생쥐의 백내장 수술 모델링

요약

이 방법은 성체 마우스에서 수정체 섬유 세포를 제거하고 수정체 상피 세포(LEC)가 부착된 수정체 주머니를 남겨 생체 내 백내장 수술을 모델링합니다. 그런 다음 부상 반응은 분자 및 형태학적 기준을 사용하여 수술 후 여러 번 평가됩니다.

초록

백내장 수술(CS)은 전 세계적으로 시각 장애의 주요 원인인 백내장에 대한 효과적인 치료법입니다. 그러나 CS는 안구 염증을 유발하며, 장기적으로는 수술 후 수정체 상피 세포(LEC)의 과잉 증식과 근섬유아세포 및/또는 비정상적인 섬유 세포로의 전환으로 인한 수정체 탈구(PCO) 및/또는 수정체 탈구를 초래할 수 있습니다. 그러나 대부분의 in vitro 모델은 in vivo에서 볼 수 있는 LEC의 상처 치유 반응을 요약하지 않는 반면, 토끼와 같은 백내장 수술의 전통적인 동물 모델은 유전자 발현의 유전자 조작을 통해 메커니즘을 테스트할 수 없기 때문에 CS가 염증 및 PCO를 유발하는 분자 메커니즘은 여전히 모호합니다. 최근에는 본 연구실 등에서 유전자 변형 마우스를 이용하여 전염증성 신호전달 및 LEC 상피에서 중간엽으로의 전이를 유도하는 분자 메커니즘을 연구하는 데 성공하여 PCO 발병 기전에 대한 새로운 통찰력을 제공하고 있습니다. 여기에서는 RNAseq를 통한 렌즈 섬유 세포 제거에 대한 LEC의 반응에 대한 강력한 전사 프로파일링, 반정량적 면역형광에 의한 단백질 발현 평가, 염증과 같은 급성 후유증의 발병기전 및 LEC의 근섬유아세포로의 후속 전환에 관여하는 것으로 가정된 유전자의 기능을 테스트하기 위한 최신 마우스 유전학 도구의 사용을 허용하는 마우스의 백내장 수술을 모델링하기 위한 확립된 프로토콜에 대해 보고합니다 및/또는 비정상적인 렌즈 섬유 셀.

서문

수정체는 빛을 굴절시켜 망막 ^1,2,3에 명확하게 초점이 맞춰진 이미지를 생성하는 고도로 조직화된 투명한 조직입니다. 이 특수 기관은 수정체를 눈의 다른 부분과 격리하는 중단되지 않는 기저막(캡슐)으로 둘러싸여 있습니다. 캡슐의 안쪽 전방 표면은 수정체 상피 세포(LECs)의 단층을 고정하고, 이 단층은 수정체 적도에서 수정체의 대부분을 구성하는 렌즈 섬유 세포로 분화합니다³. 백내장은 노화, 유전적 돌연변이, 자외선, 산화 스트레스, 안구 외상과 같은 요인으로 인해 수정체가 투명도를 잃을 때 발생한다⁴. 백내장은 전 세계적으로 실명의 주요 원인이며, 특히 의료 서비스가 열악한 국가에서 그러하다⁵. 그러나 이 상태는 이제 수정체 캡슐과 부착된 수정체 상피를 제거하는 수정체 유화에 의해 불투명한 수정체 세포를 외과적으로 제거한 다음 진동 프로브를 사용하여 수정체의 세포 덩어리를 흡입할 수 있는 더 작은 조각으로 분해함으로써 쉽게 치료할 수 있습니다. 적도 LEC가 부착된 캡슐 백을 남기고¹. 시력은 수술 후 인공 인공 수정체(IOL)를 이식하여 가장 일반적으로 회복됩니다.

백내장 수술(CS)은 백내장에 대한 매우 효과적이고 최소 침습적인 치료법이지만, 안구 염증의 발병으로 인해 환자의 수술 후 회복이 급격히 저해될 수 있습니다 ^5,6,8. 이 염증은 수술 후 통증, 망막 박리로 이어지는 망막 부종, 포도막염 및 녹내장과 같은 다른 염증성 및 섬유성 상태의 악화를 유발할 수 있습니다 ^4,7,8,9. CS 후 안구 염증(PCS)은 일반적으로 항염증 점안액으로 치료하는데, 이는 환자 순응도가 낮거나 무적액 백내장 수술로 인해 부유물의 유병률이 증가할 수 있습니다 ^8,10,11. 장기적으로 CS의 결과는 PCO(posterior capsular oppacification)의 진행으로 인해 손상될 수 있습니다¹². PCO는 수술 후 남겨진 잔류 LEC가 상처 치유 반응을 겪고, 증식하고, 수개월에서 수년 PCS에 걸쳐 수정체 후낭으로 이동하여 이차성 시력 장애를 유발할 때 발생한다^13,14.

PCO를 조사하는 많은 문헌이 활성 형질전환 성장 인자 베타(TGFβ)^12,15를 사용한 처리를 통해 배양에서 LEC를 근섬유아세포로 전환하는 유도에 의존하기 때문에 CS가 이러한 급성 및 만성 반응을 일으키는 분자 메커니즘을 이해하는 것은 이 분야에서 중요한 과제입니다. 체외에서 배양된 사체 수정체로 만든 인간 수정체 백 모델은 LEC가 원래 기저막에서 배양되지만 기계적으로 조작하기 어렵고, 안구 내 환경을 재현하지 않으며, 렌즈 대 수정체(또는 공여체 대 기증자) 변동성으로 인해 본질적으로 가변적이기 때문에 수정체 PCS의 생물학을 더 잘 반영합니다^16,17. 토끼 ^1,18과 비인간 영장류^19,20의 백내장 수술 생체 내 모델은 이러한 문제 중 일부를 극복하지만 여전히 기계론적 연구를 위해 조작하기가 쉽지 않습니다. 특히, 포유류의 수정체 재생에 대한 선행 연구에서는 생쥐에서 수정체 섬유 세포를 제거한 후 4주 이내에 수정체 상피 세포와 캡슐을 남기고 상당한 수정체 재생이 이루어졌으며, 전체 수정체를 제거했을 때는 수정체 재생이 발생하지 않은 것으로 나타났습니다^21,22. 그 후 이 절차를 간소화하고 렌즈 섬유 세포 제거에 대한 LEC의 급성 반응 및 근섬유아세포 및 섬유 세포 특성을 가진 혼합 세포 집단으로의 후속 전환에 대한 연구를 위해 최적화했습니다. 

이 백내장 수술 마우스 모델을 사용하여, 수정체 상피 세포는 전사체를 6시간 PCS만큼 급격히 리모델링하여 수많은 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)²³을 생성하며, 표준 TGFβ 신호전달이 시작되기 전인 24시간 PCS^12,23부터 섬유화 마커를 발현하기 시작한다는 것을 보여주었습니다. 이 모델을 사용한 녹아웃 마우스에 대한 기계론적 실험은 LEC에 의한 세포 피브로넥틴 발현이 지속적인 섬유화 반응 PCS에 필요하다는 것을 밝혀냈으며, 이는 섬유화 ECM의 조립과 세포 신호 전달에서의 역할 때문에 가능할 수 있습니다¹². 다른 연구에서는 αVβ8-인테그린이 TGFβ 활성화에 대한 기능으로 인해 LEC에서 근섬유아세포로의 전환에 필요하다는 것을 보여주었으며, αVβ8-인테그린 길항제도 LEC EMT¹⁵를 차단함으로써 항-PCO 치료 리드를 식별할 수 있는 이 접근법의 잠재력이 확인되었습니다.

여기에서는 백내장 수술에 대한 LEC 반응을 모델링하기 위해 수정체 캡슐과 LEC를 남기고 살아있는 마우스에서 수정체 섬유 세포를 제거하는 방법(그림 1및 그림 4)을 설명하는 자세한 프로토콜을 제공합니다.

프로토콜

다음 프로토콜은 프로토콜 #1039-2021-1에 따라 델라웨어 대학교 기관 동물 보호 및 사용 위원회에서 승인했습니다. ARVO(Association for Research in Vision and Ophthalmology)에 따라 안과 및 시력 연구에서 동물 사용을 위한²⁴에 따라 모든 안구 생존 수술은 한쪽 눈에서만 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 시약 및 기기에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 렌즈 섬유를 추출하고 봉합하기 위한 대체 접근법이 그림 2와 그림 3에 나와 있습니다.

1. 동물

1. 이 절차에는 온전한 렌즈를 가진 눈을 가진 야생형 또는 유전자 변형 실험실 마우스 균주를 사용하십시오.
   1. C57BL/6 마우스를 시작점으로 사용하는데, 그 이유는 그들의 반응이 형태학적 및 분자 수준 모두에서 매우 재현성이 높기 때문이다^25,26.
      알림: C57BL/6 또는 모든 마우스 변형을 사용할 수 있습니다. 비디오 프로토콜에서 FVB 마우스는 더 나은 시각적 데모를 위해 사용됩니다.
   2. Strain-Matched Control을 사용하여 다른 마우스 균주에 대한 돌연변이의 반응에 대한 연구를 수행합니다.
      참고: 연습을 통해, 이 시술은 수정체 캡슐이 손상되지 않고 수정체가 상당한 액화를 겪지 않은 한 수정체에 백내장이 있는 마우스에 수행할 수 있습니다. 전사 인자 Sip1²⁷의 렌즈 조건부 결실이 있는 마우스에 대한 연구를 참조하십시오.
2. 이 수술을 8 주에서 24 개월까지 어린 성별의 쥐에게 수행하십시오^25,26.
   1. 연습을 통해 더 어린 쥐(눈꺼풀을 연 후)에서 이 수술을 수행하지만 이 눈은 훨씬 더 작기 때문에 더 어려울 것입니다.
   2. 마취에 대한 내성이 낮기 때문에 노인 쥐에 대한 수술에 특히 주의하십시오^25,26.
      참고: 수술 반응의 성별 차이는 노령 마우스에서 더 두드러진다²⁶.

2. 용액 및 수술 도구 준비

1. 마취 및 진통제, 확장 점안액, 멸균 일회용 메스, #5 Dumont 겸자, 2-110 봉합사 겸자, 바늘(26 G 1/2 및 27 G 45° 구부러진 디스펜싱 팁 1"), 주사기 및 식염수(BSS)를 구합니다.
2. 오토클레이브에서 수술 기구를 멸균합니다.

3. 마취 전

1. 마취하기 전에 마우스에 1% 아트로핀과 2.5% 페닐에프린을 각각 한 방울씩 떨어뜨려 수술을 받는 눈의 동공( 그림 1A 참조)을 확장합니다. 수술하지 않은 눈에 안과 연고를 바르면 표면이 건조해지지 않습니다.
   참고: 안과 연구²⁴ 에서 동물 사용에 관한 ARVO 성명은 한쪽 눈만 생존 수술을 받을 수 있도록 허용하고 다른 눈은 그대로 두어 동물이 시력을 유지할 수 있도록 합니다. 따라서 생존 수술은 항상 편측적이다. 그러나 수술하지 않은 반대쪽 눈은 희생 직전에 수술을 하여 동물과 일치하는 '타임 제로' 제어 장치를 만들 수 있습니다.
2. 안약이 쥐의 얼굴을 타고 흘러내려 코로 들어가지 않도록 주의하십시오., 호흡을 방해할 수 있습니다.
3. 멸균 26G 1/2 바늘을 사용하여 멸균 BSS가 있는 주사기를 준비합니다. 1인치의 멸균 27G 45° 구부러진 뭉툭한 디스펜싱 팁(이하 디스펜싱 팁이라고 함)에 주사기를 끼웁니다.

4. 마취

1. 점안액 후 자일라진/케타민/아세프로마진(35mg/kg, 80mg/kg, 0.5mg/kg) 용액을 복강내 주사하여 마우스를 마취합니다(그림 1B).
   참고: 흡입 마취는 수술에 필요한 눈에 접근할 수 있도록 특수 코뿔을 사용할 수 없는 한 불가능할 수 있습니다.

5. 절개

1. 발가락 꼬집기 반사의 결핍으로 측정된 바와 같이 마우스가 완전히 마취되고 동공이 완전히 확장되면(그림 4A) 마우스는 수술 준비가 된 것입니다.
   1. 마취된 쥐를 화합물 해부 광학 현미경의 스테이지로 이동합니다. 히터 패드를 사용하여 마우스의 온도 조절이 적절한지 확인하고 멸균 드레이프를 사용하십시오.
   2. 해부 현미경을 사용하여 10x-20x 배율로 눈을 봅니다(자세한 내용은 재료 표 참조).
2. 멸균 수술용 메스를 사용하여 각막 중앙을 1-1.5mm 절개합니다. 절개 부위가 각막을 통해 확장되고 수정체 전방 캡슐을 절개하는지 확인합니다(그림 1C 및 그림 4B).

6. 수정체 백에서 렌즈 섬유를 분리합니다.

1. 멸균 BSS가 들어 있는 디스펜싱 팁으로 주사기를 잡고 각막 위로 BSS 1방울을 부드럽게 배출하여 추가 조작을 위해 표면을 적십니다.
2. 렌즈 캡슐에서 렌즈 섬유 질량을 분리합니다.
   1. 중앙 각막 절개 부위를 통해 수정체 캡슐 절개 부위에 분주 팁을 삽입한 다음 바늘을 원을 그리며 부드럽게 움직이면서 BSS를 천천히 방출하여 수정체 상피와 섬유 세포 사이의 정점 연결을 분리하고(수류 박리) 궁극적으로 수정체 섬유 덩어리를 배출합니다(그림 1D).
   2. 대부분의 경우 섬유 덩어리는 결국 이 절차 동안 디스펜싱 팁에 부착됩니다(그림 2A). 이 경우 안쪽 눈에서 디스펜싱 팁을 부드럽게 제거하십시오. 그리고 멸균 수건으로 청소하여 이 조직을 제거하십시오. 모든 렌즈 섬유 셀이 제거될 때까지 반복합니다.
   3. 또는 마이크로 겸자(번호 5 Dumont)를 사용하여 수정체 핵을 추출합니다(그림 2B). 이 방법을 사용하는 경우 쉽게 제거할 수 있도록 원래 각막 절개가 핵의 직경을 초과하도록 주의하십시오.
3. 렌즈 캡슐을 멸균 BSS로 헹구어 남아 있는 섬유를 제거합니다.
4. 현미경을 통해 렌즈 캡슐이 눈 안에 남아 있는지 확인합니다(그림 1E 및 그림 4C).

7. 전방 팽창 및 각막 절개 부위 봉합

1. 절개 부위를 통해 전방으로 BSS를 주입하여 전방을 정상 깊이로 팽창시킵니다.
   1. 렌즈 손상 반응에서 그들의 역할을 테스트하기 위해 BSS에 관심 신호전달 경로의 억제제 또는 활성제를 추가한다^12,15.
      참고: 동물은 경로 억제제(pathway inhibitors)를 사용하여 전신적으로 치료할 수도 있으며, 이는 수술 후 수액 균형이 다시 확립됨에 따라 약물 회전율의 약동학에 따라 필요할 수 있다¹⁵.
2. 가늘어지고 구부러진 5.3mm 1/2c 바늘(그림 1F 및 그림 4D-F)이 있는 10-0 나일론 실을 사용하여 각막 절개 부위를 정사각형 매듭으로 봉합합니다.
   1. 절개 부위의 중앙 부분에 하나의 사각 매듭 스티치를 놓거나 원래 절개 부위의 위쪽 절반과 아래쪽 절반에 두 개의 사각 매듭 스티치를 놓습니다( 그림 3 참조). 바늘 갯수는 각막 절개 부위의 길이에 따라 다릅니다.
   2. 한 번에 양쪽 각막 피판에 구멍을 뚫지 마십시오. 대신, 자주 사용하지 않는 손에 집게를 사용하여 한쪽 각막 피판을 잡고 바늘/나일론을 밀어 넣습니다. 각막의 한쪽에 구멍이 뚫리면 바늘/나일론을 다음 각막 플랩을 통해 밀어 넣습니다. 사각 매듭 스티치를 사용하여 각막 피판을 닫습니다.

8. 수술 후 관리

주의: 국소 항생제 연고를 눈에 바르고 진통제를 투여합니다. 생쥐는 일반적으로 초기 수술 후 고통의 징후를 보이지 않습니다. 필요한 경우 부프레노르핀의 서방형 버전을 사용할 수 있습니다.

1. 이 수술 직후 다음 하위 단계를 수행하십시오.
   1. 0.5% 에리스로마이신 안과 연고 한 방울을 봉합사 바로 위에 바릅니다. 절개 부위 전체가 연고로 덮여 있는지 확인하십시오.
   2. 부프레노르핀(0.1mg/kg)의 복강내 주사를 투여합니다.
2. 열 지원을 최적화하기 위해 가열 패드에 놓인 케이지에서 마우스가 마취에서 회복되도록 합니다.
   알림: 외상, 고통 또는 불편함의 징후가 있는지 동물을 모니터링하십시오. 일부 징후에는 수술 부위의 감염/긁힘, 변위된 봉합사, 털 손실 등이 포함됩니다.

9. 동물 회수 모니터링

1. 수술 후 동물이 마취에서 깨어날 때까지 동물의 회복을 모니터링합니다.
2. 수술 후 처음 3일 동안은 매일 쥐를 검사하십시오.
   참고 : 마우스는 완전히 치유 (2 주 PCS) 전에 희생되거나 바늘이 자발적으로 빠지기 때문에 일반적으로 바늘을 제거 할 필요가 없습니다.
3. 수술 후 4-8시간 후 통증 관리를 위해 필요에 따라 0.5mg/kg(젤로) 또는 먹지 않는 경우 0.1mg/kg의 용량으로 부프레노르핀을 경구 투여합니다. 또는 수술 직전에 부프레노르핀 서방형을 투여하십시오.
   참고: 가능한 경우 선제적 진통제를 사용해야 하지만, 이를 위해서는 기관 동물 보호 및 사용 위원회의 검토 및 승인이 필요한 진통제 프로토콜에 대한 조정이 필요할 수 있습니다.

10. 안락사

1. 수술 후 원하는 시간에 쥐를 안락사시킵니다.
   1. 수술되지 않은 눈을 대조 조직으로 사용하여 수술한 눈을 제거했습니다. 또는 동물을 다시 마취하고, 이전에 수술하지 않은 반대쪽 눈에 수정체 섬유 세포 제거 수술을 수행한 다음, 즉시 동물을 희생하여(마취에서 깨어나지 못하게) 시간 제로 작동 제어를 제공합니다.
   2. 빠른 해부 및 조직 채취를 보장합니다.
      참고: LEC는 수술 후 몇 분 이내에 전사체 변화를 겪기 때문에 수술에 대한 초기 LEC 반응을 연구할 때 빠른 조직 채취 및 고정/동결이 필요합니다.

11. 채취한 수정체 조직에 대한 추가 분석 수행

1. 얻은 조직을 면역염색, RNA 시퀀싱, 세포 배양 또는 서양 분석에 사용합니다 12,15,23,25,26,28. 유세포 분석은 이론적으로도 가능하지만¹² 마우스 수정체의 LEC 수가 적고(~40,000)²⁹ 수술 후 캡슐 관련 세포 파편이 존재하기 때문에 이것이 어렵습니다.
2. 면역염색
   1. 가스 실린더에서 CO₂ 흡입(4L/min)을 통해 챔버에서 쥐를 안락사시킵니다. 마우스가 의식을 잃으면 유속을 8-10L/min으로 높이고 호흡이 완전히 멈출 때까지 1분 동안 이 노출을 계속합니다.
      참고: 마우스는 동물 안락사에 대한 AVMA 지침 또는 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인한 지침 또는 정책에 따라 적절한 방법을 사용하여 안락사시킬 수 있습니다.
   2. 자궁경부 탈구와 같은 2차 안락사 방법을 사용하여 적절한 희생을 보장합니다.
      참고: Duncan 연구소는 분에서 월까지의 시점을 조사했습니다. PCS 12,15,23.
   3. 쥐를 인도적으로 희생시킨 후에는 분석을 위해 수술한 눈을 분리합니다.
      1. 주로 사용하지 않는 손에 마이크로 집게를 잡고 주로 사용하는 손에 마이크로 가위를 잡고 수술한 눈을 잡습니다.
      2. 눈을 고정하는 시신경과 근육을 부드럽게 클립합니다.
         참고: PCS를 치유하는 데 오랜 시간이 걸린 눈과 비교하여 최근에 수술을 받은 눈을 특히 주의하십시오. 최근에 수술한 눈은 구조적으로 더 약합니다.
   4. 나중에 동결 절편, 면역 염색 및 반정량 컨포칼 현미경을 위해 절개된 눈을 OCT 매체에 삽입합니다^28,30.
3. RNA 염기서열분석, 세포 배양 또는 웨스턴 블롯 분석을 위한 관련 세포와 캡슐 백의 분리
   1. 가스 실린더에서 CO₂ 흡입(4L/min)을 통해 챔버에서 쥐를 안락사시킵니다. 마우스가 의식을 잃으면 유속을 8-10L/min으로 높이고 호흡이 완전히 멈출 때까지 1분 동안 이 노출을 계속합니다.
   2. 자궁경부 탈구와 같은 2차 안락사 방법을 사용하여 적절한 희생을 보장합니다.
   3. 이른 시점 PCS(1-2일 이내)가 필요한 경우 조직 추출 전에 실밥을 제거하거나 수정체 캡슐을 추출하기 위해 각막을 다시 절개하십시오.
      참고: 나중에 PCS가 되면 실밥이 빠졌을 가능성이 높으므로 새로운 절개가 필요합니다.
4. 반투명 렌즈 캡슐을 찾습니다.
   1. 각막 입구를 통해 마이크로 겸자를 부드럽게 삽입하고 캡슐을 잡고 전방에서 제거합니다.
   2. 추가 분석을 위해 캡슐을 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브 또는 배양 접시에 넣습니다.

결과

이 수술 방법의 결과를 바탕으로 Duncan Lab은 백내장 수술의 마우스 모델을 사용하여 수술 후 수정체 상피 세포의 부상 반응 시간 과정을 구성했습니다(그림 5). 수술 후 6시간이 지나면 수정체 상피 전사체의 5%가 차등적으로 발현되며(그림 6A), 여기에는 수많은 즉각적인 조기 반응 유전자와 전염증성 사이토카인의 상향 조절이 ?...

토론

이 수술 기법은 고급 마우스 조작 및 미세 수술 기술을 필요로 하며, 이를 개발하기 위해서는 연습이 필요합니다. 가장 숙달하기 어려운 것은 상처를 봉합하기 위해 각막에 미세한 봉합사를 배치하는 것입니다. 실험자가 봉합에 대한 완전한 초보자라고 가정합니다. 이 경우 먼저 끈과 천을 사용하여 연습 한 다음 작은 과일에 대구경 봉합사를 사용하여 수술 용 사각형 매?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Erythryomycin opthalmic ointment USP	Baush Lomb	24208-910-55
1% Atropine sulfate ophthalmic solution	Amneal	60219-1748-2
1% Tropicamide opthalmic solution USP	Akorn	17478-102-12
10-0 Nylon suture	Ethicon	7707G
2.5% Phenylephrine hydrochloride ophtahlmic solution USP	Akorn	17478-200-12
26 G 1/2 Needles - straight	BD PrecisionGlide	5111
27 G 45° bent dispensing tip 1"	Harfington
Balanced saline solution	Phoenix	57319-555-06
Bupranorphine (0.1 mg/kg)	APP Pharmaceticals	401730D
Chlorhexidine solution
Needle holder 2-110	Duckworth & Kent	2-110-3E
Noyes scissors, straight	Fine Science Tools	12060-02
SMZ800 Nikon model microscope	Nikon
Sterile disposable scalpel No.11	Feather	2975#11
Tweezers #5 Dumont	Electron Microscopy Sciences	72700-D
Xylazine/Ketamine/Acepromazine (35 mg/kg, 80 mg/kg, 0.5 mg/kg) solution	APP Pharmaceticals	401730D