Modellierung der Kataraktchirurgie bei Mäusen

Zusammenfassung

Diese Methode modelliert die Kataraktchirurgie in vivo , indem Linsenfaserzellen von adulten Mäusen entnommen und der Kapselsack mit angehängten Linsenepithelzellen (LECs) zurückgelassen wird. Das Verletzungsansprechen wird dann zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Operation anhand molekularer und morphologischer Kriterien beurteilt.

Zusammenfassung

Die Kataraktchirurgie (CS) ist eine wirksame Behandlung des Grauen Stars, einer der Hauptursachen für Sehbehinderungen weltweit. CS führt jedoch zu Augenentzündungen und kann langfristig zu einer posterioren Kapseltrübung (PCO) und/oder Linsenluxation führen, die durch das postoperative Überwachsen von Linsenepithelzellen (LECs) und deren Umwandlung in Myofibroblasten und/oder aberrante Faserzellen verursacht wird. Die molekularen Mechanismen, durch die CS zu Entzündungen und PCO führt, sind jedoch noch unklar, da die meisten In-vitro-Modelle die Wundheilungsreaktion von LECs in vivo nicht rekapitulieren, während traditionelle Tiermodelle der Kataraktchirurgie, wie z. B. Kaninchen, die genetische Manipulation der Genexpression nicht zulassen, um Mechanismen zu testen. In jüngster Zeit haben unser Labor und andere erfolgreich genetisch veränderte Mäuse eingesetzt, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die die Induktion der proinflammatorischen Signalübertragung und den Übergang von LEC vom Epithel zum Mesenchym steuern, was zu neuen Erkenntnissen über die PCO-Pathogenese führt. In dieser Arbeit berichten wir über das etablierte Protokoll zur Modellierung der Kataraktchirurgie in Mäusen, das ein robustes transkriptionelles Profiling der Reaktion von LECs auf die Entfernung von Linsenfaserzellen mittels RNAseq, die Bewertung der Proteinexpression durch semiquantitative Immunfluoreszenz und die Verwendung moderner genetischer Werkzeuge der Maus ermöglicht, um die Funktion von Genen zu testen, von denen angenommen wird, dass sie an der Pathogenese akuter Folgeerkrankungen wie Entzündungen sowie der späteren Umwandlung von LECs in Myofibroblasten beteiligt sind und/oder abweichende Linsenfaserzellen.

Einleitung

Die Linse ist ein hochorganisiertes, transparentes Gewebe, das Licht bricht, um ein klar fokussiertes Bild auf der Netzhaut zu erzeugen ^1,2,3. Dieses spezialisierte Organ ist von einer ununterbrochenen Basalmembran (der Kapsel) umgeben, die die Linse von anderen Teilen des Auges isoliert. Die innere vordere Oberfläche der Kapsel verankert eine Monoschicht aus Linsenepithelzellen (LECs), die sich dann am Linsenäquator in Linsenfaserzellen differenzieren, die den überwiegenden Teil der Linse^{ausmachen 3}. Ein Grauer Star tritt auf, wenn die Linse aufgrund von Faktoren wie Alterung, genetischer Mutation, UV-Strahlung, oxidativem Stress und Augentrauma ihre Transparenz verliert⁴. Der Graue Star ist weltweit eine der Hauptursachen für Erblindung, insbesondere in Ländern mit schlechter medizinischer Versorgung⁵. Dieser Zustand kann jedoch jetzt leicht durch chirurgische Entfernung von undurchsichtigen Linsenzellen durch Phakoemulsifikation behandelt werden, bei der die zentrale Linsenkapsel und das daran befestigte Linsenepithel entfernt werden, gefolgt von der Verwendung einer vibrierenden Sonde, um die Zellmasse der Linse in kleinere Fragmente zu zerlegen, die abgesaugt werden können; Zurück blieb ein Kapselsack mit einigen angehängten äquatorialen LECs^{zurück 1}. Die Wiederherstellung des Sehvermögens erfolgt dann in der Regel durch die postoperative Implantation einer künstlichen Intraokularlinse (IOL).

Während die Kataraktchirurgie (CS) eine hochwirksame und minimalinvasive Behandlung des Grauen Stars ist, kann die postoperative Genesung eines Patienten durch die Entwicklung einer Augenentzündung akut behindert werden ^5,6,8. Diese Entzündung kann postoperative Schmerzen, Netzhautödeme, die zu einer Netzhautablösung führen, sowie eine Verschlimmerung anderer entzündlicher und fibrotischer Erkrankungen wie Uveitis und Glaukom verursachen 4,7,8,9. Augenentzündungen nach CS (PCS) werden im Allgemeinen mit entzündungshemmenden Augentropfen behandelt, die durch eine schlechte Compliance der Patienten oder eine tropfenlose Kataraktoperation geplagt werden, die zu einer erhöhten Prävalenz von Floatern führen kann ^8,10,11. Langfristig können die Ergebnisse der CS durch die Entwicklung einer posterioren Kapseltrübung (PCO) beeinträchtigt ^werden12. PCO tritt auf, wenn verbleibende LECs, die nach der Operation zurückbleiben, eine Wundheilungsreaktion durchlaufen, sich vermehren und nach Monaten bis Jahren in die hintere Linsenkapsel wandern, was zu einer sekundären Sehobstruktion beiträgt^13,14.

Das Verständnis der molekularen Mechanismen, durch die CS zu solchen akuten und chronischen Reaktionen führt, stellt eine große Herausforderung auf diesem Gebiet dar, da ein Großteil der Literatur, die PCO untersucht, auf der Induktion der LEC-Umwandlung in Myofibroblasten in Kultur durch Behandlung mit dem aktiv transformierenden Wachstumsfaktor beta (TGFβ) ^beruht12,15. Menschliche Kapselbeutelmodelle, die aus in vitro kultivierten Leichenlinsen hergestellt wurden, spiegeln die Biologie der Linsen-PCS besser wider, da LECs auf ihrer nativen Basalmembran kultiviert werden, aber schwer mechanistisch zu manipulieren sind, die intraokulare Umgebung nicht rekapitulieren und aufgrund der Variabilität von Linse zu Linse (oder von Spender zu Spender) inhärent variabel sind^16,17. Kaninchen ^1,18 und nicht-menschliche Primaten^19,20 In-vivo-Modelle der Kataraktchirurgie überwinden einige dieser Probleme, sind aber für mechanistische Studien immer noch nicht leicht zu manipulieren. Bemerkenswert ist, dass eine frühere Studie zur Linsenregeneration von Säugetieren innerhalb von vier Wochen nach der Entnahme von Linsenfaserzellen von Mäusen eine signifikante Linsenregeneration ergab, wobei die Linsenepithelzellen und die Kapsel zurückblieben, während kein Nachwachsen der Linsen auftrat, wenn die gesamte Linse entfernt wurde^21,22. Anschließend haben wir dieses Verfahren gestrafft und für die Untersuchung der akuten Reaktion von LECs auf die Entfernung von Linsenfaserzellen und deren anschließende Umwandlung in eine gemischte Population von Zellen mit Myofibroblasten- und Faserzelleigenschaften optimiert. 

Anhand dieses Mausmodells der Kataraktchirurgie haben wir gezeigt, dass Linsenepithelzellen ihr Transkriptom drastisch um 6 Stunden PCS umgestalten, um zahlreiche proinflammatorische Zytokine^{zu produzieren 23}, während sie bereits 24 h PCS^12,23 beginnen, fibrotische Marker zu exprimieren, bevor die kanonische TGFβ-Signalgebung einsetzt. Mechanistische Experimente an Knockout-Mäusen mit diesem Modell zeigten, dass die zelluläre Fibronektinexpression durch LECs für eine anhaltende fibrotische Reaktion auf PCS erforderlich ist, wahrscheinlich aufgrund seiner Rolle bei der Assemblierung der fibrotischen EZM und der Zellsignalisierung¹². Andere Studien zeigten, dass αVβ8-Integrin aufgrund seiner Funktion bei der TGFβ-Aktivierung für den Übergang von LECs zu Myofibroblasten erforderlich ist, und das Potenzial dieses Ansatzes zur Identifizierung von Anti-PCO-Therapien wurde bestätigt, da ein αVβ8-Integrin-Antagonist auch LEC EMT¹⁵ blockierte.

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, das beschreibt, wie die Linsenfaserzellen von lebenden Mäusen entfernt werden (Abbildung 1und Abbildung 4), während die Linsenkapsel und die LECs zurückbleiben, um die LEC-Reaktion auf eine Kataraktoperation zu modellieren.

Protokoll

Das folgende Protokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Delaware unter Protokoll #1039-2021-1 genehmigt. In Übereinstimmung mit der Vereinigung für Forschung im Sehen und in der Ophthalmologie (ARVO) für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung²⁴ können alle Operationen zum Überleben des Auges nur an einem Auge durchgeführt werden. In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu den in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien und Instrumenten. Alternative Ansätze für die Extraktion der Linsenfasern und das Nähen sind in Abbildung 2 und Abbildung 3 dargestellt.

1. Tiere

1. Verwenden Sie für dieses Verfahren einen Wildtyp- oder genetisch veränderten Labormausstamm, der Augen mit intakten Linsen hat.
   1. Nehmen Sie C57BL/6-Mäuse als Ausgangspunkt, da ihre Reaktionen sowohl auf morphologischer als auch auf molekularer Ebene hochgradig reproduzierbar sind^25,26.
      HINWEIS: Es kann C57BL/6 oder eine beliebige Mausvariante verwendet werden. Im Videoprotokoll wird die FVB-Maus zur besseren visuellen Demonstration verwendet.
   2. Durchführung von Studien zur Reaktion von Mutanten auf andere Mausstämme mit stammangepassten Kontrollen.
      HINWEIS: Mit zunehmender Praxis kann dieses Verfahren bei Mäusen durchgeführt werden, deren Linsen Katarakte aufweisen, solange die Linsenkapsel intakt ist und sich die Linse nicht signifikant verflüssigt hat. Siehe die Studie an Mäusen mit linsenbedingter Deletion des Transkriptionsfaktors Sip1²⁷.
2. Führen Sie diese Operation an Mäusen beiderlei Geschlechts im Alter von 8 Wochen bis zu einem Alter von 24 Monaten^{durch 25,26}.
   1. Führen Sie diese Operation bei noch jüngeren Mäusen (nach dem Öffnen der Augenlider) mit Übung durch, obwohl es schwieriger sein wird, da diese Augen deutlich kleiner sind.
   2. Besondere Vorsicht ist bei Operationen an älteren Mäusen geboten, da diese eine geringere Verträglichkeit für eine Anästhesie^{aufweisen 25,26}.
      HINWEIS: Geschlechtsunterschiede in den Reaktionen auf Operationen sind bei älteren Mäusen häufiger²⁶.

2. Vorbereitung von Lösungen und chirurgischen Instrumenten

1. Besorgen Sie sich Anästhesie- und Analgetika, Dilatationstropfen, steriles Einwegskalpell, #5 Dumont Pinzetten, 2-110 Nahtzangen, Nadeln (26 G 1/2 und 27 G 45° gebogene Abgabespitze 1"), Spritzen und balancierte Kochsalzlösung (BSS).
2. Sterilisieren Sie chirurgische Instrumente im Autoklaven.

3. Vor der Anästhesie

1. Geben Sie der Maus vor der Anästhesie je einen Tropfen 1 % Atropin und 2,5 % Phenylephrin, um die Pupille (siehe Abbildung 1A) des zu operierenden Auges zu erweitern. Tragen Sie eine Augensalbe auf das nicht operierte Auge auf, um die Oberfläche vor dem Austrocknen zu bewahren.
   HINWEIS: Die ARVO-Erklärung über die Verwendung von Tieren in der Augenforschung²⁴ erlaubt es nur, dass ein einzelnes Auge einer Überlebensoperation unterzogen wird, während das andere Auge unberührt bleibt, damit das Tier das Sehvermögen behält. Überlebensoperationen sind also immer einseitig; Das kontralaterale, nicht operierte Auge kann jedoch kurz vor der Tötung operiert werden, um tiergerechte "Zeit Null"-Kontrollen zu schaffen.
2. Achten Sie darauf, dass die Augentropfen nicht über das Gesicht der Maus laufen und in die Nase gelangen, da dies die Atmung behindern kann.
3. Bereiten Sie eine Spritze mit sterilem BSS mit einer sterilen 26 G 1/2 Nadel vor. Setzen Sie die Spritze mit einer sterilen 27 G 45° gebogenen, stumpfen Abgabespitze von 1 Zoll (unten als Abgabespitze bezeichnet) ein.

4. Anästhesie

1. Nach der Einnahme von Augentropfen wird die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von Xylazin/Ketamin/Acepromazin (35 mg/kg, 80 mg/kg und 0,5 mg/kg) anästhesiert (Abbildung 1B).
   HINWEIS: Eine Inhalationsanästhesie ist möglicherweise nicht möglich, es sei denn, es kann ein spezieller Nasenkonus verwendet werden, um den für die Operation erforderlichen Zugang zum Auge zu ermöglichen.

5. Den Schnitt machen

1. Sobald die Maus vollständig unter Narkose steht, gemessen am fehlenden Zehenklemmreflex, und ihre Pupille sich vollständig erweitert hat (2 mm) (Abbildung 4A), ist die Maus bereit für die Operation.
   1. Bewegen Sie die anästhesierte Maus auf die Bühne eines zusammengesetzten Präparierlichtmikroskops. Verwenden Sie ein Heizkissen, um sicherzustellen, dass die Maus eine ausreichende Wärmeregulierung hat, und verwenden Sie sterile Vorhänge.
   2. Betrachten Sie das Auge unter 10- bis 20-facher Vergrößerung mit einem Präpariermikroskop (Einzelheiten finden Sie in der Materialtabelle ).
2. Machen Sie mit einem sterilen chirurgischen Skalpell einen 1-1,5 mm großen Schnitt in der Mitte der Hornhaut. Stellen Sie sicher, dass sich der Schnitt durch die Hornhaut erstreckt und die vordere Linsenkapsel einschneidet (Abbildung 1C und Abbildung 4B).

6. Trennen der Linsenfasern vom Kapselsack

1. Fassen Sie die Spritze mit einer Abgabespitze, die steriles BSS enthält, und stoßen Sie vorsichtig 1 Tropfen BSS über der Hornhaut aus, um die Oberfläche für die weitere Manipulation zu befeuchten.
2. Trennen Sie die Masse der Linsenfaser von der Linsenkapsel.
   1. Führen Sie die Dosierspitze durch den zentralen Hornhautschnitt in den Schnitt der Linsenkapsel ein und bewegen Sie die Nadel vorsichtig in kreisenden Bewegungen, während Sie langsam BSS freisetzen, um apikal-apikale Verbindungen zwischen Linsenepithel und Faserzellen zu trennen (Hydrodissektion) und schließlich die Linsenfasermasse auszustoßen (Abbildung 1D).
   2. In den meisten Fällen haftet die Fasermasse während dieses Verfahrens schließlich an der Dosierspitze (Abbildung 2A). Entfernen Sie in diesem Fall vorsichtig die Dosierspitze von der Innenauge; und reinigen Sie es mit einem sterilen Handtuch, um dieses Tuch zu entfernen. Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Linsenfaserzellen entfernt sind.
   3. Alternativ können Sie eine Mikrozange (Nummer 5 Dumont) verwenden, um den Linsenkern zu extrahieren (Abbildung 2B). Achten Sie bei dieser Methode darauf, dass der ursprüngliche Hornhautschnitt den Durchmesser des Zellkerns überschreitet, um eine einfache Entfernung zu gewährleisten.
3. Spülen Sie die Linsenkapsel mit sterilem BSS aus, um alle verbleibenden Fasern zu entfernen.
4. Vergewissern Sie sich, dass sich die Linsenkapsel im Auge befindet (Abbildung 1E und Abbildung 4C), indem Sie ihr durchscheinendes/glasartiges Aussehen durch das Mikroskop betrachten.

7. Aufblasen der Vorderkammer und Vernähen des Hornhautschnitts

1. Blasen Sie die Vorderkammer auf ihre normale Tiefe auf, indem Sie BSS durch den Schnitt in die Vorderkammer injizieren.
   1. Fügen Sie dem BSS Inhibitoren oder Aktivatoren von Signalwegen von Interesse hinzu, um ihre Rolle bei der Reaktion auf Linsenverletzungen zu testen^12,15.
      HINWEIS: Tiere können auch systemisch mit Signalweghemmern behandelt werden, die je nach Pharmakokinetik des Arzneimittelumsatzes erforderlich sein können, wenn das Gleichgewicht des Kammerwassers nach der Operation wiederhergestellt wird¹⁵.
2. Vernähen Sie den Hornhautschnitt mit quadratischen Knoten unter Verwendung eines 10-0 Nylonfadens mit einer konischen, gebogenen 5,3 mm 1/2c Nadel (Abbildung 1F und Abbildung 4D-F).
   1. Platzieren Sie entweder einen quadratischen Knotenstich im mittleren Teil des Schnitts oder zwei quadratische Knotenstiche sowohl in der oberen als auch in der unteren Hälfte des ursprünglichen Schnitts (siehe Abbildung 3). Die Anzahl der Stiche hängt von der Länge des Hornhautschnitts ab.
   2. Durchstechen Sie nicht beide Hornhautlappen gleichzeitig. Halten Sie stattdessen einen Hornhautlappen mit einer Pinzette in der nicht dominanten Hand und schieben Sie die Nadel/das Nylon durch. Sobald eine Seite der Hornhaut punktiert wurde, schieben Sie die Nadel/das Nylon durch den nächsten Hornhautlappen. Verschließen Sie die Hornhautlappen mit quadratischen Knotenstichen.

8. Nachsorge

HINWEIS: Eine topische antibiotische Salbe wird auf das Auge aufgetragen und Analgetika werden verabreicht. Mäuse zeigen in der Regel nach der ersten Operation keine Anzeichen von Beschwerden. Bei Bedarf kann eine Version von Buprenorphin mit langsamer Freisetzung verwendet werden.

1. Führen Sie unmittelbar nach dieser Operation die folgenden Unterschritte aus.
   1. Tragen Sie einen Tropfen 0,5% Erythromycin-Augensalbe direkt über die Naht auf. Stellen Sie sicher, dass der gesamte Schnitt mit Salbe bedeckt ist.
   2. Verabreichen Sie eine intraperitoneale Injektion von Buprenorphin (0,1 mg/kg).
2. Lassen Sie die Maus sich von der Narkose in einem Käfig erholen, der auf einem Heizkissen platziert ist, um die Wärmeunterstützung zu optimieren.
   HINWEIS: Überwachen Sie das Tier auf Anzeichen von Traumata, Stress oder Beschwerden. Einige Anzeichen sind Infektionen/Kratzer an der Operationsstelle, verschobene Nähte, Fellverlust usw.

9. Überwachung der Rückgewinnung der Tiere

1. Überwachen Sie die Genesung des Tieres nach der Operation, bis es aus der Narkose erwacht.
2. Kontrollieren Sie die Mäuse in den ersten 3 Tagen nach der Operation täglich.
   HINWEIS: Es ist in der Regel nicht erforderlich, die Fäden zu ziehen, da die Mäuse entweder vor der vollständigen Heilung (2 Wochen PCS) getötet werden oder die Fäden spontan ausfallen.
3. Verabreichen Sie Buprenorphin oral, wie es für die Schmerzbehandlung nach 4-8 Stunden nach der Operation erforderlich ist, in einer Dosierung von 0,5 mg/kg (in Wackelpudding) oder einer Dosierung von 0,1 mg/kg für diejenigen, die nicht essen. Alternativ können Sie Buprenorphin kurz vor der Operation mit verlängerter Freisetzung verabreichen.
   HINWEIS: Wenn möglich, sollten präventive Analgetika verwendet werden, dies kann jedoch Anpassungen des Analgetikaprotokolls erfordern, die eine Überprüfung und Genehmigung durch das institutionelle Tierpflege- und -verwendungskomitee erfordern.

10. Euthanasie

1. Einschläferung der Maus zu einem gewünschten Zeitpunkt nach der Operation
   1. Entfernen des operierten Auges unter Verwendung des nicht operierten Auges als Kontrollgewebe; Oder betäuben Sie das Tier erneut, führen Sie eine Operation zur Entfernung von Linsenfaserzellen am zuvor nicht operierten kontralateralen Auge durch und opfern Sie dann sofort das Tier (ohne es aus der Narkose erwachen zu lassen), um eine Operation ohne Zeit zu ermöglichen.
   2. Sorgen Sie für eine schnelle Dissektion und Gewebeentnahme.
      HINWEIS: LECs durchlaufen innerhalb von Minuten nach der Operation transkriptomische Veränderungen, so dass eine schnelle Gewebeentnahme und Fixierung/Einfrierung erforderlich sind, wenn frühe LEC-Reaktionen auf eine Operation untersucht werden.

11. Durchführung weiterer Analysen an entnommenen Linsengeweben

1. Verwenden Sie das erhaltene Gewebe für Immunfärbungen, RNA-Sequenzierungen, Zellkulturen oder westliche Analysen 12,15,23,25,26,28. Theoretisch ist auch eine Durchflusszytometrie möglich¹², obwohl die geringe Anzahl von LECs in der Mauslinse (~40.000)²⁹ und das Vorhandensein von kapselassoziierten Zelltrümmern nach der Operation dies schwierig machen.
2. Immunfärbung
   1. Die Maus in einer Kammer durch CO₂ -Inhalation (4 L/min) aus einer Gasflasche einschläfern. Erhöhen Sie die Durchflussrate auf 8-10 l/min, sobald die Maus bewusstlos ist, und setzen Sie diese Exposition bis zum vollständigen Stillstand der Atmung plus 1 Minute fort.
      HINWEIS: Die Maus kann mit einer geeigneten Methode gemäß den AVMA-Richtlinien für die Euthanasie von Tieren oder gemäß den vom Institutional Animal Care and Use Committee genehmigten Richtlinien oder Richtlinien eingeschläfert werden.
   2. Stellen Sie sicher, dass die richtige Opferung erfolgt, indem Sie eine sekundäre Methode der Euthanasie anwenden, z. B. eine Gebärmutterhalsluxation.
      HINWEIS: Das Duncan-Labor hat Zeitpunkte untersucht, die von Minuten bis zu Monaten reichen PCS 12,15,23.
   3. Nachdem die Maus auf humane Weise getötet wurde, isolieren Sie das operierte Auge für die Analyse.
      1. Halten Sie die Mikrozange in der nicht-dominanten Hand, um das operierte Auge zu greifen, während Sie in der dominanten Hand eine Mikroschere halten.
      2. Schneiden Sie vorsichtig den Sehnerv und die Muskeln ab, die das Auge verankern.
         HINWEIS: Seien Sie besonders vorsichtig im Umgang mit Augen, die kürzlich operiert wurden, im Vergleich zu solchen, die länger Zeit hatten, um PCS zu heilen. Kürzlich operierte Augen sind strukturell fragiler.
   4. Einbettung des präparierten Auges in OCT-Medien für spätere Kryoschnitte, Immunfärbungen und semiquantitative konfokale Mikroskopie^28,30.
3. Isolierung des Kapselsacks mit assoziierten Zellen für die RNA-Sequenzierung, Zellkultur oder Western-Blot-Analyse
   1. Die Maus in einer Kammer durch CO₂ -Inhalation (4 L/min) aus einer Gasflasche einschläfern. Erhöhen Sie die Durchflussrate auf 8-10 l/min, sobald die Maus bewusstlos ist, und setzen Sie diese Exposition bis zum vollständigen Stillstand der Atmung plus 1 Minute fort.
   2. Stellen Sie sicher, dass die richtige Opferung erfolgt, indem Sie eine sekundäre Methode der Euthanasie anwenden, z. B. eine Gebärmutterhalsluxation.
   3. Wenn eine PCS zu einem frühen Zeitpunkt (innerhalb von 1-2 Tagen) erforderlich ist, entfernen Sie entweder die Fäden vor der Gewebeentnahme oder machen Sie einen weiteren Schnitt in der Hornhaut, durch den die Linsenkapsel extrahiert wird.
      HINWEIS: Zu einem späteren Zeitpunkt PCS sind die Stiche wahrscheinlich herausgefallen, so dass ein neuer Schnitt erforderlich ist.
4. Suchen Sie die durchscheinende Linsenkapsel.
   1. Führen Sie die Mikrozange vorsichtig durch die Hornhautöffnung ein, fassen Sie die Kapsel und entfernen Sie sie aus der Vorderkammer.
   2. Legen Sie die Kapsel zur weiteren Analyse in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen oder eine Kulturschale.

Ergebnisse

Basierend auf den Ergebnissen dieser Operationsmethode hat das Duncan Lab dieses Mausmodell der Kataraktchirurgie verwendet, um einen Verlauf der Verletzungsreaktionszeit von Linsenepithelzellen nach der Operation zu konstruieren (Abbildung 5). 6 Stunden nach der Operation sind 5 % des Epitheltranskriptoms der Linse differentiell exprimiert (Abbildung 6A), einschließlich der Hochregulierung zahlreicher Gene für die unmittelbar...

Diskussion

Diese Operationstechnik erfordert eine fortgeschrittene Handhabung der Maus und mikrochirurgische Fähigkeiten, die Übung erfordern, um sich zu entwickeln. Am schwierigsten zu meistern ist das Platzieren von feinen Nähten in der Hornhaut, um die Wunde zu verschließen. Nehmen wir an, der Experimentator ist ein absoluter Neuling im Nähen. In diesem Fall wird empfohlen, zuerst mit Schnur und Tuch zu üben und dann mit großen Nähten an kleinen Früchten zu üben, um die erforderlichen ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Erythryomycin opthalmic ointment USP	Baush Lomb	24208-910-55
1% Atropine sulfate ophthalmic solution	Amneal	60219-1748-2
1% Tropicamide opthalmic solution USP	Akorn	17478-102-12
10-0 Nylon suture	Ethicon	7707G
2.5% Phenylephrine hydrochloride ophtahlmic solution USP	Akorn	17478-200-12
26 G 1/2 Needles - straight	BD PrecisionGlide	5111
27 G 45° bent dispensing tip 1"	Harfington
Balanced saline solution	Phoenix	57319-555-06
Bupranorphine (0.1 mg/kg)	APP Pharmaceticals	401730D
Chlorhexidine solution
Needle holder 2-110	Duckworth & Kent	2-110-3E
Noyes scissors, straight	Fine Science Tools	12060-02
SMZ800 Nikon model microscope	Nikon
Sterile disposable scalpel No.11	Feather	2975#11
Tweezers #5 Dumont	Electron Microscopy Sciences	72700-D
Xylazine/Ketamine/Acepromazine (35 mg/kg, 80 mg/kg, 0.5 mg/kg) solution	APP Pharmaceticals	401730D