중간엽 줄기 세포와 망막 색소 상피 사이의 터널링 나노튜브를 통한 미토콘드리아 전달 in vitro

요약

여기에서는 미토콘드리아 추적, 중간엽 줄기 세포(MSC) 및 망막 색소 상피 세포(ARPE19)의 직접 공동 배양 절차, MSC와 ARPE19 세포 간의 TNT를 통한 미토콘드리아 교환을 특성화하기 위해 터널링 나노튜브(TNT) 형성 및 미토콘드리아 전달을 관찰하고 통계적으로 분석하는 방법을 포함한 프로토콜을 제시합니다.

초록

미토콘드리아 전달은 다양한 유형의 세포에서 널리 발생하는 정상적인 생리적 현상입니다. 현재까지의 연구에서 미토콘드리아 수송을 위한 가장 중요한 경로는 터널링 나노튜브(TNT)를 통하는 것입니다. 중간엽 줄기 세포(MSC)가 TNT에 의해 미토콘드리아를 다른 세포로 전달할 수 있다고 보고한 많은 연구가 있습니다. 그러나 양방향 미토콘드리아 전달 현상을 입증한 연구는 거의 없습니다. 여기에서 우리의 프로토콜은 두 가지 미토콘드리아 추적 방법을 통해 MSC 와 망막 색소 상피 세포 간의 미토콘드리아 전달 현상을 시험관 내에서 연구하기 위한 실험적 접근 방식을 설명합니다.

mito-GFP 형질주입된 MSC를 mito-RFP-형질주입된 ARPE19 세포(망막 색소 상피 세포주)와 24시간 동안 공동 배양했습니다. 그런 다음 모든 세포를 팔로이딘으로 염색하고 컨포칼 현미경으로 이미지화했습니다. ARPE19 세포에서 녹색 형광을 가진 미토콘드리아와 MSC에서 적색 형광을 가진 미토콘드리아를 관찰했는데, 이는 MSC와 ARPE19 세포 간에 양방향 미토콘드리아 전달이 발생한다는 것을 나타냅니다. 이 현상은 미토콘드리아 전달이 MSC와 ARPE19 세포 사이에서도 발생하는 정상적인 생리적 현상이며, MSC에서 ARPE19 세포로의 미토콘드리아 전달이 그 반대의 경우보다 훨씬 더 자주 발생한다는 것을 시사합니다. 본 연구의 결과는 MSC가 미토콘드리아를 망막 색소 상피로 전달할 수 있음을 시사하며, 향후 MSC가 망막 색소 상피에서 미토콘드리아 수송을 통해 치료 잠재력을 발휘할 수 있을 것으로 예측합니다. 또한 ARPE19 세포에서 MSC로의 미토콘드리아 전달은 아직 더 연구되지 않았습니다.

서문

미토콘드리아는 대부분의 세포 유형에서 주요 에너지원 역할을 하며, 미토콘드리아 기능 장애는 특히 망막과 같은 고에너지 요구 조직에 영향을 미칩니다¹. 망막의 대사 변화는 생체 에너지 위기를 유발할 수 있으며, 궁극적으로 광수용체 및/또는 RPE 세포의 사멸을 초래할 수 있습니다². 중간엽 줄기 세포(MSC) 기반 치료법은 안구 변성 치료에 효능이 있는 것으로 입증되었으며, MSC가 망막 조직에 미치는 유익한 효과의 기저에 있는 정확한 메커니즘 중 하나는 기능적 미토콘드리아 전달에 기인할 수 있습니다 3,4,5,6. 2004년 Rustom 등은 터널링 나노튜브(TNT^)에 의해 촉진되는 새로운 세포 간 상호 작용을 통한 미토콘드리아 전달 현상을 처음으로 보고했습니다7.

2D 배양에서 터널링 나노튜브(TNT)는 길이가 수십 나노미터에서....

프로토콜

1. MSC-mito-GFP 및 ARPE19-mito-RFP 세포주 생성

1. 세포 배양
   참고: 여기서는 MSC만 예로 사용됩니다.
   1. 세포 밀도가 80%-90%에 도달할 때까지 1% 페니실린과 스트렙토마이신( 재료 표 참조)이 있는 hMSC 배지의 6웰 플레이트에서 인간 MSC를 배양합니다. 세포 성장의 밀도에 따라 2-3일에 한 번씩 배지를 교체하십시오.
      1. 원래 매체를 제거하고 인산염 완충 식염수(DPBS)로 세포를 한 번 세척합니다( 재료 표 참조). 트립신-EDTA-DPBS 혼합물 1mL(0.05% 트립신-EDTA: DPBS로 1:5 비율로 희석한 0.25% 트립신-EDTA, 재료 표 참조)를 넣고 37°C 인큐베이터에서 3-4분(세포에 따라 다름) 동안 배양합니다.
         알림: 현미경으로 세포 소화를 관찰하고 대부분의 세포가 둥글고 분리된 경우 소화를 중지하십시오.
      2. 6웰 플레이트를 가볍게 두드려 표면에 부착된 세포를 분리한 다음 1mL의 새로운 완전한 배지를 추가하여 분해를 종료합니다.
      3. 피펫 건으로 모든 세포를 부드럽게 재현....

토론

수많은 연구에서 TNT 매개 미토콘드리아 전달 현상이 다양한 유형의 조직 세포에서 널리 퍼져 있는 생리학적 과정임을 입증했습니다 10,11,12,13. MSC에서 미토콘드리아 기능 장애가 있는 세포로의 기능적 미토콘드리아 기증은 강력한 치료 잠재력을 나타냅니다.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110
6-well plate	NEST	703001
15 mL centrifuge tube	BD Falcon	352097
24-well plate	NEST	702001
ARPE19 cells	ATCC	CRL-2302	Cell lines
Bovine serum albumin (BSA)	Beyotime	ST025
CellTrace violet	Invitrogen	C34557
Cover slide	NEST	801007
DMSO	sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
DMEM/F-12-GlutaMAX	Gibco	10565-042
Fetal Bovine Serum (FBS)	VivaCell	C04002-500
FluorSave Reagent	Millipore	345789
MSCs	Nuwacell	RC02003	Cell lines
ncMission	Shownin	RP02010
Pen Strep	Gibco	15140-122
pCT-Mito-GFP	SBI	CYTO102-PA-1	Plasmid; From  https://www.systembio.com/mitochondria-cyto-tracer-pct-mito-gfp-cmv
Puromycin	MCE	HY-B1743A
Pipette	Axygen	TF-1000-R-S
Phalloidin	Invitrogen	A22287
Triton X-100	Solarbio	T8200
Transwell plate	Corning	3470