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요약

여기에서는 시험관 내에서 Schwann 세포를 자극하기 위해 나노초 펄스 전기장(nsPEF)을 적용하는 프로토콜을 제시합니다. 관련 인자의 합성 및 분비 능력과 세포 거동 변화는 nsPEF를 사용하여 성공적인 자극을 검증했습니다. 이 연구는 말초 신경 재생 방법에 대한 긍정적인 견해를 제공합니다.

초록

슈반세포(Schwann cell, SC)는 말초 신경계의 수초화 세포로, 말초 신경 재생에 중요한 역할을 합니다. 나노초 펄스 전기장(nsPEF)은 세포 증식 및 기타 생물학적 과정을 자극하는 데 효과적인 것으로 입증된 신경 전기 자극에 적용할 수 있는 새로운 방법입니다. SC가 nsPEF 하에서 상당한 변화를 겪는지 여부를 평가하고 새로운 말초 신경 재생 방법의 가능성을 탐색하는 데 도움이 되도록 배양된 RSC96 세포를 5kV 및 10kV에서 nsPEF 자극을 받은 후 3-4일 동안 계속 배양했습니다. 그 후, SC에 의해 발현된 일부 관련 인자를 평가하여 특정 마커 단백질, 신경 영양 인자, 전사 인자 및 수초화 조절자를 포함하여 성공적인 자극을 입증했습니다. 대표적인 결과에서, nsPEF는 SC의 증식과 이동을 유의하게 향상시키고, 말초신경의 재생에 긍정적으로 기여하는 관련 인자를 종합하는 능력을 향상시킨다는 것을 보여주었다. 동시에, GFAP의 낮은 발현은 말초 신경 손상의 양성 예후를 나타냈다. 이러한 모든 결과는 nsPEF가 SC를 자극함으로써 말초 신경 손상에 대한 효율적인 치료 방법으로서 큰 잠재력을 가지고 있음을 보여줍니다.

서문

매년 수백만 명의 사람들이 말초 신경계(PNS)와 중추 신경계(CNS)와 관련된 신경 손상의 영향을 받습니다1. 연구에 따르면 신경 손상 후 중추신경계의 축삭 복구 능력은 상당히 제한되는 반면, PNS는 SC의 상당한 가소성으로 인해 향상된 용량을 보여줍니다2. 그럼에도 불구하고 말초 신경 손상 후 완전한 재생을 달성하는 것은 여전히 힘든 일이며 인간의 건강에 심각한 도전을 제기하고 있습니다 3,4. 오늘날, 자가이식편은 기증자 부위 이환율과 제한된 가용성이라는 단점에도 불구하고 일반적인 치료법으로 남아 있다5. 이러한 상황으로 인해 연구자들은 재료6, 분자 요인7 및 전기 자극(ES)을 포함한 대체 요법을 모색하게 되었습니다. 축삭돌기의 성장과신경 재생을 촉진하는 요인8 때문에, 적절한 ES 방법을 선택하고 ES와 SC 사이의 관계를 탐색하는 것이 필수적이다.

SC는 PNS의 주요 신경교세포로서 PNS 9,10의 재생에 중요한 역할을 합니다. 말초신경 손상 후, SC는 신경의 재생을 수행하기 위해 빠른 활성화, 광범위한 재프로그래밍2, 미엘린 형성 상태에서 성장 지원 형태로의 전환을 거친다2. SCs의 실질적 증식은 손상된 신경의 원위부 말단에서 발생하는 반면, 원위 그루터기의 SC는 증식과 신장을 거쳐 Bungner's band를 형성하는데, 이는 축삭이 표적 기관11을 향해 성장하도록 안내하는 데 필요합니다. 더욱이, 근위 및 원위 신경 그루터기에서 나온 SC는 신경 다리로 이동하여 SC 탯줄을 형성하여 축삭 재생을 촉진한다12. 또한, 선행 연구에서는 말초신경 재생의 경우 전사 인자(transcriptional factor)13, 신경영양 인자(neurotrophic factor)14 및 수초화 조절인자(myelination regulator)13를 포함하여 SC와 관련된 관련 인자의 합성 및 분비가 변화한다는 것을 입증했다. 이는 또한 SC의 활성을 평가하기 위한 지표를 제공한다. 이를 바탕으로 SC의 증식, 이동, 합성 및 관련 인자의 분비 촉진이 말초신경 재생을 개선하기 위해 광범위하게 연구되었다15.

이전 연구에서는 신경 재생에 ES를 사용할 수 있는 가능성을 입증했습니다1. 널리 받아들여지는 설명은 ES가 세포막의 탈분극을 유도하고, 막 전위를 변경하며, 이러한 생체 분자의 전하 분포를 변화시킴으로써 막 단백질 기능에 영향을 미칠 수 있다는 것입니다1. 그러나 Intense PEF를 널리 적용하면 심한 통증, 불수의적 근육 수축 및 심장 세동을 유발할 수 있다8. 또한 크레아틴 키나아제(CK) 활성을 증가시키고, 근력을 감소시키며, 지연성 발병 근육통(DOMS)의 발병을 유도합니다16. nsPEF는 나노초 펄스 지속 시간 내에 고전압 전기장으로 피험자를 자극하는 새로운 기술이며, 세포 수준 연구에서 점차 사용되고 있습니다17,18. 이전 연구에서는 세포 증식 및 세포 소기관 활동을 촉진하는 nsPEF의 가능한 근거는 막 나노 기공의 형성과 이온 채널의 활성화이며, 이는 세포질 Ca2+ 농도의 증가로 이어진다고 보고했습니다19. nsPEF는 펄스 전력 기술을 활용하여 세포막을 충전하여 짧은 지속 시간, 빠른 상승 시간, 높은 전력 및 낮은 에너지 밀도를 특징으로 하는 펄스를 생성합니다20. 이러한 특성은 nsPEF가 자극 부작용이 최소화된 바람직한 모드일 수 있음을 시사한다8. 또한 nsPEF는 외과적 중재에 비해 최소 침습 시술, 가역성, 조정 가능성 및 신경 조직에 대한 비파괴성과 같은 이점을 제공합니다. 생물 의학 분야에서 nsPEF의 주류 연구 방향 중 하나는 고에너지 전기장 자극을 이용한 종양 조직 절제에 대한 응용 분야입니다 21,22,23. 일부 연구 결과에 따르면 12-nsPEF는 손상을 일으키지 않고 말초 신경을 자극할 수 있습니다24. 그러나 현재로서는 신경 재생 분야에서 nsPEF의 적용에 관한 증거는 제한적입니다. 또한, nsPEF를 사용하여 SC를 자극하는 것은 선구적인 시도로, 추가적인 in vivo 및 임상 연구에 기여합니다. 본 연구는 SC의 nsPEF 자극이 신경 재생을 촉진할 수 있는지, 그리고 이후의 심층적이고 체계적인 연구를 위한 신뢰할 수 있는 근거를 제공할 수 있는지를 탐구한다.

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프로토콜

1. 동결 보존된 RSC96 세포의 해동

  1. 1mL의 세포 현탁액이 들어있는 cryovial을 37°C 수조에서 빠르게 흔들어 해동한 다음 4-6mL의 완전 배양 배지가 들어 있는 원심분리 튜브에 넣고 잘 섞습니다.
  2. 1000 x g 에서 3-5분 동안 원심분리하고 상층액을 버리고 세포를 3mL의 완전한 배양 배지에 재현탁시킵니다.
  3. 세포 현탁액을 6-8mL의 완전 배양 배지가 들어 있는 배양 플라스크(또는 접시)에 넣고 37°C에서 밤새 배양합니다.
  4. 다음 날에는 현미경으로 세포의 성장과 밀도를 관찰합니다.

2. 세포 통로:

알림: 세포 밀도가 80%-90%에 도달하면 통과할 준비가 된 것입니다.

  1. 배양 배지를 버리고 칼슘 및 마그네슘 이온이 없는 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 1-2회 헹굽니다.
  2. 배양 플라스크에 0.25%(w/v) 트립신-0.53mM EDTA를 추가하고(T25 플라스크의 경우 1-2mL, T75 플라스크의 경우 2-3mL) 37°C에서 1-2분 동안 배양합니다.
  3. 현미경으로 세포 분리를 관찰합니다. 대부분의 세포가 둥글고 분리되면 플라스크를 작업 영역으로 빠르게 되돌리고 플라스크를 부드럽게 두드린 다음 10% FBS가 포함된 배양 배지 3-4mL를 추가하여 분해를 중지합니다.
  4. 내용물을 섞고 용액을 흡인하고 1000 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 버리고 1-2mL의 신선한 배양 배지를 추가하고 부드럽게 피펫팅하여 세포를 재현탁시킵니다.
  5. 세포 현탁액을 1:2 비율로 새 T25 플라스크에 옮기고 7mL의 배양 배지를 추가합니다.

3. nsPEF 장치의 동작

  1. RSC96 세포를 DMEM 배양 배지 1mL에 재현탁시키고 양면에 전극이 있는 비색 접시로 옮깁니다.
  2. 전원 스위치를 켭니다.
  3. 기기의 손잡이를 돌려 매개변수를 조정하여 전기장의 강도를 변경합니다. 이 연구에서 설정한 강도는 5kV/cm, 10kV/cm, 20kV/cm 및 40kV/cm입니다.
  4. 스파크가 나타날 때까지 전극을 조심스럽게 회전시켜 두 전극을 즉시 분리하기 전에 미리 설정된 전계 강도 강도에 따라 셀이 5개의 nsPEF 펄스를 받을 수 있도록 합니다. 이 처리 후, nsPEF로 처리된 실험군 세포와 처리되지 않은 대조군 세포를 일정 기간의 세포 배양(이 실험에서 1일) 후에 각각 섹션 4-6을 수행합니다.

4. 세포 계수 키트-8(CCK-8) 분석

  1. 전기 자극으로 자극된 RSC96 세포로부터 특정 농도의 세포 현탁액을 준비합니다. 100μL의 세포 현탁액을 96웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 추가합니다. CCK-8 분석의 요구 사항을 고려하여 시약 키트의 총 세포 수를 1 x 103 과 1 x 106 사이로 제어합니다.
  2. 키트에서 10μL의 CCK-8 용액을 96웰 세포 배양 플레이트에 추가합니다. 37°C의 CO2 인큐베이터에서 추가로 30분에서 4시간 동안 배양합니다.
  3. 흡광도를 측정합니다. 검출 파장이 430-490 nm이고 기준 파장이 600-650 nm인 이중 파장 측정을 사용하십시오.
  4. 세포 증식의 실험 결과를 기반으로 후속 실험에 대한 전계 강도 강도를 결정합니다. 후속 실험을 위해 증식이 양호한 세포를 선택합니다.

5. 세포 스크래치 분석

  1. 6웰 플레이트의 각 웰에서 웰당 총 부피가 2mL인 3 x 105 개의 세포를 파종합니다. 약 72시간 후, 세포가 우물을 덮을 것입니다. 실험군과 대조군에 대해 별도로 테스트를 수행합니다.
  2. 피펫 팁을 사용하여 배양액 웰의 바닥에 수평선을 그립니다. 피펫 팁이 수직으로 고정되어 있는지 확인하고 기울어지지 않도록 하십시오.
  3. 배양 배지를 흡인하고 PBS로 2-3회 세척합니다.
  4. 각 웰에 무혈청 배지 2mL를 추가합니다.
  5. 플레이트를 37°C 인큐베이터에 놓습니다. 0시간 및 24시간에서 도립 현미경의 4배 배율로 사진을 찍어 세포 이동의 변화를 관찰합니다.

6. 면역형광(Immunofluorescence)

  1. 세포 투과화:
    1. 세포 현탁액을 배양 접시에 부드럽게 피펫팅한 후, 커버슬립에 세포가 고르게 분포된 위치에 조직학 펜으로 원을 그립니다. 대조군과 다른 실험군을 따로 취급합니다.
    2. 50-100 μL의 투과화 작업 용액(0.25-0.5% Triton X-100)을 추가하고 실온(RT)에서 20분 동안 배양합니다. 매번 5분 동안 PBS로 세 번 세척하십시오.
  2. 혈청 차단: 조직을 균일하게 덮기 위해 원 안에 3% BSA를 추가합니다. 실온에서 30분 동안 배양합니다.
  3. 1차 항체 배양: 차단 용액을 부드럽게 제거하고 적절하게 희석된 1차 항체(마우스 유래, 1:300에 희석)를 세포 웰에 추가합니다. 세포 배양 플레이트를 습한 상자에 넣고 4°C에서 밤새 배양합니다.
  4. 2차 항체 배양: 세포판을 셰이커에 놓고 매번 5분 동안 3회 세척합니다. 해당 2차 항체(CY3 표지 염소 항-마우스 IgG, 1:300에 희석)를 추가하고 RT에서 50분 동안 배양합니다.
  5. DAPI 핵 염색:
    1. PBS(pH 7.4)의 커버슬립을 셰이커에 놓고 매번 5분씩 3회 세척합니다.
    2. 슬라이드를 부드럽게 건조시킨 후 원 안에 DAPI 염색 용액(2μg/mL, 원당 0.5mL)을 넣고 어두운 방에서 10분 동안 실온에서 배양합니다.
  6. 장착: 커버슬립을 PBS(pH 7.4)의 셰이커에 놓고 매번 5분 동안 3회 세척합니다. 슬라이드를 부드럽게 건조시킨 후 형광을 위해 페이딩 방지 장착 매체로 커버슬립을 밀봉합니다.
  7. 이미지 획득: 330-380nm의 파장에서 DAPI를 자극하고 420nm에서 방출을 감지합니다. 465-495 nm에서 여기하고 AF488의 경우 515-555 nm에서 방출을 감지합니다. 510-560nm에서 여기하고 CY3에 대해 590nm에서 방출을 감지합니다. 608-648nm에서 여기하고 CY5의 경우 672-712nm에서 방출을 감지합니다.

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결과

저강도 펄스 전기장은 세포 증식을 자극합니다.
CCK-8 분석에 따르면, 5kV/cm 그룹에서 RSC96의 증식 속도는 대조군 세포보다 유의하게 빨랐다. 그러나 매개변수가 증가함에 따라(20kV/cm 및 40kV/cm) 증식 속도는 불안정했으며 대조군보다 더 낮았습니다. 40kV/cm군에서 RSC96 세포의 세포 증식률은 대조군 및 5kV/cm군에 비해 유의하게 낮았으며, 통계적으로 유의한 차이를 보였다(P < 0.05). 세포 증?...

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토론

최근 몇 년 동안 nsPEF의 응용 프로그램은 보고된 바와 같이 급격한 성장을 경험했습니다. nsPEF는 원하는 부위에만 고도로 표적화된 효과를 가지며, 추가적인 열적 손상을 일으키지 않고 치료하기에 충분한 에너지를 제공하여 인체에 더 안전하다28. 이러한 특성은 종양 치료 및 신경 재생에서 유망한 번역 전망을 제공합니다. 그러나 일부 연구에서는 nsPEF의 몇 가지 한계를 제안했?...

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공개

저자는 밝힐 것이 없습니다.

감사의 말

이 연구는 국가 핵심 과학 기기 및 장비 개발 프로젝트(NO.82027803)의 자금 지원을 받았습니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Antifade mounting mediumWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDG1401
Anti-GFAP Mouse mAbWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDGB12100-100
Anti-Neurofilament heavy polypeptide Mouse mAbWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDGB12144-100
Anti-S100 beta Mouse mAbWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDGB14146-100
BSAWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDGC305010
CoverslipJiangsu Shitai experimental equipment Co., LTD10212432C
CY3-labeled goat anti-mouse IgGWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDGB21302
DAPI Staining ReagentWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDG1012
Decolorizing shakerWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDDS-2S100
High Voltage Power Supply for nsPEFMatsusada Precision Inc.AU-60P1.6-L
Histochemical penWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDG6100
Membrane breaking liquidWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDG1204
Microscope slideWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDG6012
Palm centrifugeWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDMS6000
PBS powderedWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDG0002
PipetteWuhan Xavier Biotechnology Co., LTD
Positive fluorescence microscopeNikon, JapanNIKON ECLIPSE C1
Rabbit Anti-SOX10/AF488 Conjugated antibodyBeijing Bioss Biotechnology Co., LTDBS-20563R-AF488
RSC96 Schwann cellsWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDSTCC30007G-1
scanister3DHISTECHPannoramic MIDI
Special cable for nsPEFTimes Microwave SystemsM17/78-RG217
Turbine mixerWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDMV-100

참고문헌

  1. Jing, W., et al. Study of electrical stimulation with different electric-field intensities in the regulation of the differentiation of PC12 cells. ACS Chem Neurosci. 10 (1), 348-357 (2018).
  2. Nocera, G., Jacob, C. Mechanisms of Schwann cell plasticity involved in peripheral nerve repair after injury. Cell Mol Life Sci. 77, 3977-3989 (2020).
  3. Aguilar, Z. Nanomaterials for Medical Applications. , Newnes. (2012).
  4. Xie, S., et al. Efficient generation of functional Schwann cells from adipose-derived stem cells in defined conditions. Cell Cycle. 16 (9), 841-851 (2017).
  5. Rosenbalm, T. N., Levi, N. H., Morykwas, M. J., Wagner, W. D. Electrical stimulation via repeated biphasic conducting materials for peripheral nerve regeneration. J Mater Sci Mater Med. 34 (11), 1-18 (2023).
  6. Daly, W. T., et al. Comparison and characterization of multiple biomaterial conduits for peripheral nerve repair. Biomaterials. 34 (34), 8630-8639 (2013).
  7. Lee, B. -K., et al. End-to-side neurorrhaphy using an electrospun PCL/collagen nerve conduit for complex peripheral motor nerve regeneration. Biomaterials. 33 (35), 9027-9036 (2012).
  8. Kim, V., Gudvangen, E., Kondratiev, O., Redondo, L., Xiao, S., Pakhomov, A. G. Peculiarities of neurostimulation by intense nanosecond pulsed electric fields: how to avoid firing in peripheral nerve fibers. Int J Mol Sci. 22 (13), 7051(2021).
  9. Assinck, P., Duncan, G. J., Hilton, B. J., Plemel, J. R., Tetzlaff, W. Cell transplantation therapy for spinal cord injury. Nat Neurosci. 20 (5), 637-647 (2017).
  10. Chen, Y. Y., McDonald, D., Cheng, C., Magnowski, B., Durand, J., Zochodne, D. W. Axon and Schwann cell partnership during nerve regrowth. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (7), 613-622 (2005).
  11. Yi, S., et al. Tau modulates Schwann cell proliferation, migration and differentiation following peripheral nerve injury. J Cell Sci. 132 (6), (2019).
  12. Min, Q., Parkinson, D. B., Dun, X. Migrating Schwann cells direct axon regeneration within the peripheral nerve bridge. Glia. 69 (2), 235-254 (2021).
  13. Zhang, Y., Zhao, Q., Chen, Q., Xu, L., Yi, S. Transcriptional control of peripheral nerve regeneration. Mol Neurobiol. 60 (1), 329-341 (2023).
  14. Nishi, M., Kawata, M., Azmitia, E. C. Trophic interactions between brain-derived neurotrophic factor and S100β on cultured serotonergic neurons. Brain Res. 868 (1), 113-118 (2000).
  15. Gu, Y., et al. miR-sc8 inhibits Schwann cell proliferation and migration by targeting EGFR. PLoS One. 10 (12), e0145185(2015).
  16. Dong, H. -L., et al. AMPK regulates mitochondrial oxidative stress in C2C12 myotubes induced by electrical stimulations of different intensities. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 38 (6), 742-747 (2018).
  17. Beebe, S. J., Blackmore, P. F., White, J., Joshi, R. P., Schoenbach, K. H. Nanosecond pulsed electric fields modulate cell function through intracellular signal transduction mechanisms. Physiol Meas. 25 (4), 1077(2004).
  18. Haberkorn, I., Siegenthaler, L., Buchmann, L., Neutsch, L., Mathys, A. Enhancing single-cell bioconversion efficiency by harnessing nanosecond pulsed electric field processing. Biotechnol Adv. 53, 107780(2021).
  19. Ruiz-Fernández, A. R., Campos, L., Gutierrez-Maldonado, S. E., Núñez, G., Villanelo, F., Perez-Acle, T. Nanosecond pulsed electric field (nsPEF): Opening the biotechnological Pandora's box. Int J Mol Sci. 23 (11), 6158(2022).
  20. Nuccitelli, R., et al. First-in-human trial of nanoelectroablation therapy for basal cell carcinoma: proof of method. Exp Dermatol. 23 (2), 135-137 (2014).
  21. Nuccitelli, R., et al. Non-thermal nanoelectroablation of UV-induced murine melanomas stimulates an immune response. Pigment Cell Melanoma Res. 25 (5), 618-629 (2012).
  22. Carr, L., et al. A nanosecond pulsed electric field (nsPEF) can affect membrane permeabilization and cellular viability in a 3D spheroids tumor model. Bioelectrochemistry. 141, 107839(2021).
  23. Hornef, J., Edelblute, C. M., Schoenbach, K. H., Heller, R., Guo, S., Jiang, C. Thermal analysis of infrared irradiation-assisted nanosecond-pulsed tumor ablation. Sci Rep. 10 (1), 5122(2020).
  24. Zuo, K. J., Gordon, T., Chan, K. M., Borschel, G. H. Electrical stimulation to enhance peripheral nerve regeneration: Update in molecular investigations and clinical translation. Exp Neurol. 332, 113397(2020).
  25. Juckett, L., Saffari, T. M., Ormseth, B., Senger, J. -L., Moore, A. M. The effect of electrical stimulation on nerve regeneration following peripheral nerve injury. Biomolecules. 12 (12), 1856(2022).
  26. Jessen, K. R., Mirsky, R. Negative regulation of myelination: relevance for development, injury, and demyelinating disease. Glia. 56 (14), 1552-1565 (2008).
  27. Chen, Z. -L., Yu, W. -M., Strickland, S. Peripheral regeneration. Annu Rev Neurosci. 30, 209-233 (2007).
  28. Yin, D., et al. Cutaneous papilloma and squamous cell carcinoma therapy utilizing nanosecond pulsed electric fields (nsPEF). PloS One. 7 (8), e43891(2012).
  29. Qi, F., et al. Photoexcited wireless electrical stimulation elevates nerve cell growth. Colloids Surf B Biointerfaces. 220, 112890(2022).
  30. Mi, Y., Liu, Q., Li, P., Xu, J., Yang, Q., Tang, J. Targeted gold nanorods combined with low-intensity nsPEFs enhance antimelanoma efficacy in vitro. Nanotechnology. 31 (35), 355102(2020).
  31. Ho, T. -C., et al. Hydrogels: Properties and applications in biomedicine. Molecules. 27 (9), 2902(2022).

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