중간엽 줄기 세포와 망막 색소 상피 사이의 터널링 나노튜브를 통한 미토콘드리아 전달 in vitro

요약

여기에서는 미토콘드리아 추적, 중간엽 줄기 세포(MSC) 및 망막 색소 상피 세포(ARPE19)의 직접 공동 배양 절차, MSC와 ARPE19 세포 간의 TNT를 통한 미토콘드리아 교환을 특성화하기 위해 터널링 나노튜브(TNT) 형성 및 미토콘드리아 전달을 관찰하고 통계적으로 분석하는 방법을 포함한 프로토콜을 제시합니다.

초록

미토콘드리아 전달은 다양한 유형의 세포에서 널리 발생하는 정상적인 생리적 현상입니다. 현재까지의 연구에서 미토콘드리아 수송을 위한 가장 중요한 경로는 터널링 나노튜브(TNT)를 통하는 것입니다. 중간엽 줄기 세포(MSC)가 TNT에 의해 미토콘드리아를 다른 세포로 전달할 수 있다고 보고한 많은 연구가 있습니다. 그러나 양방향 미토콘드리아 전달 현상을 입증한 연구는 거의 없습니다. 여기에서 우리의 프로토콜은 두 가지 미토콘드리아 추적 방법을 통해 MSC 와 망막 색소 상피 세포 간의 미토콘드리아 전달 현상을 시험관 내에서 연구하기 위한 실험적 접근 방식을 설명합니다.

mito-GFP 형질주입된 MSC를 mito-RFP-형질주입된 ARPE19 세포(망막 색소 상피 세포주)와 24시간 동안 공동 배양했습니다. 그런 다음 모든 세포를 팔로이딘으로 염색하고 컨포칼 현미경으로 이미지화했습니다. ARPE19 세포에서 녹색 형광을 가진 미토콘드리아와 MSC에서 적색 형광을 가진 미토콘드리아를 관찰했는데, 이는 MSC와 ARPE19 세포 간에 양방향 미토콘드리아 전달이 발생한다는 것을 나타냅니다. 이 현상은 미토콘드리아 전달이 MSC와 ARPE19 세포 사이에서도 발생하는 정상적인 생리적 현상이며, MSC에서 ARPE19 세포로의 미토콘드리아 전달이 그 반대의 경우보다 훨씬 더 자주 발생한다는 것을 시사합니다. 본 연구의 결과는 MSC가 미토콘드리아를 망막 색소 상피로 전달할 수 있음을 시사하며, 향후 MSC가 망막 색소 상피에서 미토콘드리아 수송을 통해 치료 잠재력을 발휘할 수 있을 것으로 예측합니다. 또한 ARPE19 세포에서 MSC로의 미토콘드리아 전달은 아직 더 연구되지 않았습니다.

서문

미토콘드리아는 대부분의 세포 유형에서 주요 에너지원 역할을 하며, 미토콘드리아 기능 장애는 특히 망막과 같은 고에너지 요구 조직에 영향을 미칩니다¹. 망막의 대사 변화는 생체 에너지 위기를 유발할 수 있으며, 궁극적으로 광수용체 및/또는 RPE 세포의 사멸을 초래할 수 있습니다². 중간엽 줄기 세포(MSC) 기반 치료법은 안구 변성 치료에 효능이 있는 것으로 입증되었으며, MSC가 망막 조직에 미치는 유익한 효과의 기저에 있는 정확한 메커니즘 중 하나는 기능적 미토콘드리아 전달에 기인할 수 있습니다 3,4,5,6. 2004년 Rustom 등은 터널링 나노튜브(TNT^)에 의해 촉진되는 새로운 세포 간 상호 작용을 통한 미토콘드리아 전달 현상을 처음으로 보고했습니다7.

2D 배양에서 터널링 나노튜브(TNT)는 길이가 수십 나노미터에서 수백 나노미터에 이르는 얇은(20-700nm) 막 돌출부로 식별되며, 이는 기판 위에 매달려 두 개 이상의 동형 및 이형 세포 사이에 직접 연결을 설정할 수 있습니다. 이러한 구조는 F-액틴이 현저히 풍부하며 세포 간 미토콘드리아와 같은 화물의 수송을 용이하게 합니다. 또한, TNT는 양쪽 끝에 개구부를 가지고 있어 상호 연결된 세포 사이의 세포질 함량의 연속성을 가능하게 한다⁸.

TNT 매개 미토콘드리아 전달은 조밀한 세포 배열과 미토콘드리아 추적의 어려움으로 인해 생체 내에서 검출하기 어렵습니다. 세포 공동 배양 및 미토콘드리아 추적 기술을 활용한 시험관 내 실험을 통해 TNT 형성 및 미토콘드리아 전달을 관찰할 수 있습니다 ^8,9. 또한 시험관 내에서 MSC와 망막 색소 상피 세포를 공동 배양하여 TNT 매개 미토콘드리아 전달 현상을 관찰했습니다 ¹⁰.

이전의 많은 연구에서는 MSC에서 다른 세포로의 단방향 미토콘드리아 전달만 관찰했습니다 3,4,5,6. 이전에는 mito-tracker green과 mito-tracker red로 각각 라벨링된 두 종류의 세포를 사용하여 양방향 미토콘드리아 전달을 분석하려고 했지만 염료의 누화가 실험 결과를 방해했습니다. 미토콘드리아 양방향 전달을 보다 정밀하게 연구하기 위해 렌티바이러스 형광 기법을 이용하여 미토콘드리아 형광이 다른 두 개의 세포주를 구축한 후, 직접 공동 배양(direct co-culture in vitro)에 의해 TNT 형성 및 미토콘드리아 양방향 전달 현상을 관찰하고 분석하였습니다.

간단히 말해서, 미토콘드리아를 추적하고, MSC를 ARPE19 세포와 공동 배양하고, TNT 형성 및 미토콘드리아 전달을 분석하는 방법에 대한 단계적이고 실행 가능한 프로토콜이 여기에 설명되어 있습니다. 이 실험의 결과는 TNT 매개 양방향 미토콘드리아 전달을 입증했으며, 이는 미토콘드리아 전달이 일반적인 생리학적 현상임을 증명했을 뿐만 아니라 망막 세포에 대한 MSC의 잠재적인 치료 능력을 보여주었습니다.

프로토콜

1. MSC-mito-GFP 및 ARPE19-mito-RFP 세포주 생성

1. 세포 배양
   참고: 여기서는 MSC만 예로 사용됩니다.
   1. 세포 밀도가 80%-90%에 도달할 때까지 1% 페니실린과 스트렙토마이신( 재료 표 참조)이 있는 hMSC 배지의 6웰 플레이트에서 인간 MSC를 배양합니다. 세포 성장의 밀도에 따라 2-3일에 한 번씩 배지를 교체하십시오.
      1. 원래 매체를 제거하고 인산염 완충 식염수(DPBS)로 세포를 한 번 세척합니다( 재료 표 참조). 트립신-EDTA-DPBS 혼합물 1mL(0.05% 트립신-EDTA: DPBS로 1:5 비율로 희석한 0.25% 트립신-EDTA, 재료 표 참조)를 넣고 37°C 인큐베이터에서 3-4분(세포에 따라 다름) 동안 배양합니다.
         알림: 현미경으로 세포 소화를 관찰하고 대부분의 세포가 둥글고 분리된 경우 소화를 중지하십시오.
      2. 6웰 플레이트를 가볍게 두드려 표면에 부착된 세포를 분리한 다음 1mL의 새로운 완전한 배지를 추가하여 분해를 종료합니다.
      3. 피펫 건으로 모든 세포를 부드럽게 재현탁시킨 후 수집된 모든 세포를 15mL 원심분리 튜브에 옮깁니다.
      4. 200× g 에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다.
      5. 상층액을 흡인하고 1mL의 신선한 배지를 추가하여 세포를 재현탁시킵니다. 세포 계수를 위해 10μL의 세포 현탁액을 사용합니다.
      6. 렌티바이러스 transfection 18-24시간 전에 MSC 세포를 6-well 플레이트에 웰당 1 × 10⁵ cell의 밀도로 시드하여 transfection 시 세포 밀도가 약 50%가 되도록 합니다.
2. 렌티바이러스의 형질주입
   주의: 렌티바이러스 transfection과 관련된 모든 작업은 생물안전 작업대에서 수행해야 합니다.
   1. 다음 날 초기 배지를 2mL의 새 배지로 교체하고 25μL의 렌티바이러스 현탁액(5.00E+08TU/mL)을 보조제와 함께 첨가한 후 37°C에서 배양합니다.
      참고: 렌티바이러스 패키징은 회사에서 Mito-GFP(pCT-Mito-copGFP) 플라스미드( 재료 표 및 보충 그림 S1 참조)를 사용하여 수행했습니다.
   2. 배양 6시간 후 바이러스 함유 배지를 2mL의 새 배지로 교체합니다. 하루에 한 번 배지를 계속 배양하고 교체하십시오.
      참고: transfection 48시간 후 MSC에서 유의한 미토콘드리아 형광 발현이 관찰되었으며, 72시간 시점에서 추가적인 개선이 분명합니다.
   3. 형질주입 2일 후 배양액에 퓨로마이신(1μg/mL)을 보충하여 성공적으로 형질주입된 세포를 스크리닝합니다. 동시에, 대조군으로 바이러스 transfection이 없는 중간엽 줄기세포에 동일한 농도의 puromycin을 추가합니다.
      참고: mito-GFP 바이러스 벡터는 puromycin 내성 유전자를 포함하도록 설계되었습니다.
   4. 퓨로마이신(puromycin, 1 μg/mL)을 주입하여 매일 배지를 교체하십시오. 대조군에서 거의 완전한 세포 사멸 시 puromycin 추가를 중단하십시오.
      참고: 배지에는 이 농도의 퓨로마이신이 포함되어 있지 않습니다. 퓨로마이신의 첨가는 배지가 6-웰 플레이트에 첨가될 때만 필요합니다.
   5. 세포가 통과하고 얼릴 때까지 퓨로마이신 없이 계속 배양합니다. 이 유형의 셀의 이름을 MSC-mito-GFP로 지정합니다.
      참고: ARPE19 세포는 ATCC Cell Bank에서 유래하여 10% FBS와 1% 페니실린 및 스트렙토마이신을 함유한 DMEM/F12에서 배양되었으며( 재료 표 참조), 이들의 분해 및 통과 방법은 MSC와 동일합니다. 플라스미드 Mito-RFP는 회사에 의해 Mito-GFP에서 변형되었습니다. 마지막으로, 성공적으로 transfection된 세포의 이름을 ARPE19-mito-RFP로 지정했습니다.

2. MSC 및 ARPE19 세포의 직접 공동 배양

참고: 이 공동 배양 시스템에서 MSC-mito-GFP 세포는 공여 세포 역할을 하고 ARPE19-mito-RFP 세포는 수용 세포 역할을 합니다. 기증자 세포와 수혜자 세포를 구별하기 위해 수혜자 세포를 추적했습니다.

1. 세포질막에서 CellTrace Violet( 재료 표 참조)으로 ARPE19-mito-RFP 세포를 라벨링합니다.
   참고: CellTrace violet 염료의 여기와 방출은 각각 405nm와 450nm입니다.
   1. CellTrace Violet Reagent 바이알에 20μL의 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 첨가하고 사용 직전에 잘 혼합하여 CellTrace Violet( 재료 표 참조) 스톡 용액을 준비합니다.
   2. ARPE19-mito-RFP 세포를 80%-90%의 원하는 밀도로 성장시킵니다.
   3. CellTrace Violet 스톡 용액을 예열된(37°C) DPBS에 희석하여 원하는 작업 농도(1:1,000)로 만듭니다. 이것이 로딩 솔루션입니다.
      참고: CellTrace Violet의 희석은 DPBS로 수행해야 하며 배양 배지로 교체하면 매우 좋지 않은 염색 결과가 발생할 수 있습니다.
   4. 배양 배지를 제거하고 1mL의 로딩 용액으로 교체합니다. 37°C에서 10분 동안 세포를 배양합니다.
      알림: 조건이 허용하는 경우 5분 후에 형광 현미경으로 염색을 관찰할 수 있습니다. 일부 세포는 DPBS에 장기간 노출되는 것을 견디지 못할 수 있으므로 원하는 결과를 얻는 즉시 염색을 종료할 수 있습니다.
   5. 로딩 용액을 제거하고 DPBS로 세포를 2회 세척한 다음 2mL의 신선한 완전한 배지로 교체합니다. 염색 후 최소 10분 동안 세포를 배양하여 CellTrace Violet이 아세테이트 가수분해를 할 수 있도록 합니다.
      참고: 이 단계는 세포가 최적의 상태로 돌아가고 후속 실험을 방해하지 않도록 하는 데 필요합니다.
2. 각 웰에 24μL의 DPBS를 추가하여 50웰 플레이트를 준비합니다. 그런 다음 커버 유리(지정된 직경 15mm)( 재료 표 참조)를 플레이트에 삽입하고 1분 동안 가라앉힙니다. 덮개 슬라이드가 접시 바닥에 가깝게 오도록 음압을 사용하여 우물에서 DPBS를 제거합니다.
3. 1.1.1단계에서 설명한 대로 donor MSC 및 recipient ARPE19 세포를 trypsinize합니다.
4. 세포 계수
   1. 계수를 위해 10μL의 세포 현탁액을 계수 플레이트에 놓습니다.
      알림: 셀의 밀도가 너무 높으면 매체로 10배 희석한 후 위와 같이 진행할 수 있습니다.
   2. 10,000개의 MSC와 10,000개의 ARPE19 세포를 24웰 플레이트의 웰당 500μL의 배지에 파종합니다. 24웰 플레이트에 추가하기 전에 세포를 잘 섞습니다. A/mL의 MSC 계수와 B/mL의 ARPE19 세포 계수를 감안할 때 아래 표시된 계산을 참조하십시오.
      참고: 4웰의 경우 2mL의 배지에 40,000개의 MSC 및 40,000개의 ARPE19 세포가 필요합니다.
      40,000개의 MSC를 포함하는 MSC 현탁액(C)의 부피 = 40,000/A μL
      40,000 MSC를 포함하는 ARPE19 현탁액(D)의 부피 = 40,000/B μL
      2 - (C + D) mL의 배지로 부피를 2mL로 구성합니다.
5. 현미경으로 세포를 관찰하고 세포가 고르게 분포될 때까지 플레이트를 흔든 다음 24시간 동안 배양액에서 배양합니다.

3. 트랜스웰 시스템에서 MSC 및 ARPE19 세포의 간접 공동 배양

1. 2.1 - 2.4.1단계에 설명된 대로 세포 배양, 라벨링, 분해 및 계수를 수행합니다.
2. 24웰 플레이트의 웰당 1mL의 배지에 20,000개의 ARPE19 세포를 파종합니다.
   참고: 이 실험에서는 표지된 미토콘드리아가 없는 ARPE19 세포를 사용했습니다.
3. 세포가 파종된 우물에 삽입물을 놓습니다.
4. 웰당 상부 세포 챔버의 100μL 배지에 10,000개의 MSC를 파종합니다.
5. 2.5단계를 반복합니다.

4. 세포골격 염색

알림: 실험 내내 빛으로부터 보호하십시오.

1. 24웰 플레이트에서 매체를 제거합니다. 모든 세포를 4% 폴리포름알데히드(PFA) 500μL/웰로 한 번 세척하고 500μL의 신선한 4% PFA를 추가한 다음 샘플을 20분 동안 고정합니다.
   알림: 트랜스웰 시스템의 삽입물은 폐기됩니다.
   참고: 나노튜브는 매우 깨지기 쉽기 때문에 온전한 나노튜브의 머무름을 최대화하기 위해 DPBS 대신 4% PFA로 세포를 직접 세척했습니다.
2. 정착제를 제거하고 DPBS로 3 x 10분 동안 샘플을 세척합니다.
3. 0.5% Triton X-100( 재료 표 참조) 및 4% 소 혈청 알부민(BSA)( 재료 표 참조)으로 구성된 500μL/웰의 차단 용액을 추가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
4. 차단 용액을 제거하고 DPBS로 3 x 10분 동안 샘플을 세척합니다.
5. 팔로이딘 염색 용액의 준비( 재료 표 참조)
   참고: 팔로이딘의 여기와 방출은 각각 650nm와 668nm입니다.
   1. 바이알 내용물을 150μL의 무수 DMSO에 용해시켜 400x 스톡 용액을 수득하여 스톡 용액을 준비합니다.
   2. DPBS로 400x 저장 용액을 1배로 희석하여 염색 용액을 준비합니다. 이것은 팔로이딘 염색 용액입니다.
6. 각 웰에 200μL의 팔로이딘 염색 용액을 추가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
7. 염색 용액을 회수하고 DPBS로 샘플을 3 x 10분 동안 세척합니다.
   알림: DPBS로 셀을 세척할 때는 플레이트를 셰이커에 올려 두는 것이 좋습니다.
8. 주사기 바늘로 커버 유리를 골라내고 자연 건조시킵니다.
   알림: 최적의 상태는 커버 유리에 눈에 보이는 액체가 보이지 않지만 건조하지 않은 상태입니다.
9. 슬라이드에 소량의 장착 매체( 재료 표 참조)를 적용하고 슬라이드의 커버 유리를 조심스럽게 뒤집어 매체가 전체 표면을 고르게 코팅하도록 합니다. 매니큐어로 가장자리를 밀봉하십시오.
   알림: 매니큐어가 마를 때까지 몇 분 동안 기다리십시오.
10. 컨포칼 이미지를 즉시 캡처하거나 슬라이스 박스로 옮겨 4°C에서 잠시 동안 보관할 수 있습니다.
    알림: 이상적인 보관 시간은 2주입니다. 이 시간을 초과하면 이미징 효과가 저하될 수 있습니다.

5. 공초점 이미징

알림: 컨포칼 이미징은 사용 설명서에 따라 수행되며 현미경마다 다를 수 있습니다. 여기에서는 몇 가지 주요 단계만 제공합니다.

1. 컨포칼 현미경을 시작하고 사용 설명서에 따라 4개의 레이저 채널(405, 488, 561, 640)을 엽니다.
2. 컴퓨터에서 소프트웨어에 액세스하고 소프트웨어의 예비 매개변수화를 수행합니다.
   1. 공정 관리 패널에 형광 채널 CF-405, CF-488, CF-561 및 CF-640을 추가합니다.
   2. 카메라 제어판에서 각 형광 채널의 노출 시간을 200ms로 조정하고 게인 강도를 2로 설정합니다.
   3. 레이저/LED 결합기를 80 값으로 조정합니다.
3. 현미경의 외부 제어판을 조작하여 대물 렌즈를 20배 배율로 조정하고 렌즈가 가장 낮은 설정에 위치하도록 합니다.
4. 슬라이드를 캐리어 테이블에 반전된 방향으로 놓습니다.
5. 405nm 레이저를 활성화하고 거칠고 미세한 초점 나선을 사용하여 초점을 조작합니다. 파란색 형광 세포가 보일 때까지 접안렌즈 아래의 샘플을 관찰합니다.
6. 컴퓨터의 소프트웨어 인터페이스에서 Live Imaging 을 선택하고 CF-405 채널로 전환한 다음 청색 형광을 나타내는 세포의 뚜렷한 이미지가 컴퓨터 화면에 보일 때까지 미세 초점 나선을 다시 조정합니다.
7. 대물 렌즈를 40x 배율로 조정하고 CF-640 채널로 전환한 다음 뚜렷한 세포 마이크로필라멘트 구조가 보일 때까지 초점을 조심스럽게 조정합니다.
8. 일정한 초점 거리를 유지하고, CF-405, CF-488 및 CF-561 채널로 순차적으로 전환하고, 필요에 따라 각 채널 내 이미징을 위한 최적의 노출 시간, 게인 강도 및 레이저/LED 결합기의 매개변수를 수정합니다.
9. Z 이미지 스택 기능을 활성화하고 Z축을 사용하여 깊이가 있는 이미지를 캡처하도록 초점 거리를 조작하여 Z축의 시작점과 끝점을 정의합니다.
10. 프로세스 관리 패널에서 시작 버튼을 클릭하여 사진을 찍습니다.
11. 각 조각에 대해 임의로 10개의 보기 필드를 선택합니다.
    참고: 두 시야 사이에 겹치는 부분이 없어야 합니다.
12. 타임랩스 기능을 활성화하여 원하는 시야를 식별한 후 총 이미징 지속 시간을 24시간으로, 사진 간격을 5분으로 지정합니다.
    알림: 타임랩스 시퀀스를 캡처하려면 바닥이 유리로 된 접시에 세포를 접종하고 5% CO₂ 가스가 들어 있는 환기 상자 안에 넣어야 합니다.
13. 모든 이미지를 저장하고 내보냅니다.
    참고: TNT와 미토콘드리아 전달에 대한 정밀 조사를 강화하기 위해 초고해상도 이미징이 사용되었습니다. 초고해상도 이미징은 회사에서 제공한 HIS-SIM(High Intelligent and Sensitive SIM)이라는 상용화된 HIS-SIM을 사용하여 수행되었습니다. 이미지는 100x/1.5 NA 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 획득했습니다.

6. 데이터 분석

1. 각 이미지의 통계적 분석을 위해 총 세포 수, 나노튜브 수, 보라색 양성 ARPE19-mito-RFE 세포의 수, 녹색 형광을 나타내는 보라색 양성 세포의 수(MSC에서 미토콘드리아 전달이 있는 ARPE19 세포의 수를 나타냄) 및 적색 형광을 나타내는 보라색 음성 세포의 수(ARPE19 세포에서 미토콘드리아 전달이 있는 MSC 세포의 수를 나타냄)를 정량화합니다.
   1. TNT 형성을 정량화하려면 총 세포 수에 대한 세포 간 나노튜브 수의 비율을 계산합니다.
   2. 미토콘드리아 전달 속도를 녹색 형광을 나타내는 보라색 양성 세포의 수와 보라색 양성 세포의 총 수(MSC에서 ARPE19 세포로의 미토콘드리아 전달을 나타냄)의 비율 또는 총 보라색 음성 세포 수(ARPE19 세포에서 MSC로의 미토콘드리아 전달을 나타냄)에 대한 적색 형광을 나타내는 보라색 음성 세포의 수의 비율로 계산합니다.

결과

중간엽 줄기 세포(MSC)와 ARPE19 세포의 직접적인 공동 배양을 보여주는 개략도는 그림 1에 나와 있습니다. mito-GFP를 공여세포로 발현하도록 조작된 MSCs와 수혈세포로서 보라색 표지된 세포질막을 가진 ARPE19-mito-RFP 세포를 1:1의 비율로 공동 배양했습니다. 24시간의 공동 배양 기간 후, 세포를 팔로이딘에 대해 염색하고 공초점 현미경을 사용하여 검사했?...

토론

수많은 연구에서 TNT 매개 미토콘드리아 전달 현상이 다양한 유형의 조직 세포에서 널리 퍼져 있는 생리학적 과정임을 입증했습니다 10,11,12,13. MSC에서 미토콘드리아 기능 장애가 있는 세포로의 기능적 미토콘드리아 기증은 강력한 치료 잠재력을 나타냅니다...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110
6-well plate	NEST	703001
15 mL centrifuge tube	BD Falcon	352097
24-well plate	NEST	702001
ARPE19 cells	ATCC	CRL-2302	Cell lines
Bovine serum albumin (BSA)	Beyotime	ST025
CellTrace violet	Invitrogen	C34557
Cover slide	NEST	801007
DMSO	sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
DMEM/F-12-GlutaMAX	Gibco	10565-042
Fetal Bovine Serum (FBS)	VivaCell	C04002-500
FluorSave Reagent	Millipore	345789
MSCs	Nuwacell	RC02003	Cell lines
ncMission	Shownin	RP02010
Pen Strep	Gibco	15140-122
pCT-Mito-GFP	SBI	CYTO102-PA-1	Plasmid; From  https://www.systembio.com/mitochondria-cyto-tracer-pct-mito-gfp-cmv
Puromycin	MCE	HY-B1743A
Pipette	Axygen	TF-1000-R-S
Phalloidin	Invitrogen	A22287
Triton X-100	Solarbio	T8200
Transwell plate	Corning	3470