Transferência mitocondrial via nanotubos de tunelamento entre células-tronco mesenquimais e epitélio pigmentar da retina in vitro

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo incluindo rastreamento mitocondrial, procedimentos diretos de co-cultura de células-tronco mesenquimais (MSCs) e células epiteliais pigmentares da retina (ARPE19), bem como os métodos para observar e analisar estatisticamente a formação de nanotubos de tunelamento (TNT) e a transferência mitocondrial para caracterizar a troca mitocondrial via TNTs entre MSCs e células ARPE19.

Resumo

A transferência mitocondrial é um fenômeno fisiológico normal que ocorre amplamente entre vários tipos de células. No estudo até o momento, a via mais importante para o transporte mitocondrial é através de nanotubos de tunelamento (TNTs). Muitos estudos relataram que as células-tronco mesenquimais (MSCs) podem transferir mitocôndrias para outras células por TNTs. No entanto, poucos estudos demonstraram o fenômeno da transferência mitocondrial bidirecional. Aqui, nosso protocolo descreve uma abordagem experimental para estudar o fenômeno da transferência mitocondrial entre MSCs e células epiteliais pigmentares da retina in vitro por dois métodos de rastreamento mitocondrial.

Co-cultivamos MSCs transfectadas com mito-GFP com células ARPE19 transfectadas com mito-RFP (uma linha de células epiteliais pigmentares da retina) por 24 h. Em seguida, todas as células foram coradas com faloidina e visualizadas por microscopia confocal. Observamos mitocôndrias com fluorescência verde em células ARPE19 e mitocôndrias com fluorescência vermelha em MSCs, indicando que a transferência mitocondrial bidirecional ocorre entre MSCs e células ARPE19. Esse fenômeno sugere que o transporte mitocondrial é um fenômeno fisiológico normal que também ocorre entre MSCs e células ARPE19, e a transferência mitocondrial de MSCs para células ARPE19 ocorre com muito mais frequência do que vice-versa. Nossos resultados indicam que as MSCs podem transferir mitocôndrias para o epitélio pigmentar da retina e, da mesma forma, preveem que as MSCs podem cumprir seu potencial terapêutico por meio do transporte mitocondrial no epitélio pigmentar da retina no futuro. Além disso, a transferência mitocondrial de células ARPE19 para MSCs ainda precisa ser mais explorada.

Introdução

As mitocôndrias servem como fonte primária de energia para a maioria dos tipos de células, com a disfunção mitocondrial afetando particularmente tecidos de alta demanda de energia, como a retina¹. Alterações metabólicas na retina podem desencadear uma crise bioenergética, resultando na morte de fotorreceptores e/ou células^EPR2. As terapias baseadas em células-tronco mesenquimais (CTM) têm demonstrado eficácia no tratamento da degeneração ocular, e um dos mecanismos precisos subjacentes aos efeitos benéficos das CTMs nos tecidos da retina pode ser atribuído à transferência mitocondrial fu....

Protocolo

1. Geração de linhagens celulares MSC-mito-GFP e ARPE19-mito-RFP

1. Cultura de células
   NOTA: Apenas MSCs são usados aqui como exemplo.
   1. Cultive MSCs humanas em uma placa de 6 poços em meio hMSC com 1% de penicilina e estreptomicina (ver Tabela de Materiais) até que a densidade celular atinja 80% -90%. Dependendo da densidade de crescimento celular, troque o meio uma vez a cada 2-3 dias.
      1. Remova o meio original e lave as células uma vez com solução salina tamponada com fosfato (DPBS) (consulte a Tabela de Materiais). Adicione 1 mL da mistura de tripsina-EDTA-DPBS ....

Discussão

Numerosos estudos demonstraram que o fenômeno da transferência mitocondrial mediada por TNT é um processo fisiológico prevalente em vários tipos de células teciduais 10,11,12,13. A doação mitocondrial funcional de CTMs para células com disfunção mitocondrial exibe forte potencial terapêutico.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110
6-well plate	NEST	703001
15 mL centrifuge tube	BD Falcon	352097
24-well plate	NEST	702001
ARPE19 cells	ATCC	CRL-2302	Cell lines
Bovine serum albumin (BSA)	Beyotime	ST025
CellTrace violet	Invitrogen	C34557
Cover slide	NEST	801007
DMSO	sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
DMEM/F-12-GlutaMAX	Gibco	10565-042
Fetal Bovine Serum (FBS)	VivaCell	C04002-500
FluorSave Reagent	Millipore	345789
MSCs	Nuwacell	RC02003	Cell lines
ncMission	Shownin	RP02010
Pen Strep	Gibco	15140-122
pCT-Mito-GFP	SBI	CYTO102-PA-1	Plasmid; From  https://www.systembio.com/mitochondria-cyto-tracer-pct-mito-gfp-cmv
Puromycin	MCE	HY-B1743A
Pipette	Axygen	TF-1000-R-S
Phalloidin	Invitrogen	A22287
Triton X-100	Solarbio	T8200
Transwell plate	Corning	3470