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여기에서는 미토콘드리아 추적, 중간엽 줄기 세포(MSC) 및 망막 색소 상피 세포(ARPE19)의 직접 공동 배양 절차, MSC와 ARPE19 세포 간의 TNT를 통한 미토콘드리아 교환을 특성화하기 위해 터널링 나노튜브(TNT) 형성 및 미토콘드리아 전달을 관찰하고 통계적으로 분석하는 방법을 포함한 프로토콜을 제시합니다.
미토콘드리아 전달은 다양한 유형의 세포에서 널리 발생하는 정상적인 생리적 현상입니다. 현재까지의 연구에서 미토콘드리아 수송을 위한 가장 중요한 경로는 터널링 나노튜브(TNT)를 통하는 것입니다. 중간엽 줄기 세포(MSC)가 TNT에 의해 미토콘드리아를 다른 세포로 전달할 수 있다고 보고한 많은 연구가 있습니다. 그러나 양방향 미토콘드리아 전달 현상을 입증한 연구는 거의 없습니다. 여기에서 우리의 프로토콜은 두 가지 미토콘드리아 추적 방법을 통해 MSC 와 망막 색소 상피 세포 간의 미토콘드리아 전달 현상을 시험관 내에서 연구하기 위한 실험적 접근 방식을 설명합니다.
mito-GFP 형질주입된 MSC를 mito-RFP-형질주입된 ARPE19 세포(망막 색소 상피 세포주)와 24시간 동안 공동 배양했습니다. 그런 다음 모든 세포를 팔로이딘으로 염색하고 컨포칼 현미경으로 이미지화했습니다. ARPE19 세포에서 녹색 형광을 가진 미토콘드리아와 MSC에서 적색 형광을 가진 미토콘드리아를 관찰했는데, 이는 MSC와 ARPE19 세포 간에 양방향 미토콘드리아 전달이 발생한다는 것을 나타냅니다. 이 현상은 미토콘드리아 전달이 MSC와 ARPE19 세포 사이에서도 발생하는 정상적인 생리적 현상이며, MSC에서 ARPE19 세포로의 미토콘드리아 전달이 그 반대의 경우보다 훨씬 더 자주 발생한다는 것을 시사합니다. 본 연구의 결과는 MSC가 미토콘드리아를 망막 색소 상피로 전달할 수 있음을 시사하며, 향후 MSC가 망막 색소 상피에서 미토콘드리아 수송을 통해 치료 잠재력을 발휘할 수 있을 것으로 예측합니다. 또한 ARPE19 세포에서 MSC로의 미토콘드리아 전달은 아직 더 연구되지 않았습니다.
미토콘드리아는 대부분의 세포 유형에서 주요 에너지원 역할을 하며, 미토콘드리아 기능 장애는 특히 망막과 같은 고에너지 요구 조직에 영향을 미칩니다1. 망막의 대사 변화는 생체 에너지 위기를 유발할 수 있으며, 궁극적으로 광수용체 및/또는 RPE 세포의 사멸을 초래할 수 있습니다2. 중간엽 줄기 세포(MSC) 기반 치료법은 안구 변성 치료에 효능이 있는 것으로 입증되었으며, MSC가 망막 조직에 미치는 유익한 효과의 기저에 있는 정확한 메커니즘 중 하나는 기능적 미토콘드리아 전달에 기인할 수 있습니다 3,4,5,6. 2004년 Rustom 등은 터널링 나노튜브(TNT)에 의해 촉진되는 새로운 세포 간 상호 작용을 통한 미토콘드리아 전달 현상을 처음으로 보고했습니다7.
2D 배양에서 터널링 나노튜브(TNT)는 길이가 수십 나노미터에서 수백 나노미터에 이르는 얇은(20-700nm) 막 돌출부로 식별되며, 이는 기판 위에 매달려 두 개 이상의 동형 및 이형 세포 사이에 직접 연결을 설정할 수 있습니다. 이러한 구조는 F-액틴이 현저히 풍부하며 세포 간 미토콘드리아와 같은 화물의 수송을 용이하게 합니다. 또한, TNT는 양쪽 끝에 개구부를 가지고 있어 상호 연결된 세포 사이의 세포질 함량의 연속성을 가능하게 한다8.
TNT 매개 미토콘드리아 전달은 조밀한 세포 배열과 미토콘드리아 추적의 어려움으로 인해 생체 내에서 검출하기 어렵습니다. 세포 공동 배양 및 미토콘드리아 추적 기술을 활용한 시험관 내 실험을 통해 TNT 형성 및 미토콘드리아 전달을 관찰할 수 있습니다 8,9. 또한 시험관 내에서 MSC와 망막 색소 상피 세포를 공동 배양하여 TNT 매개 미토콘드리아 전달 현상을 관찰했습니다 10.
이전의 많은 연구에서는 MSC에서 다른 세포로의 단방향 미토콘드리아 전달만 관찰했습니다 3,4,5,6. 이전에는 mito-tracker green과 mito-tracker red로 각각 라벨링된 두 종류의 세포를 사용하여 양방향 미토콘드리아 전달을 분석하려고 했지만 염료의 누화가 실험 결과를 방해했습니다. 미토콘드리아 양방향 전달을 보다 정밀하게 연구하기 위해 렌티바이러스 형광 기법을 이용하여 미토콘드리아 형광이 다른 두 개의 세포주를 구축한 후, 직접 공동 배양(direct co-culture in vitro)에 의해 TNT 형성 및 미토콘드리아 양방향 전달 현상을 관찰하고 분석하였습니다.
간단히 말해서, 미토콘드리아를 추적하고, MSC를 ARPE19 세포와 공동 배양하고, TNT 형성 및 미토콘드리아 전달을 분석하는 방법에 대한 단계적이고 실행 가능한 프로토콜이 여기에 설명되어 있습니다. 이 실험의 결과는 TNT 매개 양방향 미토콘드리아 전달을 입증했으며, 이는 미토콘드리아 전달이 일반적인 생리학적 현상임을 증명했을 뿐만 아니라 망막 세포에 대한 MSC의 잠재적인 치료 능력을 보여주었습니다.
1. MSC-mito-GFP 및 ARPE19-mito-RFP 세포주 생성
2. MSC 및 ARPE19 세포의 직접 공동 배양
참고: 이 공동 배양 시스템에서 MSC-mito-GFP 세포는 공여 세포 역할을 하고 ARPE19-mito-RFP 세포는 수용 세포 역할을 합니다. 기증자 세포와 수혜자 세포를 구별하기 위해 수혜자 세포를 추적했습니다.
3. 트랜스웰 시스템에서 MSC 및 ARPE19 세포의 간접 공동 배양
4. 세포골격 염색
알림: 실험 내내 빛으로부터 보호하십시오.
5. 공초점 이미징
알림: 컨포칼 이미징은 사용 설명서에 따라 수행되며 현미경마다 다를 수 있습니다. 여기에서는 몇 가지 주요 단계만 제공합니다.
6. 데이터 분석
중간엽 줄기 세포(MSC)와 ARPE19 세포의 직접적인 공동 배양을 보여주는 개략도는 그림 1에 나와 있습니다. mito-GFP를 공여세포로 발현하도록 조작된 MSCs와 수혈세포로서 보라색 표지된 세포질막을 가진 ARPE19-mito-RFP 세포를 1:1의 비율로 공동 배양했습니다. 24시간의 공동 배양 기간 후, 세포를 팔로이딘에 대해 염색하고 공초점 현미경을 사용하여 검사했?...
수많은 연구에서 TNT 매개 미토콘드리아 전달 현상이 다양한 유형의 조직 세포에서 널리 퍼져 있는 생리학적 과정임을 입증했습니다 10,11,12,13. MSC에서 미토콘드리아 기능 장애가 있는 세포로의 기능적 미토콘드리아 기증은 강력한 치료 잠재력을 나타냅니다...
저자는 상충되는 이해관계가 없다고 선언한다.
상업용 초고해상도 현미경(HIS-SIM)을 사용한 이미징, 데이터 수집, SR 이미지 재구성, 분석 및 논의에 대해 Guangzhou CSR Biotech Co. Ltd에 감사드립니다. 이 연구는 중국 국립자연과학재단(National Natural Science Foundation of China, 82125007,92368206)과 베이징 자연과학재단(Beijing Natural Science Foundation, Z200014)의 일부 지원을 받고 있습니다.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | |
6-well plate | NEST | 703001 | |
15 mL centrifuge tube | BD Falcon | 352097 | |
24-well plate | NEST | 702001 | |
ARPE19 cells | ATCC | CRL-2302 | Cell lines |
Bovine serum albumin (BSA) | Beyotime | ST025 | |
CellTrace violet | Invitrogen | C34557 | |
Cover slide | NEST | 801007 | |
DMSO | sigma | D2650 | |
DPBS | Gibco | C141905005BT | |
DMEM/F-12-GlutaMAX | Gibco | 10565-042 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | VivaCell | C04002-500 | |
FluorSave Reagent | Millipore | 345789 | |
MSCs | Nuwacell | RC02003 | Cell lines |
ncMission | Shownin | RP02010 | |
Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
pCT-Mito-GFP | SBI | CYTO102-PA-1 | Plasmid; From https://www.systembio.com/mitochondria-cyto-tracer-pct-mito-gfp-cmv |
Puromycin | MCE | HY-B1743A | |
Pipette | Axygen | TF-1000-R-S | |
Phalloidin | Invitrogen | A22287 | |
Triton X-100 | Solarbio | T8200 | |
Transwell plate | Corning | 3470 |
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