準備

1. 麻酔薬と鎮痛剤、拡張液、滅菌使い捨てメス、#5デュモン鉗子、2-110縫合鉗子、針(26 G 1/2および27 G 45°曲げディスペンシングチップ1インチ)、シリンジ、およびバランスの取れた生理食塩水(BSS)を入手してください。
2. オートクレーブで手術器具を滅菌します。

3. 麻酔前

1. 麻酔の前に、マウスに1%アトロピンと2.5%フェニレフリンをそれぞれ1滴ずつ投与して、手術を受けている眼の ?? 孔を拡張します( 図1Aを参照)。.手術を受けていない目に眼軟膏を塗布して、表面が乾燥しないようにします。
   注:眼科研究における動物の使用に関するARVOの声明²⁴ は、片方の眼のみが生存手術を受けることを認めており、もう一方の眼は手つかずのままにして、動物が視力を保持するようにしています。したがって、サバイバル手術は常に一方的なものです。ただし、反対側の未操作の眼は、犠牲の直前に手術して、動物に合わせた「タイムゼロ」コントロールを作成できます。
2. 目薬がマウスの顔を伝って鼻に入らないように注意してください。
3. 滅菌された26 G 1/2針を使用して、滅菌BSSでシリンジを準備します。シリンジに滅菌済みの27 G 45°曲げ鈍い1インチのディスペンスチップ(以下、ディスペンシングチップと呼びます)を取り付けます。

4.麻酔

1. 点眼薬に続いて、キシラジン/ケタミン/アセプロマジン(35 mg / kg、80 mg / kg、および0.5 mg / kg)溶液の腹腔内注射でマウスを麻酔します(図1B)。
   注:手術に必要な眼へのアクセスを可能にするために特殊なノーズコーンを利用できない限り、吸入麻酔は不可能かもしれません。

5. 切開を行う

1. マウスが完全に麻酔下に置かれると、つま先のつま先つまみ反射の欠如によって測定され、その瞳孔が完全に拡張(2 mm)すると(図4A)、マウスは手術の準備が整います。
   1. 麻酔をかけたマウスを複合解剖光学顕微鏡のステージに移動します。ヒーターパッドを使用して、マウスが適切な温度調節を行っていることを確認し、滅菌ドレープを使用してください。
   2. 解剖顕微鏡を使用して、10倍から20倍の倍率で眼球を観察します(詳細については 、材料の表 を参照)。
2. 滅菌外科用メスを使用して、角膜の中央に1〜1.5mmの切開を行います。切開部が角膜を通って伸び、前水晶体嚢を切開していることを確認します(図1C および 図4B)。

6. レンズファイバーをカプセルバッグから分離します

1. 滅菌BSSを含む分注チップでシリンジをつかみ、角膜の上にBSSを1滴静かに排出して表面を濡らし、さらに操作します。.
2. レンズファイバーの塊をレンズカプセルから分離します。
   1. 分注チップを中央の角膜切開部から水晶体嚢切開部に挿入し、針を円を描くようにゆっくりと動かし、BSSをゆっくりと放出して水頭上皮細胞と線維細胞の間の頂端-頂端結合を分離し(ハイドロ解剖)、最終的に水晶体線維塊を排出します(図1D)。
   2. ほとんどの場合、この手順では、ファイバーの塊が最終的にディスペンス チップに付着します (図 2A)。このような場合は、ディスペンシングチップを内側の目からそっと取り外してください。滅菌タオルでこのティッシュを取り除きます。すべてのレンズファイバーセルが除去されるまで繰り返します。
   3. あるいは、マイクロ鉗子(No.5 Dumont)を使用して水晶体核を抽出します(図2B)。この方法を使用する場合は、元の角膜切開部が核の直径を超えないように注意して、簡単に除去できるようにしてください。
3. レンズカプセルを滅菌BSSですすいで、残っている繊維をすべて取り除きます。
4. レンズカプセルが目の中に残っていることを確認します(図1E および 図4C)顕微鏡で半透明/ガラスのような外観を見る。

7.前房を膨らませ、角膜切開を縫合します

1. 切開部から前房にBSSを注入することにより、前房を通常の深さまで膨らませます。
   1. 目的のシグナル伝達経路の阻害剤または活性化因子をBSSに追加して、水晶体損傷応答におけるそれらの役割をテストします^12,15。
      注:動物は、手術後に房水バランスが再確立されるため、薬物代謝回転の薬物動態に応じて必要となる可能性のある経路阻害剤で全身的に治療することもできる¹⁵。
2. 角膜切開部を角結びで縫合し、10-0ナイロン糸とテーパー状の湾曲した5.3mm1/2c針を使用します(図1Fおよび図4D-F)。
   1. 切開部の中央部に1つの四角い結び目を縫うか、元の切開部の上半分と下半分の両方に2つの四角い結び目を縫います( 図3を参照)。ステッチの数は、角膜切開の長さによって異なります。
   2. 一度に両方の角膜フラップに穴を開けないでください。代わりに、利き手ではない手で鉗子を使用して角膜フラップを1つ保持し、針/ナイロンを押し込みます。角膜の片側に穴を開けたら、針/ナイロンを次の角膜フラップに押し込みます。角膜フラップをスクエアノットステッチで閉じます。

8. 術後ケア

注:局所抗生物質軟膏を眼に塗布し、鎮痛剤を投与します。マウスは通常、最初の手術後に苦痛の兆候を示しません。必要に応じて、ブプレノルフィンの徐放性バージョンを使用できます。.

1. この手術の直後に、次のサブステップを実行します。
   1. 縫合糸の真上に0.5%エリスロマイシン眼科用軟膏を1滴塗布します。.切開部全体が軟膏で覆われていることを確認してください。
   2. ブプレノルフィン(0.1 mg / kg)の腹腔内注射を投与します。.
2. マウスが加熱パッドに置かれたケージで麻酔から回復するのを待って、熱サポートを最適化します。
   注意: トラウマ、苦痛、または不快感の兆候がないか動物を監視します。いくつかの兆候には、手術部位での感染/引っかき傷、縫合糸の変位、毛皮の喪失などがあります。

9. 動物の回復のモニタリング

1. 手術後の動物の回復を、麻酔から目覚めるまで監視します。
2. 手術後最初の3日間は毎日マウスをチェックします。
   注:マウスは完全な治癒(2週間PCS)の前に犠牲にされるか、またはステッチが自然に抜け落ちるため、通常はステッチを取り除く必要はありません。
3. ブプレノルフィンは、手術後4〜8時間後の疼痛管理の必要に応じて、0.5 mg / kg(ゼリー中)の投与量または食事をしていない人の場合は0.1 mg / kgの投与量で経口投与します。.あるいは、手術の直前にブプレノルフィン徐放性を投与します。.
   注:可能であれば、先制的な鎮痛薬を利用すべきですが、これには鎮痛プロトコルの調整が必要な場合があり、これには施設の動物管理および使用委員会からの審査と承認が必要です。

10.安楽死

1. 手術後、希望の時間にマウスを安楽死させます
   1. 手術されていない眼を対照組織として使用して、手術された眼を切除しました。または、動物に麻酔をかけ直し、以前に手術を受けていなかった反対側の眼に水晶体線維細胞除去手術を行い、その後すぐに動物を犠牲にして(麻酔から目覚めさせることなく)、タイムゼロ操作制御を提供します。
   2. 迅速な解剖と組織採取を確実にします。
      注:LECは手術後数分以内にトランスクリプトームの変化を受けるため、手術に対する初期のLEC反応を研究する際には、迅速な組織採取と固定/凍結が必要です。

11. 採取した水晶体組織に対するさらなる分析の実施

1. 得られた組織を免疫染色、RNAシーケンシング、細胞培養、またはウェスタン解析12,15,23,25,26,28に使用します。フローサイトメトリーは理論的には可能です^が12、マウスの水晶体に含まれるLECの数が少ない(~40,000)²⁹ ことや、手術後にカプセルに関連する細胞残骸が存在することがこれを困難にしています。
2. 免疫染色
   1. ガスボンベからのCO₂ 吸入(4 L / min)により、マウスをチャンバー内で安楽死させます。マウスが意識を失ったら、流量を8〜10 L / minに増やし、呼吸が完全に停止するまでこの曝露を続け、さらに1分間。
      注:マウスは、動物の安楽死に関するAVMAガイドラインまたは施設動物管理および使用委員会が承認したガイドラインまたはポリシーに従って、適切な方法を使用して安楽死させることができます。
   2. 安楽死の二次的な方法、例えば、子宮頸部脱臼を採用することにより、適切な犠牲を確保します。
      注:ダンカンラボは、PCS 12,15,23の数分から数か月の範囲の時点を調査しました。
   3. マウスが人道的に犠牲になった後、分析のために手術した眼を分離します。
      1. 利き手ではない手でマイクロ鉗子を持ち、利き手でマイクロハサミを持ちながら、操作した目をつかみます。
      2. 視神経と目を固定している筋肉をやさしくクリップします。
         注:最近手術を受けた目とPCSの治癒に時間がかかった目の取り扱いには特に注意してください。最近手術を受けた目は、構造的に壊れやすいです。
   4. 解剖した眼をOCT培地に埋め込んで、後のクライオ切片、免疫染色、および半定量的共焦点顕微鏡^法28,30を行います。
3. RNAシーケンシング、細胞培養、またはウェスタンブロット解析のための関連細胞を含むカプセルバッグの単離
   1. ガスボンベからのCO₂ 吸入(4 L / min)により、マウスをチャンバー内で安楽死させます。マウスが意識を失ったら、流量を8〜10 L / minに増やし、呼吸が完全に停止するまでこの曝露を続け、さらに1分間。
   2. 安楽死の二次的な方法、例えば、子宮頸部脱臼を採用することにより、適切な犠牲を確保します。
   3. 早期の時点PCS(1〜2日以内)が必要な場合は、組織抽出前にステッチを取り除くか、角膜に別の切開を行ってレンズカプセルを抽出します。.
      注:後の時点でPCSでは、ステッチが抜け落ちている可能性が高いため、新しい切開が必要になります。
4. 半透明のレンズカプセルを見つけます。
   1. 角膜の開口部からマイクロ鉗子をそっと挿入し、カプセルをつかんで前房から取り出します。
   2. カプセルを1.5 mLの微量遠心チューブまたは培養皿に入れて、さらに分析します。

結果

この外科的方法の結果に基づいて、Duncan Labは、この白内障手術のマウスモデルを使用して、手術後の水晶体上皮細胞の損傷応答時間コースを構築しました(図5)。手術後6時間までに、水晶体上皮トランスクリプトームの5%が発現し(図6A)、これには多数の即時早期応答遺伝子および炎症誘発性サイトカインのアップレギュレ?...

ディスカッション

この手術技術には、高度なマウスの取り扱いと顕微手術のスキルが必要であり、開発するには練習が必要です。習得するのが最も難しいのは、傷を閉じるために角膜に細かい縫合糸を配置することです。実験者が縫合の全くの初心者であると仮定します。その場合は、まず紐と布を使って練習し、次に小さな果物に大径の縫合糸を使って練習に移り、手術用のスクエ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Erythryomycin opthalmic ointment USP	Baush Lomb	24208-910-55
1% Atropine sulfate ophthalmic solution	Amneal	60219-1748-2
1% Tropicamide opthalmic solution USP	Akorn	17478-102-12
10-0 Nylon suture	Ethicon	7707G
2.5% Phenylephrine hydrochloride ophtahlmic solution USP	Akorn	17478-200-12
26 G 1/2 Needles - straight	BD PrecisionGlide	5111
27 G 45° bent dispensing tip 1"	Harfington
Balanced saline solution	Phoenix	57319-555-06
Bupranorphine (0.1 mg/kg)	APP Pharmaceticals	401730D
Chlorhexidine solution
Needle holder 2-110	Duckworth & Kent	2-110-3E
Noyes scissors, straight	Fine Science Tools	12060-02
SMZ800 Nikon model microscope	Nikon
Sterile disposable scalpel No.11	Feather	2975#11
Tweezers #5 Dumont	Electron Microscopy Sciences	72700-D
Xylazine/Ketamine/Acepromazine (35 mg/kg, 80 mg/kg, 0.5 mg/kg) solution	APP Pharmaceticals	401730D