Regulating Schwann Cell Growth by Nanosecond Pulsed Electric Field for Peripheral Nerve Regeneration In Vitro(체외 말초 신경 재생을 위한 나노초 펄스 전기장에 의한 Schwann 세포 성장 조절)

요약

여기에서는 시험관 내에서 Schwann 세포를 자극하기 위해 나노초 펄스 전기장(nsPEF)을 적용하는 프로토콜을 제시합니다. 관련 인자의 합성 및 분비 능력과 세포 거동 변화는 nsPEF를 사용하여 성공적인 자극을 검증했습니다. 이 연구는 말초 신경 재생 방법에 대한 긍정적인 견해를 제공합니다.

초록

슈반세포(Schwann cell, SC)는 말초 신경계의 수초화 세포로, 말초 신경 재생에 중요한 역할을 합니다. 나노초 펄스 전기장(nsPEF)은 세포 증식 및 기타 생물학적 과정을 자극하는 데 효과적인 것으로 입증된 신경 전기 자극에 적용할 수 있는 새로운 방법입니다. SC가 nsPEF 하에서 상당한 변화를 겪는지 여부를 평가하고 새로운 말초 신경 재생 방법의 가능성을 탐색하는 데 도움이 되도록 배양된 RSC96 세포를 5kV 및 10kV에서 nsPEF 자극을 받은 후 3-4일 동안 계속 배양했습니다. 그 후, SC에 의해 발현된 일부 관련 인자를 평가하여 특정 마커 단백질, 신경 영양 인자, 전사 인자 및 수초화 조절자를 포함하여 성공적인 자극을 입증했습니다. 대표적인 결과에서, nsPEF는 SC의 증식과 이동을 유의하게 향상시키고, 말초신경의 재생에 긍정적으로 기여하는 관련 인자를 종합하는 능력을 향상시킨다는 것을 보여주었다. 동시에, GFAP의 낮은 발현은 말초 신경 손상의 양성 예후를 나타냈다. 이러한 모든 결과는 nsPEF가 SC를 자극함으로써 말초 신경 손상에 대한 효율적인 치료 방법으로서 큰 잠재력을 가지고 있음을 보여줍니다.

서문

매년 수백만 명의 사람들이 말초 신경계(PNS)와 중추 신경계(CNS)와 관련된 신경 손상의 영향을 받습니다¹. 연구에 따르면 신경 손상 후 중추신경계의 축삭 복구 능력은 상당히 제한되는 반면, PNS는 SC의 상당한 가소성으로 인해 향상된 용량을 보여줍니다². 그럼에도 불구하고 말초 신경 손상 후 완전한 재생을 달성하는 것은 여전히 힘든 일이며 인간의 건강에 심각한 도전을 제기하고 있습니다 ^3,4. 오늘날, 자가이식편은 기증자 부위 이환율과 제한된 가용성이라는 단점에도 불구하고 일반적인 치료법으로 남아 있다⁵. 이러한 상황으로 인해 연구자들은 재료⁶, 분자 요인⁷ 및 전기 자극(ES)을 포함한 대체 요법을 모색하게 되었습니다. 축삭돌기의 성장과^{신경 재생을} 촉진하는 요인8 때문에, 적절한 ES 방법을 선택하고 ES와 SC 사이의 관계를 탐색하는 것이 필수적이다.

SC는 PNS의 주요 신....

프로토콜

1. 동결 보존된 RSC96 세포의 해동

1. 1mL의 세포 현탁액이 들어있는 cryovial을 37°C 수조에서 빠르게 흔들어 해동한 다음 4-6mL의 완전 배양 배지가 들어 있는 원심분리 튜브에 넣고 잘 섞습니다.
2. 1000 x g 에서 3-5분 동안 원심분리하고 상층액을 버리고 세포를 3mL의 완전한 배양 배지에 재현탁시킵니다.
3. 세포 현탁액을 6-8mL의 완전 배양 배지가 들어 있는 배양 플라스크(또는 접시)에 넣고 37°C에서 밤새 배양합니다.
4. 다음 날에는 현미경으로 세포의 성장과 밀도를 관찰합니다.

2. 세포 통로:

알림: 세포 밀도가 80%-90%에 도달하면 통과할 준비가 된 것입니다.

1. 배양 배지를 버리고 칼슘 및 마그네슘 이온이 없는 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 1-2회 헹굽니다.
2. 배양 플라스크에 0.25%(w/v) 트립신-0.53mM EDTA를 추가하고(T25 플라스크의 경우 1-2mL, T75 플라스크의 경우 2-3mL) 37°C에서 1-2분 동안 배양합니다.
3. 현미경....

토론

최근 몇 년 동안 nsPEF의 응용 프로그램은 보고된 바와 같이 급격한 성장을 경험했습니다. nsPEF는 원하는 부위에만 고도로 표적화된 효과를 가지며, 추가적인 열적 손상을 일으키지 않고 치료하기에 충분한 에너지를 제공하여 인체에 더 안전하다²⁸. 이러한 특성은 종양 치료 및 신경 재생에서 유망한 번역 전망을 제공합니다. 그러나 일부 연구에서는 nsPEF의 몇 가지 한계를 제안했?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antifade mounting medium	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G1401
Anti-GFAP Mouse mAb	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	GB12100-100
Anti-Neurofilament heavy polypeptide Mouse mAb	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	GB12144-100
Anti-S100 beta Mouse mAb	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	GB14146-100
BSA	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	GC305010
Coverslip	Jiangsu Shitai experimental equipment Co., LTD	10212432C
CY3-labeled goat anti-mouse IgG	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	GB21302
DAPI Staining Reagent	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G1012
Decolorizing shaker	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	DS-2S100
High Voltage Power Supply for nsPEF	Matsusada Precision Inc.	AU-60P1.6-L
Histochemical pen	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G6100
Membrane breaking liquid	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G1204
Microscope slide	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G6012
Palm centrifuge	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	MS6000
PBS powdered	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	G0002
Pipette	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD
Positive fluorescence microscope	Nikon, Japan	NIKON ECLIPSE C1
Rabbit Anti-SOX10/AF488 Conjugated antibody	Beijing Bioss Biotechnology Co., LTD	BS-20563R-AF488
RSC96 Schwann cells	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	STCC30007G-1
scanister	3DHISTECH	Pannoramic MIDI
Special cable for nsPEF	Times Microwave Systems	M17/78-RG217
Turbine mixer	Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD	MV-100