Transferência mitocondrial via nanotubos de tunelamento entre células-tronco mesenquimais e epitélio pigmentar da retina in vitro

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo incluindo rastreamento mitocondrial, procedimentos diretos de co-cultura de células-tronco mesenquimais (MSCs) e células epiteliais pigmentares da retina (ARPE19), bem como os métodos para observar e analisar estatisticamente a formação de nanotubos de tunelamento (TNT) e a transferência mitocondrial para caracterizar a troca mitocondrial via TNTs entre MSCs e células ARPE19.

Resumo

A transferência mitocondrial é um fenômeno fisiológico normal que ocorre amplamente entre vários tipos de células. No estudo até o momento, a via mais importante para o transporte mitocondrial é através de nanotubos de tunelamento (TNTs). Muitos estudos relataram que as células-tronco mesenquimais (MSCs) podem transferir mitocôndrias para outras células por TNTs. No entanto, poucos estudos demonstraram o fenômeno da transferência mitocondrial bidirecional. Aqui, nosso protocolo descreve uma abordagem experimental para estudar o fenômeno da transferência mitocondrial entre MSCs e células epiteliais pigmentares da retina in vitro por dois métodos de rastreamento mitocondrial.

Co-cultivamos MSCs transfectadas com mito-GFP com células ARPE19 transfectadas com mito-RFP (uma linha de células epiteliais pigmentares da retina) por 24 h. Em seguida, todas as células foram coradas com faloidina e visualizadas por microscopia confocal. Observamos mitocôndrias com fluorescência verde em células ARPE19 e mitocôndrias com fluorescência vermelha em MSCs, indicando que a transferência mitocondrial bidirecional ocorre entre MSCs e células ARPE19. Esse fenômeno sugere que o transporte mitocondrial é um fenômeno fisiológico normal que também ocorre entre MSCs e células ARPE19, e a transferência mitocondrial de MSCs para células ARPE19 ocorre com muito mais frequência do que vice-versa. Nossos resultados indicam que as MSCs podem transferir mitocôndrias para o epitélio pigmentar da retina e, da mesma forma, preveem que as MSCs podem cumprir seu potencial terapêutico por meio do transporte mitocondrial no epitélio pigmentar da retina no futuro. Além disso, a transferência mitocondrial de células ARPE19 para MSCs ainda precisa ser mais explorada.

Introdução

As mitocôndrias servem como fonte primária de energia para a maioria dos tipos de células, com a disfunção mitocondrial afetando particularmente tecidos de alta demanda de energia, como a retina¹. Alterações metabólicas na retina podem desencadear uma crise bioenergética, resultando na morte de fotorreceptores e/ou células^EPR2. As terapias baseadas em células-tronco mesenquimais (CTM) têm demonstrado eficácia no tratamento da degeneração ocular, e um dos mecanismos precisos subjacentes aos efeitos benéficos das CTMs nos tecidos da retina pode ser atribuído à transferência mitocondrial funcional 3,4,5,6. Em 2004, Rustom et al. relataram pela primeira vez o fenômeno da transferência mitocondrial por meio de uma nova interação célula a célula facilitada por nanotubos de tunelamento (TNTs) ⁷ .

Na cultura 2D, os nanotubos de tunelamento (TNTs) são identificados por suas saliências de membrana finas (20-700 nm) que variam de dezenas a centenas de nanômetros de comprimento, que são suspensas sobre o substrato e podem estabelecer conexões diretamente entre duas ou mais células homotípicas e heterotípicas. Essas estruturas são notavelmente enriquecidas em F-actina e facilitam o transporte de carga, como mitocôndrias, entre as células. Além disso, os TNTs possuem aberturas em ambas as extremidades, permitindo a continuidade do conteúdo citoplasmático entre as células interconectadas⁸.

É difícil detectar a transferência mitocondrial mediada por TNT in vivo devido ao arranjo celular denso e aos desafios no rastreamento das mitocôndrias. A experimentação in vitro, utilizando técnicas de cocultura celular e traçado mitocondrial, permite a observação da formação de TNT e transferência mitocondrial ^8,9. Também observamos o fenômeno da transferência mitocondrial mediada por TNT por meio da co-cultura de MSCs e células epiteliais pigmentares da retina in vitro¹⁰.

Muitos estudos anteriores observaram apenas transferência mitocondrial unidirecional de MSCs para outras células 3,4,5,6. Anteriormente, também tentamos analisar a transferência mitocondrial bidirecional usando dois tipos de células marcadas com mito-tracker verde e mito-tracker vermelho, respectivamente, mas a diafonia dos corantes interferiu nos resultados experimentais. Para estudar a transferência bidirecional mitocondrial com mais precisão, construímos aqui duas linhagens celulares com diferentes fluorescências mitocondriais usando a técnica de transfecção lentiviral e, posteriormente, observamos e analisamos os fenômenos de formação de TNT e transferência mitocondrial bidirecional por co-cultura direta in vitro.

Em resumo, um protocolo passo a passo e acionável é descrito aqui sobre como rastrear mitocôndrias, co-cultura de MSCs com células ARPE19 e analisar a formação de TNT e a transferência mitocondrial. Os resultados deste experimento demonstraram a transferência mitocondrial bidirecional mediada por TNT, que não apenas provou que o transporte mitocondrial é um fenômeno fisiológico comum, mas também mostrou a potencial capacidade terapêutica das MSCs nas células da retina.

Protocolo

1. Geração de linhagens celulares MSC-mito-GFP e ARPE19-mito-RFP

1. Cultura de células
   NOTA: Apenas MSCs são usados aqui como exemplo.
   1. Cultive MSCs humanas em uma placa de 6 poços em meio hMSC com 1% de penicilina e estreptomicina (ver Tabela de Materiais) até que a densidade celular atinja 80% -90%. Dependendo da densidade de crescimento celular, troque o meio uma vez a cada 2-3 dias.
      1. Remova o meio original e lave as células uma vez com solução salina tamponada com fosfato (DPBS) (consulte a Tabela de Materiais). Adicione 1 mL da mistura de tripsina-EDTA-DPBS (0,05% de tripsina-EDTA: 0,25% de tripsina-EDTA diluída com DPBS na proporção de 1:5; consulte a Tabela de Materiais) e incube por 3-4 min (dependendo das células) em uma incubadora a 37 ° C.
         NOTA: Observe a digestão celular ao microscópio e pare a digestão se a maioria das células estiver arredondada e destacada.
      2. Bata suavemente na placa de 6 poços para separar as células aderidas à superfície e, em seguida, adicione 1 mL de meio completo fresco para interromper a digestão.
      3. Ressuspenda suavemente todas as células com uma pistola de pipeta e, em seguida, transfira todas as células coletadas para um tubo de centrífuga de 15 mL.
      4. Centrifugue as células a 200 × g por 5 min.
      5. Aspire o sobrenadante e ressuspenda as células adicionando 1 mL de meio fresco. Tome 10 μL de suspensão celular para contagem de células.
      6. Dezoito a 24 h antes da transfecção lentiviral, semear células MSC a uma densidade de 1 × 10⁵ células por poço em placas de 6 poços, garantindo que a densidade celular no momento da transfecção seja de aproximadamente 50%.
2. Transfecção de lentivírus
   NOTA: Todas as operações relacionadas à transfecção lentiviral precisam ser realizadas em um gabinete de biossegurança.
   1. Substitua o meio inicial por 2 mL de meio fresco no dia seguinte e adicione 25 μL de suspensão de lentivírus (5,00E + 08 TU / mL) com adjuvantes, seguido de incubação a 37 ° C.
      NOTA: O empacotamento de lentivírus foi realizado usando o plasmídeo Mito-GFP (pCT-Mito-copGFP) (consulte a Tabela de Materiais e a Figura Suplementar S1) por uma empresa.
   2. Após 6 h de incubação, substitua o meio contendo vírus por 2 mL de meio fresco. Continue a incubar e trocar o meio uma vez por dia.
      NOTA: A expressão significativa de fluorescência mitocondrial é observada nas MSCs 48 h após a transfecção, com aumento adicional evidente no ponto de tempo de 72 h.
   3. Rastreie as células transfectadas com sucesso suplementando o meio de cultura com puromicina (1 μg/mL) 2 dias após a transfecção. Ao mesmo tempo, adicione uma concentração equivalente de puromicina às células-tronco mesenquimais sem transfecção viral como controle.
      NOTA: O vetor viral mito-GFP é projetado para incluir o gene de resistência à puromicina.
   4. Mude o meio diariamente com a introdução de puromicina (1 μg/mL). Interrompa a adição de puromicina após a morte celular quase completa no grupo controle.
      NOTA: O meio não contém esta concentração de puromicina. A adição de puromicina é necessária apenas quando o meio é adicionado a uma placa de 6 poços.
   5. Continue a cultivar sem puromicina até que as células sejam eliminadas e congeladas. Nomeie esse tipo de célula como MSC-mito-GFP.
      NOTA: As células ARPE19 foram derivadas do Banco de Células ATCC e cultivadas em DMEM/F12 contendo 10% de FBS e 1% de penicilina e estreptomicina (ver Tabela de Materiais), e os métodos de sua digestão e passagem são os mesmos das MSCs. O plasmídeo Mito-RFP foi modificado do Mito-GFP por uma empresa. Finalmente, nomeamos as células transfectadas com sucesso como ARPE19-mito-RFP.

2. Co-cultura direta de células MSC e ARPE19

NOTA: Neste sistema de co-cultura, as células MSC-mito-GFP servirão como células doadoras, enquanto as células ARPE19-mito-RFP funcionarão como células receptoras. Para distinguir entre células doadoras e receptoras, rastreamos as células receptoras.

1. Rotule as células ARPE19-mito-RFP com CellTrace Violet (consulte a Tabela de Materiais) na membrana citoplasmática.
   NOTA: A excitação e emissão do corante CellTrace violet são 405 nm e 450 nm, respectivamente.
   1. Prepare uma solução-mãe CellTrace Violet (consulte a Tabela de Materiais) adicionando 20 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) a um frasco para injetáveis de CellTrace Violet Reagent e misturando bem imediatamente antes do uso.
   2. Cultive as células ARPE19-mito-RFP até a densidade desejada de 80% -90%.
   3. Dilua a solução-mãe CellTrace Violet em DPBS pré-aquecido (37 °C) até a concentração de trabalho desejada (1:1.000). Esta é a solução de carregamento.
      NOTA: A diluição do CellTrace Violet deve ser realizada com DPBS e não pode ser substituída por meio de cultura, pois isso levará a resultados de coloração muito ruins.
   4. Remova o meio de cultura e substitua-o por 1 mL de solução de carregamento. Incubar as células durante 10 min a 37 °C.
      NOTA: Se as condições permitirem, a coloração pode ser observada em um microscópio de fluorescência após 5 min. A coloração pode ser interrompida assim que os resultados desejados forem alcançados, pois algumas células podem não ser capazes de tolerar a exposição prolongada à SPBD.
   5. Remova a solução de carga, lave as células 2x com DPBS e substitua por 2 mL de meio completo fresco. Incube as células por pelo menos 10 minutos após a coloração para permitir que o CellTrace Violet sofra hidrólise de acetato.
      NOTA: Esta etapa é necessária para que as células retornem ao seu estado ideal e evitem interferir nos experimentos subsequentes.
2. Prepare uma placa de 24 poços adicionando 50 μL de DPBS em cada poço. Em seguida, insira a lamínula (com um diâmetro especificado de 15 mm) (consulte a Tabela de Materiais) na placa e deixe-a repousar por 1 min. Remova o DPBS dos poços, utilizando pressão negativa para garantir que a corrediça da tampa esteja próxima ao fundo do prato.
3. Tripsinizar as CTM do dador e as células ARPE19 recetoras conforme descrito no passo 1.1.1.
4. Contagem de células
   1. Colocar 10 μL de suspensão celular numa placa de contagem para enumeração.
      NOTA: Se a densidade das células for muito alta, elas podem ser diluídas 10 vezes com meio e, em seguida, proceder como acima.
   2. Semeie 10.000 MSCs e 10.000 células ARPE19 em 500 μL de meio por poço de uma placa de 24 poços. Misture bem as células antes de adicioná-las à placa de 24 poços. Veja os cálculos mostrados abaixo, dada uma contagem de MSC de A / mL e uma contagem de células ARPE19 de B / mL.
      NOTA: Para 4 poços, são necessárias 40.000 MSCs e 40.000 células ARPE19 em 2 mL de meio.
      Volume de suspensão de MSC (C) contendo 40.000 MSCs = 40.000/A μL
      Volume de suspensão ARPE19 (D) contendo 40.000 MSCs = 40.000/B μL
      Aumente o volume para 2 mL com 2 - (C + D) mL de meio.
5. Observe as células ao microscópio, agite a placa até que estejam uniformemente distribuídas e, em seguida, incube-as na cultura por 24 horas.

3. Co-cultura indireta de células MSC e ARPE19 em um sistema transwell

1. Realize a cultura celular, a rotulagem, a digestão e a contagem conforme descrito nas etapas 2.1 a 2.4.1.
2. Semeie 20.000 células ARPE19 em 1 mL de meio por poço de uma placa de 24 poços.
   NOTA: Neste experimento, usamos células ARPE19 sem mitocôndrias marcadas.
3. Coloque a inserção no poço onde a célula foi semeada.
4. Semeie 10.000 MSCs em 100 μL de meio na câmara celular superior por poço.
5. Repita a etapa 2.5.

4. Coloração do citoesqueleto

NOTA: Proteja da luz durante todo o experimento.

1. Remova o meio das placas de 24 poços. Lave todas as células uma vez com 500 μL/poço de poliformaldeído (PFA) a 4%, adicione 500 μL de PFA fresco a 4% e fixe as amostras por 20 min.
   NOTA: As inserções do sistema de transwell são descartadas.
   NOTA: Como os nanotubos são muito frágeis, lavamos as células diretamente com 4% de PFA em vez de DPBS para maximizar a retenção de nanotubos intactos.
2. Remova o fixador e lave as amostras por 3 x 10 min com DPBS.
3. Adicione 500 μL / poço de solução de bloqueio composta por 0,5% de Triton X-100 (ver Tabela de Materiais) e 4% de albumina de soro bovino (BSA) (ver Tabela de Materiais) e incubar por 1 h em temperatura ambiente.
4. Remova a solução de bloqueio e lave as amostras por 3 x 10 min com DPBS.
5. Preparação da solução de coloração de faloidina (ver Tabela de Materiais)
   NOTA: A excitação e a emissão de faloidina são de 650 nm e 668 nm, respectivamente.
   1. Prepare soluções de estoque dissolvendo o conteúdo do frasco em 150 μL de DMSO anidro para obter uma solução de estoque de 400x.
   2. Prepare a solução de coloração diluindo a solução de armazenamento 400x para 1x com DPBS. Esta é a solução de coloração de faloidina.
6. Adicione 200 μL de solução de coloração de faloidina a cada poço e incube por 1 h em temperatura ambiente.
7. Recupere a solução de coloração e lave a amostra 3 x 10 min com DPBS.
   NOTA: Ao lavar as células com DPBS, será melhor deixar a placa em um shaker.
8. Retire a lamínula com uma agulha de seringa e deixe-a secar ao ar.
   NOTA: O estado ideal é aquele em que nenhum líquido visível pode ser visto na lamínula, mas também não está seco.
9. Aplique uma pequena quantidade de meio de montagem (consulte a Tabela de Materiais) na lâmina e vire cuidadosamente a lamínula na lâmina para garantir que a lamínula cubra uniformemente toda a superfície. Sele as bordas com esmalte.
   NOTA: Aguarde alguns minutos para permitir que o esmalte seque.
10. Captar imediatamente uma imagem confocal ou transferi-la para uma caixa de fatias e guardá-la a 4 °C durante um breve período.
    NOTA: O tempo ideal de armazenamento é de 2 semanas. Se esse tempo for excedido, o efeito de imagem pode se deteriorar.

5. Imagem confocal

NOTA: A imagem confocal é realizada de acordo com o manual de operação e pode variar entre os microscópios. Aqui, damos apenas algumas das etapas principais.

1. Inicie o microscópio confocal e abra quatro canais de laser (405, 488, 561, 640) de acordo com o manual de operação.
2. Acesse o software no computador e execute parametrizações preliminares do software.
   1. Adicione os canais fluorescentes CF-405, CF-488, CF-561 e CF-640 no painel Gerenciamento de processos .
   2. Ajuste o tempo de exposição de cada canal de fluorescência para 200 ms e defina a intensidade de ganho para 2 no painel de controle da câmera .
   3. Ajuste o combinador de laser/LED para um valor de 80.
3. Manipule o painel de controle externo do microscópio para ajustar a lente objetiva para uma ampliação de 20x e certifique-se de que a lente esteja posicionada em sua configuração mais baixa.
4. Posicione a corrediça em uma orientação invertida na mesa do suporte.
5. Ative o laser de 405 nm e manipule o foco usando as espirais de foco grosso e fino. Observe a amostra sob a ocular até que as células fluorescentes azuis sejam visíveis.
6. Selecione Live Imaging na interface do software no computador, alterne para o canal CF-405 e reajuste a hélice de foco fino até que uma imagem distinta das células exibindo fluorescência azul seja visível na tela do computador.
7. Ajuste a lente objetiva para ampliação de 40x e faça a transição para o canal CF-640 e, em seguida, ajuste cuidadosamente o foco até que uma estrutura de microfilamento celular distinta seja visível.
8. Mantendo uma distância focal constante, faça a transição para os canais CF-405, CF-488 e CF-561 sequencialmente e modifique os parâmetros de tempo de exposição ideal, intensidade de ganho e combinador de laser/LED para imagens dentro de cada canal, conforme necessário.
9. Ative a função Pilha de imagens Z e defina os pontos inicial e final do eixo Z manipulando a distância focal para capturar uma imagem com profundidade usando o eixo Z.
10. Clique no botão Iniciar no painel Gerenciamento de processos para tirar uma foto.
11. Selecione 10 campos de exibição aleatoriamente para cada fatia.
    NOTA: Não deve haver sobreposição entre dois campos de visão.
12. Ative a função de lapso de tempo, especificando uma duração total de imagem de 24 h e um intervalo de fotos de 5 min após a identificação do campo de visão desejado.
    NOTA: Para capturar uma sequência de lapso de tempo, é necessário inocular as células em um prato com fundo de vidro e posicioná-las dentro de uma caixa ventilada contendo 5% de gás CO₂ .
13. Salve e exporte todas as imagens.
    NOTA: Para melhorar o escrutínio do TNT e da transferência mitocondrial, foram empregadas imagens de super-resolução. A imagem de super-resolução foi realizada usando HIS-SIM comercializado, denominado HIS-SIM (High Intelligent and Sensitive SIM) fornecido por uma empresa. As imagens foram adquiridas usando uma objetiva de imersão em óleo de 100x/1,5 NA.

6. Análise dos dados

1. Para a análise estatística de cada imagem, quantifique o número total de células, o número de nanotubos, o número de células ARPE19-mito-RFE violeta-positivas, o número de células violeta-positivas exibindo fluorescência verde (representando o número de células ARPE19 com transferência mitocondrial de MSCs) e o número de células violeta-negativas exibindo fluorescência vermelha (representando o número de células MSC com transferência mitocondrial de células ARPE19).
   1. Para quantificar a formação de TNT, calcule a razão entre o número de nanotubos intercelulares e o número total de células.
   2. Calcule a taxa de transferência mitocondrial como a razão entre o número de células violeta-positivas exibindo fluorescência verde e o número total de células violeta-positivas (representando a transferência mitocondrial de MSCs para células ARPE19) ou a razão entre o número de células violeta-negativas exibindo fluorescência vermelha e o número total de células violeta-negativas (representando a transferência mitocondrial de células ARPE19 para MSCs).

Resultados

O diagrama esquemático que ilustra a co-cultura direta de células-tronco mesenquimais (MSC) e células ARPE19 é representado na Figura 1. MSCs, projetadas para expressar mito-GFP, como células doadoras e células ARPE19-mito-RFP com membranas citoplasmáticas marcadas com violeta como células receptoras foram co-cultivadas na proporção de 1:1. Após um período de co-cultura de 24 horas, as células foram coradas para faloidina e examinadas por micros...

Discussão

Numerosos estudos demonstraram que o fenômeno da transferência mitocondrial mediada por TNT é um processo fisiológico prevalente em vários tipos de células teciduais 10,11,12,13. A doação mitocondrial funcional de CTMs para células com disfunção mitocondrial exibe forte potencial terapêutico...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110
6-well plate	NEST	703001
15 mL centrifuge tube	BD Falcon	352097
24-well plate	NEST	702001
ARPE19 cells	ATCC	CRL-2302	Cell lines
Bovine serum albumin (BSA)	Beyotime	ST025
CellTrace violet	Invitrogen	C34557
Cover slide	NEST	801007
DMSO	sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
DMEM/F-12-GlutaMAX	Gibco	10565-042
Fetal Bovine Serum (FBS)	VivaCell	C04002-500
FluorSave Reagent	Millipore	345789
MSCs	Nuwacell	RC02003	Cell lines
ncMission	Shownin	RP02010
Pen Strep	Gibco	15140-122
pCT-Mito-GFP	SBI	CYTO102-PA-1	Plasmid; From  https://www.systembio.com/mitochondria-cyto-tracer-pct-mito-gfp-cmv
Puromycin	MCE	HY-B1743A
Pipette	Axygen	TF-1000-R-S
Phalloidin	Invitrogen	A22287
Triton X-100	Solarbio	T8200
Transwell plate	Corning	3470