ナノ秒パルス電場によるシュワン細胞増殖の制御による末梢神経再生のためのin vitro

要約

ここでは、ナノ秒パルス電場(nsPEF)を印加してin vitroでシュワン細胞を刺激するためのプロトコルを紹介します。関連する因子の合成能力と分泌能力、および細胞の行動変化により、nsPEFを使用した刺激の成功が検証されました。この研究は、末梢神経再生法について肯定的な見方を示しています。

要約

シュワン細胞(SC)は、末梢神経系の髄鞘細胞であり、末梢神経の再生に重要な役割を果たしています。ナノ秒パルス電界(nsPEF)は、神経電気刺激に適用可能な新しい方法であり、細胞増殖やその他の生物学的プロセスを刺激するのに効果的であることが実証されています。nsPEFの下でSCが有意な変化を経験するかどうかを評価し、新しい末梢神経再生法の可能性を探るのに役立つことを目的として、培養されたRSC96細胞を5 kVおよび10 kVでnsPEF刺激にさらした後、3〜4日間培養を続けました。その後、特定のマーカータンパク質、神経栄養因子、転写因子、および髄鞘形成調節因子を含む、SCによって発現されるいくつかの関連因子を評価して、成功した刺激を実証しました。代表的な結果は、nsPEFがSCの増殖と移動、および末梢神経の再生に積極的に寄与する関連因子を合成する能力を有意に増強することを示しました。同時に、GFAPの発現が低いことは、末梢神経損傷の良性の予後を示していました。これらの結果から、nsPEFはSCを刺激することにより末梢神経損傷の効率的な治療法として大きな可能性を秘めていることが示されました。

概要

毎年、何百万人もの人々が末梢神経系(PNS)と中枢神経系(CNS)の両方が関与する神経損傷に罹患しています¹。研究によると、神経損傷後の CNS の軸索修復能力は非常に限られていますが、PNS^{は SCs 2} の大幅な可塑性により能力が向上していることが示されています。それにもかかわらず、末梢神経損傷後に完全な再生を達成することは依然として困難であり、人間の健康に重大な課題をもたらし続けています^3,4。今日では、自家移植片は、ドナー部位の罹患率^{と利用可能性}が限られているという欠点にもかかわらず、一般的な治療法であり続けています5。このような状況により、研究者は材料⁶、分子因子⁷、電気刺激(ES)などの代替療法を探求するようになりました。軸索の成長と神経再生を促進する因子^として8、適切なESの方法を選択し、ESとSCの関係を探ることが不可欠となる。

SCはPNSの主要なグリア細胞であり、^PNS9,10

プロトコル

1. 凍結保存されたRSC96細胞の解凍

1. 1 mLの細胞懸濁液を含むクライオバイアルを37°Cの水浴で急速に振とうして解凍し、4〜6 mLの完全培地を含む遠心チューブに加えてよく混合します。
2. 1000 x g で3〜5分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞を3 mLの完全培地に再懸濁します。
3. 細胞懸濁液を6〜8 mLの完全培地を含む培養フラスコ(またはディッシュ)に加え、37°Cで一晩インキュベートします。
4. 翌日、顕微鏡で細胞の成長と密度を観察します。

2.細胞継代:

注:細胞密度が80%〜90%に達すると、継代の準備が整います。

1. 培地を廃棄し、カルシウムイオンとマグネシウムイオンを含まないリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を1〜2回すすぎます。
2. 0.25%(w/v)トリプシン-0.53 mM EDTAを培養フラスコ(T25フラスコの場合は1〜2 mL、T75フラスコの場合は2〜3 mL)に加え、37°Cで1〜2分間インキュベートします。
3. 細胞の剥離を顕微鏡で観察します。ほとんどの細胞が丸くなって分離した場合は、フラスコをすぐに作業領域に戻し、フラスコを軽くたたいて、10%FBSを含む3〜....

ディスカッション

近年、nsPEFの適用は、報告されているように、成長を後押ししています。nsPEFは、所望の領域のみに高度に的を絞った効果を有し、追加の熱損傷を引き起こすことなく治療するのに十分なエネルギーを提供し、人体にとってより安全なものとなる²⁸。これらの特性により、腫瘍治療と神経再生における有望なトランスレーショナルな見通しが得られます。しかし、いくつかの?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antifade mounting medium	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G1401
Anti-GFAP Mouse mAb	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	GB12100-100
Anti-Neurofilament heavy polypeptide Mouse mAb	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	GB12144-100
Anti-S100 beta Mouse mAb	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	GB14146-100
BSA	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	GC305010
Coverslip	Jiangsu Shitai experimental equipment Co., LTD	10212432C
CY3-labeled goat anti-mouse IgG	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	GB21302
DAPI Staining Reagent	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G1012
Decolorizing shaker	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	DS-2S100
High Voltage Power Supply for nsPEF	Matsusada Precision Inc.	AU-60P1.6-L
Histochemical pen	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G6100
Membrane breaking liquid	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G1204
Microscope slide	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G6012
Palm centrifuge	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	MS6000
PBS powdered	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G0002
Pipette	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD
Positive fluorescence microscope	Nikon, Japan	NIKON ECLIPSE C1
Rabbit Anti-SOX10/AF488 Conjugated antibody	Beijing Bioss Biotechnology Co., LTD	BS-20563R-AF488
RSC96 Schwann cells	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	STCC30007G-1
scanister	3DHISTECH	Pannoramic MIDI
Special cable for nsPEF	Times Microwave Systems	M17/78-RG217
Turbine mixer	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	MV-100