In vitroでの間葉系幹細胞と網膜色素上皮との間のトンネルナノチューブを介したミトコンドリア転写

要約

ここでは、ミトコンドリアのトレーシング、間葉系幹細胞(MSC)と網膜色素上皮細胞(ARPE19)の直接共培養手順、トンネルナノチューブ(TNT)形成とミトコンドリア移動の観察と統計解析の方法を含むプロトコールを提示し、MSCとARPE19細胞間のTNTを介したミトコンドリア交換を特徴付けます。

要約

ミトコンドリアの移動は、さまざまな種類の細胞で広く発生する正常な生理現象です。これまでの研究では、ミトコンドリア輸送の最も重要な経路は、トンネルナノチューブ(TNT)を経由することです。間葉系幹細胞(MSC)がTNTによってミトコンドリアを他の細胞に移すことができると報告している研究はたくさんあります。しかし、双方向のミトコンドリア移動の現象を実証した研究はほとんどありません。ここでは、私たちのプロトコルは、MSCと網膜色素上皮細胞との間のミトコンドリア移動の現象を研究するための実験的アプローチを 説明しています in vitro 2つのミトコンドリア追跡法による方法。

mito-GFPトランスフェクトMSCとmito-RFPトランスフェクトARPE19細胞(網膜色素上皮細胞株)を24時間共培養しました。次に、すべての細胞をファロイジンで染色し、共焦点顕微鏡でイメージングしました。ARPE19細胞では緑色蛍光のミトコンドリアが、MSCでは赤色蛍光のミトコンドリアが観察され、MSCとARPE19細胞間で双方向のミトコンドリア移動が起こっていることが示された。この現象は、ミトコンドリアの輸送がMSCとARPE19細胞の間でも発生する正常な生理学的現象であり、MSCからARPE19細胞へのミトコンドリアの移動は 、その逆よりもはるかに頻繁に発生することを示唆しています。私たちの結果は、MSCがミトコンドリアを網膜色素上皮に移行できることを示しており、同様に、MSCが将来、網膜色素上皮でのミトコンドリア輸送を通じて治療の可能性を発揮できると予測しています。さらに、ARPE19細胞からMSCへのミトコンドリア移行については、まだ研究が進められていません。

概要

ミトコンドリアはほとんどの細胞種の主要なエネルギー源として機能しており、ミトコンドリアの機能不全は特に網膜¹のような高エネルギーを必要とする組織に影響を与えます。網膜の代謝変化は、生体エネルギー危機を引き起こし、最終的には光受容体および/またはRPE細胞の死をもたらす可能性があります²。間葉系幹細胞(MSC)ベースの治療法は、眼の変性の治療に有効性が実証されており、網膜組織に対するMSCの有益な効果の根底にある正確なメカニズムの1つは、機能的なミトコンドリアの移行に起因する可能性があります3,4,5,6。2004年、Rustomらは、トンネルナノチューブ(TNT^{)によって}促進される新しい細胞間相互作用によるミトコンドリア移動の現象を初めて報告しました7。

2D培養では、トンネルナノチューブ(TNT)は、長さが数十ナノメートルから数百ナノメートルの薄い(20〜700 nm)膜突起によって識別され、基質上に懸濁しており....

プロトコル

1. MSC-mito-GFPおよびARPE19-mito-RFP細胞株の作製

1. 細胞培養
   注:ここでは、例としてMSCのみを使用しています。
   1. 1%ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むhMSC培地中の6ウェルプレートでヒトMSCを培養します( 材料表を参照)細胞密度が80%〜90%に達するまで。細胞増殖の密度にもよりますが、2〜3日ごとに培地を交換してください。
      1. 元の培地を取り出し、リン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で細胞を一度洗浄します(材料の表を参照)。トリプシン-EDTA-DPBS混合物(0.05% Trypsin-EDTA:0.25% Trypsin-EDTAをDPBSで1:5の比率で希釈)1 mLを加え、37°Cインキュベーターで3〜4分間(細胞によって異なります)インキュベートします。
         注:顕微鏡で細胞の消化を観察し、ほとんどの細胞が丸みを帯びて分離している場合は消化を停止します。
      2. 6ウェルプレートを軽くたたいて表面に付着した細胞を剥がし、1 mLの新鮮な完全培地を加えて消化を終了します。
      3. ピペットガンですべての細胞を穏やかに再懸濁し、その後、収集したすべての細胞を15 mLの遠心チューブに移します。
      ....

ディスカッション

TNT媒介性ミトコンドリア移動の現象は、様々なタイプの組織細胞10,11,12,13において一般的な生理学的過程であることを、数多くの研究が実証している。MSCからミトコンドリア機能障害のある細胞への機能的ミトコンドリア提供は、強力な治療可能性を示します

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110
6-well plate	NEST	703001
15 mL centrifuge tube	BD Falcon	352097
24-well plate	NEST	702001
ARPE19 cells	ATCC	CRL-2302	Cell lines
Bovine serum albumin (BSA)	Beyotime	ST025
CellTrace violet	Invitrogen	C34557
Cover slide	NEST	801007
DMSO	sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
DMEM/F-12-GlutaMAX	Gibco	10565-042
Fetal Bovine Serum (FBS)	VivaCell	C04002-500
FluorSave Reagent	Millipore	345789
MSCs	Nuwacell	RC02003	Cell lines
ncMission	Shownin	RP02010
Pen Strep	Gibco	15140-122
pCT-Mito-GFP	SBI	CYTO102-PA-1	Plasmid; From  https://www.systembio.com/mitochondria-cyto-tracer-pct-mito-gfp-cmv
Puromycin	MCE	HY-B1743A
Pipette	Axygen	TF-1000-R-S
Phalloidin	Invitrogen	A22287
Triton X-100	Solarbio	T8200
Transwell plate	Corning	3470