In vitroでの間葉系幹細胞と網膜色素上皮との間のトンネルナノチューブを介したミトコンドリア転写

要約

ここでは、ミトコンドリアのトレーシング、間葉系幹細胞(MSC)と網膜色素上皮細胞(ARPE19)の直接共培養手順、トンネルナノチューブ(TNT)形成とミトコンドリア移動の観察と統計解析の方法を含むプロトコールを提示し、MSCとARPE19細胞間のTNTを介したミトコンドリア交換を特徴付けます。

要約

ミトコンドリアの移動は、さまざまな種類の細胞で広く発生する正常な生理現象です。これまでの研究では、ミトコンドリア輸送の最も重要な経路は、トンネルナノチューブ(TNT)を経由することです。間葉系幹細胞(MSC)がTNTによってミトコンドリアを他の細胞に移すことができると報告している研究はたくさんあります。しかし、双方向のミトコンドリア移動の現象を実証した研究はほとんどありません。ここでは、私たちのプロトコルは、MSCと網膜色素上皮細胞との間のミトコンドリア移動の現象を研究するための実験的アプローチを 説明しています in vitro 2つのミトコンドリア追跡法による方法。

mito-GFPトランスフェクトMSCとmito-RFPトランスフェクトARPE19細胞(網膜色素上皮細胞株)を24時間共培養しました。次に、すべての細胞をファロイジンで染色し、共焦点顕微鏡でイメージングしました。ARPE19細胞では緑色蛍光のミトコンドリアが、MSCでは赤色蛍光のミトコンドリアが観察され、MSCとARPE19細胞間で双方向のミトコンドリア移動が起こっていることが示された。この現象は、ミトコンドリアの輸送がMSCとARPE19細胞の間でも発生する正常な生理学的現象であり、MSCからARPE19細胞へのミトコンドリアの移動は 、その逆よりもはるかに頻繁に発生することを示唆しています。私たちの結果は、MSCがミトコンドリアを網膜色素上皮に移行できることを示しており、同様に、MSCが将来、網膜色素上皮でのミトコンドリア輸送を通じて治療の可能性を発揮できると予測しています。さらに、ARPE19細胞からMSCへのミトコンドリア移行については、まだ研究が進められていません。

概要

ミトコンドリアはほとんどの細胞種の主要なエネルギー源として機能しており、ミトコンドリアの機能不全は特に網膜¹のような高エネルギーを必要とする組織に影響を与えます。網膜の代謝変化は、生体エネルギー危機を引き起こし、最終的には光受容体および/またはRPE細胞の死をもたらす可能性があります²。間葉系幹細胞(MSC)ベースの治療法は、眼の変性の治療に有効性が実証されており、網膜組織に対するMSCの有益な効果の根底にある正確なメカニズムの1つは、機能的なミトコンドリアの移行に起因する可能性があります3,4,5,6。2004年、Rustomらは、トンネルナノチューブ(TNT^{)によって}促進される新しい細胞間相互作用によるミトコンドリア移動の現象を初めて報告しました7。

2D培養では、トンネルナノチューブ(TNT)は、長さが数十ナノメートルから数百ナノメートルの薄い(20〜700 nm)膜突起によって識別され、基質上に懸濁しており、2つ以上の同型細胞および異型細胞間の接続を直接確立できます。これらの構造は、特にF-アクチンに富んでおり、細胞間でのミトコンドリアなどのカーゴの輸送を促進します。さらに、TNTは両端に開口部を有しており、相互接続された細胞間の細胞質内容物の連続性を可能にする⁸。

TNTを介したミトコンドリアの移動は、細胞配列が密集していることとミトコンドリアの追跡が困難なため、in vivoで検出することは困難です。細胞共培養とミトコンドリア追跡技術を利用したin vitro実験により、TNT形成とミトコンドリア移動の観察が可能になります^8,9。また、in vitroでMSCと網膜色素上皮細胞を共培養することにより、TNTを介したミトコンドリア移動の現象を観察しました¹⁰。

多くの先行研究は、MSCから他の細胞への一方向のミトコンドリア移動のみを観察している3,4,5,6。また、これまでmito-tracker greenとmito-tracker redの2種類の細胞を用いて、ミトコンドリアの双方向移動の解析も試みましたが、色素のクロストークが実験結果に支障をきたしました。本研究では、ミトコンドリアの双方向移動をより詳細に研究するために、レンチウイルストランスフェクション技術を用いてミトコンドリア蛍光の異なる2つの細胞株を作製し、その後、in vitroで直接共培養することでTNT形成とミトコンドリア双方向移動の現象を観察・解析しました。

簡単に説明すると、ミトコンドリアの追跡方法、ARPE19細胞とのMSCの共培養方法、TNT形成とミトコンドリア移動の解析方法について、段階的かつ実行可能なプロトコールをここで説明します。この実験の結果は、TNTを介した双方向のミトコンドリア移動を実証し、ミトコンドリア輸送が一般的な生理学的現象であることを証明しただけでなく、網膜細胞に対するMSCの潜在的な治療能力も示しました。

プロトコル

1. MSC-mito-GFPおよびARPE19-mito-RFP細胞株の作製

1. 細胞培養
   注:ここでは、例としてMSCのみを使用しています。
   1. 1%ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むhMSC培地中の6ウェルプレートでヒトMSCを培養します( 材料表を参照)細胞密度が80%〜90%に達するまで。細胞増殖の密度にもよりますが、2〜3日ごとに培地を交換してください。
      1. 元の培地を取り出し、リン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で細胞を一度洗浄します(材料の表を参照)。トリプシン-EDTA-DPBS混合物(0.05% Trypsin-EDTA:0.25% Trypsin-EDTAをDPBSで1:5の比率で希釈)1 mLを加え、37°Cインキュベーターで3〜4分間(細胞によって異なります)インキュベートします。
         注:顕微鏡で細胞の消化を観察し、ほとんどの細胞が丸みを帯びて分離している場合は消化を停止します。
      2. 6ウェルプレートを軽くたたいて表面に付着した細胞を剥がし、1 mLの新鮮な完全培地を加えて消化を終了します。
      3. ピペットガンですべての細胞を穏やかに再懸濁し、その後、収集したすべての細胞を15 mLの遠心チューブに移します。
      4. 細胞を200 × g で5分間遠心分離します。
      5. 上清を吸引し、1 mLの新鮮な培地を加えて細胞を再懸濁します。細胞計数のために10 μLの細胞懸濁液を取ります。
      6. レンチウイルストランスフェクションの18〜24時間前に、1ウェルあたり1×10個の⁵ 細胞の密度でMSC細胞を6ウェルプレートに播種し、トランスフェクション時の細胞密度が約50%になるようにします。
2. レンチウイルスのトランスフェクション
   注:レンチウイルストランスフェクションに関連するすべての操作は、バイオセーフティキャビネットで行う必要があります。
   1. 翌日、最初の培地を2 mLの新鮮な培地と交換し、25 μLのレンチウイルス懸濁液(5.00E+08 TU/mL)とアジュバントを加え、続いて37°Cでインキュベートします。
      注:レンチウイルスの包装は、Mito-GFP(pCT-Mito-copGFP)プラスミド( 材料の表 と 補足図S1を参照)を使用して会社によって行われました。
   2. インキュベーションの6時間後、ウイルス含有培地を2 mLの新鮮な培地と交換します。1日1回、培地のインキュベーションと交換を続けます。
      注:トランスフェクションの48時間後にMSCで有意なミトコンドリア蛍光発現が観察され、72時間の時点でさらなる増強が明らかになります。
   3. トランスフェクションの2日後に培地にピューロマイシン(1 μg/mL)を添加することにより、細胞のトランスフェクションに成功しました。同時に、コントロールとしてウイルストランスフェクションを欠く間葉系幹細胞に同濃度のピューロマイシンを添加します。
      注:mito-GFPウイルスベクターは、ピューロマイシン耐性遺伝子を含むように操作されています。
   4. ピューロマイシン(1 μg/mL)を導入して、毎日培地を交換してください。対照群でほぼ完全な細胞死時にピューロマイシンの追加を停止します。.
      注:培地にはこの濃度のピューロマイシンは含まれていません。ピューロマイシンの添加は、培地を6ウェルプレートに添加する場合にのみ必要です。
   5. 細胞が継代され凍結されるまで、ピューロマイシンなしで培養を続けます。このタイプのセルをMSC-mito-GFPと名付けます。
      注:ARPE19細胞はATCC細胞バンクに由来し、10%FBSと1%ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むDMEM/F12で培養しました( 材料の表を参照)、それらの消化と継代の方法はMSCのそれと同じです。最後に、トランスフェクションに成功した細胞をARPE19-mito-RFPと命名しました。

2. MSC細胞とARPE19細胞の直接共培養

注:この共培養システムでは、MSC-mito-GFP細胞がドナー細胞として機能し、ARPE19-mito-RFP細胞がレシピエント細胞として機能します。ドナー細胞とレシピエント細胞を区別するために、レシピエント細胞を追跡しました。

1. ARPE19-mito-RFP細胞を細胞質膜中のCellTrace Violet( 材料表を参照)で標識します。
   注:CellTrace violet色素の励起と蛍光は、それぞれ405 nmと450 nmです。
   1. CellTrace Violet試薬のバイアルに20 μLのジメチルスルホキシド(DMSO)を加え、使用直前によく混合して、CellTrace Violet( 材料の表を参照)ストック溶液を調製します。
   2. ARPE19-mito-RFP細胞を80%〜90%の所望の密度まで増殖させます。
   3. CellTrace Violetストック溶液を予温(37°C)DPBSで目的の使用濃度(1:1,000)に希釈します。これがローディングソリューションです。
      注:CellTrace Violetの希釈はDPBSで行う必要があり、染色結果が非常に悪くなるため、培地で置き換えることはできません。
   4. 培地を取り出し、1 mLのローディング溶液と交換します。細胞を37°Cで10分間インキュベートします。
      注:条件が許せば、5分後に蛍光顕微鏡で染色を観察できます。一部の細胞はDPBSへの長時間の曝露に耐えられない可能性があるため、望ましい結果が得られたらすぐに染色を終了することができます。
   5. ローディング溶液を取り出し、細胞をDPBSで2回洗浄し、2 mLの新鮮な完全培地と交換します。染色後、細胞を少なくとも10分間インキュベートして、CellTrace Violetが酢酸加水分解を受けられるようにします。
      注:このステップは、細胞が最適な状態に戻り、その後の実験に干渉しないようにするために必要です。
2. 各ウェルに50 μLのDPBSを添加して、24ウェルプレートを調製します。その後、カバーガラス(指定直径15 mm)( 材料表を参照)をプレートに挿入し、1分間沈殿させます。負圧を利用してDPBSをウェルから取り外し、カバースライドが皿の底に近づくようにします。
3. ステップ1.1.1で説明されているように、ドナーMSCおよびレシピエントARPE19細胞をトリプシン化します。
4. 細胞カウント
   1. 10 μLの細胞懸濁液を計数プレート上に置いて、計数します。
      注:細胞の密度が高すぎる場合は、培地で10倍に希釈してから、上記のように進めることができます。
   2. 10,000個のMSCと10,000個のARPE19細胞を、24ウェルプレートのウェルあたり500 μLの培地に播種します。細胞を24ウェルプレートに加える前に、細胞をよく混合します。MSCカウントがA/mL、ARPE19細胞カウントがB/mLの場合、以下に示す計算を参照してください。
      注:4ウェルの場合、2 mLの培地に40,000個のMSCと40,000個のARPE19細胞が必要です。
      40,000個のMSCを含むMSC懸濁液(C)の容量= 40,000 / AμL
      40,000個のMSCを含むARPE19懸濁液(D)の容量= 40,000 / BμL
      2 - (C + D) mLの培地で容量を2 mLにします。
5. 顕微鏡で細胞を観察し、細胞が均一に分布するまでプレートを振盪し、培養物中で24時間インキュベートします。

3. トランズウェル系におけるMSC細胞とARPE19細胞の間接共培養

1. ステップ2.1から2.4.1で説明したように、細胞培養、標識、消化、およびカウントを行います。
2. 24ウェルプレートのウェルあたり1 mLの培地に20,000個のARPE19細胞を播種します。
   注:この実験では、標識ミトコンドリアのないARPE19細胞を使用しました。
3. 細胞が播種されたウェルにインサートを置きます。
4. ウェルごとに上部細胞チャンバー内の100 μLの培地に10,000個のMSCを播種します。
5. 手順2.5を繰り返します。

4. 細胞骨格染色

注:実験中は光から保護してください。

1. 24ウェルプレートから培地を取り出します。すべての細胞を500 μL/ウェルの4%ポリホルムアルデヒド(PFA)で1回洗浄し、500 μLの新鮮な4% PFAを加えて、サンプルを20分間固定します。
   注意: トランズウェルシステムのインセットは破棄されます。
   注:ナノチューブは非常に壊れやすいため、無傷のナノチューブの保持を最大化するために、DPBSではなく4%PFAで細胞を直接洗浄しました。
2. 固定液を取り出し、サンプルをDPBSで3 x 10分間洗浄します。
3. 0.5% Triton X-100( 材料表を参照)と4%ウシ血清アルブミン(BSA)( 材料表を参照)からなるブロッキング溶液500 μL/ウェルを添加し、室温で1時間インキュベートします。
4. ブロッキング溶液を取り出し、サンプルをDPBSで3 x 10分間洗浄します。
5. ファロイジン染色液の調製( 材料表を参照)
   注:ファロイジンの励起と発光は、それぞれ650 nmと668 nmです。
   1. バイアルの内容物を150 μLの無水DMSOに溶解してストック溶液を調製し、400倍のストック溶液を得ます。
   2. 400倍保存溶液をDPBSで1倍に希釈して染色液を調製します。これがファロイジン染色液です。
6. 各ウェルに200 μLのファロイジン染色溶液を加え、室温で1時間インキュベートします。
7. 染色液を回収し、サンプルをDPBSで3 x 10分間洗浄します。
   注:DPBSで細胞を洗浄する場合は、プレートをシェーカーに置いておくことをお勧めします。
8. シリンジ針でカバーガラスを取り出し、風乾させます。
   注意: 最適な状態は、カバーガラスに目に見える液体が見えず、乾燥していない状態です。
9. スライドに少量の封入用剤( 材料表を参照)を塗布し、スライドのカバーガラスを慎重に裏返して、メディウムが表面全体に均一にコーティングされるようにします。マニキュアで端を密封します。
   注意: マニキュアが乾くまで数分待ちます。
10. 共焦点画像はすぐに取得するか、スライスボックスに移して4°Cで短時間保存してください。
    注:理想的な保管期間は2週間です。この時間を超えると、撮像効果が低下する場合があります。

5. 共焦点イメージング

注:共焦点イメージングは取扱説明書に従って行われ、顕微鏡によって異なる場合があります。ここでは、主要な手順の一部のみを示します。

1. 共焦点顕微鏡を起動し、取扱説明書に従って4つのレーザーチャンネル(405、488、561、640)を開きます。
2. コンピュータ上のソフトウェアにアクセスし、ソフトウェアの予備的なパラメータ化を実行します。
   1. プロセス管理パネル内に蛍光チャネルCF-405、CF-488、CF-561、およびCF-640を追加します。
   2. 各蛍光チャンネルの露光時間を 200 ms に調整し、カメラコントロールパネルでゲイン強度を 2 に設定します。
   3. レーザー/LEDコンバイナーを80の値に調整します。
3. 顕微鏡の外部コントロールパネルを操作して、対物レンズを 20倍の 倍率に調整し、レンズが最低設定に配置されていることを確認します。
4. スライドをキャリアテーブル上で逆向きに配置します。
5. 405nmレーザーを作動させ、粗いピントスパイラルと細かいフォーカシングスパイラルを使用してフォーカスを操作します。青色の蛍光細胞が見えるまで、接眼レンズの下でサンプルを観察します。
6. コンピューターのソフトウェアインターフェースで ライブイメージング を選択し、CF-405チャンネルに切り替えて、青色蛍光を示す細胞の明確な画像がコンピューター画面に表示されるまで、ファインフォーカスヘリックスを再調整します。
7. 対物レンズを40倍の倍率に調整し、CF-640チャンネルに移行してから、明確な細胞マイクロフィラメント構造が見えるまで焦点を慎重に調整します。
8. 焦点距離を一定に保ち、CF-405、CF-488、CF-561チャンネルに順次移行し、必要に応じて各チャンネル内の最適な 露光時間、ゲイン強度、およびイメージング用の レーザー/LEDコンバイナー のパラメーターを変更します。
9. Z Image Stack機能をアクティブにし、焦点距離を操作してZ軸の始点と終点を定義し、Z軸を使用して奥行きのある画像をキャプチャします。
10. Process Management パネルの [Start] ボタンをクリックして、写真を撮ります。
11. スライスごとに 10 個の視野をランダムに選択します。
    注: 2 つの視野の間に重なり合わないようにする必要があります。
12. タイムラプス機能を有効にし、合計撮影時間を 24時間と、目的の視野を特定してから5分間の写真間隔を指定します。
    注:タイムラプスシーケンスをキャプチャするには、ガラス底の皿で細胞を接種し、5%_CO2 ガスを含む換気ボックス内に細胞を配置する必要があります。
13. すべての画像を保存してエクスポートします。
    注:TNTおよびミトコンドリア転写の精査を強化するために、超解像イメージングが採用されました。超解像イメージングは、企業が提供するHIS-SIM(High Intelligent and Sensitive SIM)と呼ばれる製品化されたHIS-SIMを使用して行われました。画像は、100x/1.5 NAの油浸対物レンズを使用して取得されました。

6. データ分析

1. 各画像の統計解析では、細胞の総数、ナノチューブの数、Violet陽性ARPE19-mito-RFE細胞の数、緑色蛍光を示すViolet陽性細胞の数(MSCからのミトコンドリア転移を有するARPE19細胞の数を表す)、および赤色蛍光を示すViolet陰性細胞の数(ARPE19細胞からのミトコンドリア転移を有するMSC細胞の数を表す)を定量化します。
   1. TNT形成を定量化するには、細胞総数に対する細胞間ナノチューブの数の比率を計算します。
   2. ミトコンドリアの移動速度は、緑色の蛍光を示すViolet陽性細胞の数とViolet陽性細胞の総数(MSCからARPE19細胞へのミトコンドリア移動を表す)に対する、またはViolet陰性細胞の総数に対する赤色蛍光を示すViolet陰性細胞の数の比(ARPE19細胞からMSCへのミトコンドリア移動を表す)として計算します。

結果

間葉系幹細胞(MSC)とARPE19細胞の直接共培養を示す概略図を 図1に示します。mito-GFPを発現するように改変されたMSCをドナー細胞として、紫色標識細胞質膜をレシピエント細胞としてARPE19-mito-RFP細胞を共培養しました。24時間の共培養期間の後、細胞をファロイジンについて染色し、共焦点顕微鏡を用いて調べた。得られた細胞集団には、MSC-mito-GFP?...

ディスカッション

TNT媒介性ミトコンドリア移動の現象は、様々なタイプの組織細胞10,11,12,13において一般的な生理学的過程であることを、数多くの研究が実証している。MSCからミトコンドリア機能障害のある細胞への機能的ミトコンドリア提供は、強力な治療可能性を示します

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110
6-well plate	NEST	703001
15 mL centrifuge tube	BD Falcon	352097
24-well plate	NEST	702001
ARPE19 cells	ATCC	CRL-2302	Cell lines
Bovine serum albumin (BSA)	Beyotime	ST025
CellTrace violet	Invitrogen	C34557
Cover slide	NEST	801007
DMSO	sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
DMEM/F-12-GlutaMAX	Gibco	10565-042
Fetal Bovine Serum (FBS)	VivaCell	C04002-500
FluorSave Reagent	Millipore	345789
MSCs	Nuwacell	RC02003	Cell lines
ncMission	Shownin	RP02010
Pen Strep	Gibco	15140-122
pCT-Mito-GFP	SBI	CYTO102-PA-1	Plasmid; From  https://www.systembio.com/mitochondria-cyto-tracer-pct-mito-gfp-cmv
Puromycin	MCE	HY-B1743A
Pipette	Axygen	TF-1000-R-S
Phalloidin	Invitrogen	A22287
Triton X-100	Solarbio	T8200
Transwell plate	Corning	3470