Митохондриальный перенос с помощью туннельных нанотрубок между мезенхимальными стволовыми клетками и пигментным эпителием сетчатки in vitro

Резюме

Здесь мы представляем протокол, включающий митохондриальную трассировку, процедуры прямого совместного культивирования мезенхимальных стволовых клеток (МСК) и клеток пигментного эпителия сетчатки (ARPE19), а также методы наблюдения и статистического анализа образования туннельных нанотрубок (TNT) и митохондриального переноса для характеристики митохондриального обмена через TNT между МСК и клетками ARPE19.

Аннотация

Митохондриальный перенос является нормальным физиологическим явлением, которое широко распространено среди различных типов клеток. В исследовании на сегодняшний день наиболее важным путем для митохондриального транспорта является туннельирование нанотрубок (ТНТ). Было проведено много исследований, в которых сообщалось, что мезенхимальные стволовые клетки (МСК) могут переносить митохондрии в другие клетки с помощью тротила. Тем не менее, немногие исследования продемонстрировали феномен двунаправленного митохондриального переноса. В нашем протоколе описывается экспериментальный подход к изучению феномена митохондриального переноса между МСК и пигментными эпителиальными клетками сетчатки in vitro с помощью двух методов митохондриального отслеживания.

Мы совместно культивировали мито-GFP-трансфицированные МСК с мито-RFP-трансфицированными клетками ARPE19 (линия пигментных эпителиальных клеток сетчатки) в течение 24 ч. Затем все клетки окрашивали фаллоидином и визуализировали с помощью конфокальной микроскопии. Мы наблюдали митохондрии с зеленой флуоресценцией в клетках ARPE19 и митохондрии с красной флуоресценцией в МСК, что указывает на двунаправленный митохондриальный перенос между МСК и клетками ARPE19. Это явление говорит о том, что митохондриальный транспорт является нормальным физиологическим явлением, которое также происходит между МСК и клетками ARPE19, а перенос митохондрий от МСК к клеткам ARPE19 происходит гораздо чаще, чем наоборот. Наши результаты указывают на то, что МСК могут переносить митохондрии в пигментный эпителий сетчатки, а также предсказывают, что МСК могут реализовать свой терапевтический потенциал через митохондриальный транспорт в пигментном эпителии сетчатки в будущем. Кроме того, перенос митохондрий от клеток ARPE19 к МСК еще предстоит дополнительно изучить.

Введение

Митохондрии служат основным источником энергии для большинства типов клеток, при этом митохондриальная дисфункция особенно влияет на ткани с высокими требованиями к энергии, такие как сетчатка¹. Метаболические изменения в сетчатке могут вызвать биоэнергетический кризис, в конечном итоге приводящий к гибели фоторецепторов и/или клеток РПЭ². Методы лечения на основе мезенхимальных стволовых клеток (МСК) продемонстрировали эффективность в лечении дегенерации глаз, и одним из точных механизмов, лежащих в основе благотворного воздействия МСК на ткани сетчатки, может быть отнесен к функциональ....

протокол

1. Генерация клеточных линий MSC-mito-GFP и ARPE19-mito-RFP

1. Культура клеток
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве примера здесь используются только MSC.
   1. Культивируют человеческие МСК в 6-луночном планшете в среде hMSC с 1% пенициллином и стрептомицином (см. Таблицу материалов) до тех пор, пока плотность клеток не достигнет 80%-90%. В зависимости от плотности роста клеток меняйте среду один раз в 2-3 дня.
      1. Удалите исходную среду и промойте клетки фосфатно-солевым буфером (DPBS) (см. Таблицу материалов). Добавьте 1 мл смеси трипсин-ЭДТА-ДПБС (0,05% Трипсин-ЭДТА: 0,25% Трипсин....

Результаты

Принципиальная диаграмма, иллюстрирующая прямую кокультуру мезенхимальных стволовых клеток (МСК) и клеток ARPE19, изображена на рисунке 1. МСК, сконструированные для экспрессии mito-GFP, в качестве донорских клеток и клеток ARPE19-mito-RFP с цитоплазматическими ме?.......

Обсуждение

Многочисленные исследования показали, что феномен тротил-опосредованного митохондриального переноса является преобладающим физиологическим процессом в различных типах клеток тканей 10,11,12,13. Фун?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110
6-well plate	NEST	703001
15 mL centrifuge tube	BD Falcon	352097
24-well plate	NEST	702001
ARPE19 cells	ATCC	CRL-2302	Cell lines
Bovine serum albumin (BSA)	Beyotime	ST025
CellTrace violet	Invitrogen	C34557
Cover slide	NEST	801007
DMSO	sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
DMEM/F-12-GlutaMAX	Gibco	10565-042
Fetal Bovine Serum (FBS)	VivaCell	C04002-500
FluorSave Reagent	Millipore	345789
MSCs	Nuwacell	RC02003	Cell lines
ncMission	Shownin	RP02010
Pen Strep	Gibco	15140-122
pCT-Mito-GFP	SBI	CYTO102-PA-1	Plasmid; From  https://www.systembio.com/mitochondria-cyto-tracer-pct-mito-gfp-cmv
Puromycin	MCE	HY-B1743A
Pipette	Axygen	TF-1000-R-S
Phalloidin	Invitrogen	A22287
Triton X-100	Solarbio	T8200
Transwell plate	Corning	3470