Trasferimento mitocondriale tramite nanotubi di tunneling tra cellule staminali mesenchimali ed epitelio pigmentato retinico in vitro

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo che include il tracciamento mitocondriale, le procedure di co-coltura diretta di cellule staminali mesenchimali (MSC) e cellule epiteliali pigmentate retiniche (ARPE19), nonché i metodi per l'osservazione e l'analisi statistica della formazione di nanotubi a effetto tunnel (TNT) e del trasferimento mitocondriale per caratterizzare lo scambio mitocondriale tramite TNT tra MSC e cellule ARPE19.

Abstract

Il trasferimento mitocondriale è un fenomeno fisiologico normale che si verifica ampiamente tra vari tipi di cellule. Nello studio fino ad oggi, la via più importante per il trasporto mitocondriale è attraverso i nanotubi a effetto tunnel (TNT). Ci sono stati molti studi che hanno riportato che le cellule staminali mesenchimali (MSC) possono trasferire i mitocondri ad altre cellule attraverso i TNT. Tuttavia, pochi studi hanno dimostrato il fenomeno del trasferimento mitocondriale bidirezionale. Qui, il nostro protocollo descrive un approccio sperimentale per studiare il fenomeno del trasferimento mitocondriale tra MSC e cellule epiteliali pigmentate retiniche in vitro mediante due metodi di tracciamento mitocondriale.

Abbiamo co-coltivato MSC trasfettate con mito-GFP con cellule ARPE19 trasfettate con mito-RFP (una linea cellulare epiteliale pigmentata retinica) per 24 ore. Quindi, tutte le cellule sono state colorate con falloidina e sottoposte a imaging al microscopio confocale. Abbiamo osservato mitocondri con fluorescenza verde nelle cellule ARPE19 e mitocondri con fluorescenza rossa nelle MSC, indicando che il trasferimento mitocondriale bidirezionale avviene tra le MSC e le cellule ARPE19. Questo fenomeno suggerisce che il trasporto mitocondriale è un fenomeno fisiologico normale che si verifica anche tra le MSC e le cellule ARPE19, e che il trasferimento mitocondriale dalle MSC alle cellule ARPE19 avviene molto più frequentemente che viceversa. I nostri risultati indicano che le MSC possono trasferire i mitocondri nell'epitelio pigmentato retinico e, allo stesso modo, prevedono che le MSC possano realizzare il loro potenziale terapeutico attraverso il trasporto mitocondriale nell'epitelio pigmentato retinico in futuro. Inoltre, il trasferimento mitocondriale dalle cellule ARPE19 alle MSC deve essere ulteriormente esplorato.

Introduzione

I mitocondri fungono da fonte di energia primaria per la maggior parte dei tipi di cellule, con la disfunzione mitocondriale che colpisce in particolare i tessuti ad alta richiesta di energia come la retina¹. Le alterazioni metaboliche della retina possono innescare una crisi bioenergetica, con conseguente morte dei fotorecettori e/o delle cellule RPE². Le terapie a base di cellule staminali mesenchimali (MSC) hanno dimostrato efficacia nel trattamento della degenerazione oculare e uno dei meccanismi precisi alla base degli effetti benefici delle MSC sui tessuti retinici può essere attribuito al trasferimento mitocondriale funzionale 3,4,5,6. Nel 2004, Rustom et al. hanno riportato per la prima volta il fenomeno del trasferimento mitocondriale attraverso una nuova interazione cellula-cellula facilitata da nanotubi a effetto tunnel (TNT)⁷.

Nella coltura 2D, i nanotubi a effetto tunnel (TNT) sono identificati dalle loro sottili sporgenze di membrana (20-700 nm) che vanno da decine a centinaia di nanometri di lunghezza, che sono sospese sul substrato e possono stabilire direttamente connessioni tra due o più cellule omotipiche ed eterotipiche. Queste strutture sono notevolmente arricchite in F-actina e facilitano il trasporto di merci, come i mitocondri, tra le cellule. Inoltre, i TNT possiedono aperture ad entrambe le estremità, che consentono la continuità del contenuto citoplasmatico tra le cellule interconnesse⁸.

È difficile rilevare il trasferimento mitocondriale mediato da TNT in vivo a causa della densa disposizione cellulare e delle difficoltà nel tracciare i mitocondri. La sperimentazione in vitro, utilizzando tecniche di co-coltura cellulare e tracciamento mitocondriale, consente l'osservazione della formazione di TNT e del trasferimento mitocondriale ^8,9. Abbiamo anche osservato il fenomeno del trasferimento mitocondriale mediato da TNT mediante co-coltura di MSC e cellule epiteliali pigmentate retiniche in vitro¹⁰.

Molti studi precedenti hanno osservato solo il trasferimento mitocondriale unidirezionale dalle MSC ad altre cellule 3,4,5,6. In precedenza, abbiamo anche provato ad analizzare il trasferimento mitocondriale bidirezionale utilizzando due tipi di cellule marcate rispettivamente con mito-tracker verde e mito-tracker rosso, ma il crosstalk dei coloranti ha interferito con i risultati sperimentali. Per studiare più precisamente il trasferimento bidirezionale mitocondriale, qui, abbiamo costruito due linee cellulari con diversa fluorescenza mitocondriale utilizzando la tecnica della trasfezione lentivirale e, successivamente, abbiamo osservato e analizzato i fenomeni di formazione di TNT e trasferimento bidirezionale mitocondriale mediante co-coltura diretta in vitro.

In breve, viene descritto un protocollo passo-passo e attuabile su come tracciare i mitocondri, co-coltivare le MSC con le cellule ARPE19 e analizzare la formazione di TNT e il trasferimento mitocondriale. I risultati di questo esperimento hanno dimostrato il trasferimento mitocondriale bidirezionale mediato da TNT, che non solo ha dimostrato che il trasporto mitocondriale è un fenomeno fisiologico comune, ma ha anche mostrato la potenziale capacità terapeutica delle MSC sulle cellule retiniche.

Protocollo

1. Generazione di linee cellulari MSC-mito-GFP e ARPE19-mito-RFP

1. Coltura cellulare
   NOTA: qui vengono utilizzati solo MSC come esempio.
   1. Coltura di MSC umane in una piastra a 6 pozzetti in terreno hMSC con penicillina e streptomicina all'1% (vedi Tabella dei materiali) fino a quando la densità cellulare raggiunge l'80%-90%. A seconda della densità di crescita cellulare, cambiare il terreno una volta ogni 2-3 giorni.
      1. Rimuovere il terreno originale e lavare le celle una volta con soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS) (vedi Tabella dei materiali). Aggiungere 1 mL della miscela tripsina-EDTA-DPBS (0,05% Tripsina-EDTA: 0,25% Tripsina-EDTA diluita con DPBS in un rapporto di 1:5; vedere la Tabella dei Materiali) e incubare per 3-4 minuti (a seconda delle cellule) in un incubatore a 37 °C.
         NOTA: Osservare la digestione cellulare al microscopio e interrompere la digestione se la maggior parte delle cellule è arrotondata e staccata.
      2. Picchiettare delicatamente la piastra a 6 pozzetti per staccare le cellule aderenti alla superficie, quindi aggiungere 1 ml di terreno completo fresco per terminare la digestione.
      3. Risospendere delicatamente tutte le cellule con una pipetta e successivamente trasferire tutte le cellule raccolte in una provetta da centrifuga da 15 mL.
      4. Centrifugare le celle a 200 × g per 5 min.
      5. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule aggiungendo 1 mL di terreno fresco. Prelevare 10 μL di sospensione cellulare per il conteggio delle cellule.
      6. Da diciotto a 24 ore prima della trasfezione lentivirale, seminare cellule MSC a una densità di 1 × 10⁵ cellule per pozzetto in piastre a 6 pozzetti, assicurandosi che la densità cellulare al momento della trasfezione sia di circa il 50%.
2. Trasfezione del lentivirus
   NOTA: Tutte le operazioni relative alla trasfezione lentivirale devono essere eseguite in una cabina di biosicurezza.
   1. Sostituire il terreno iniziale con 2 mL di terreno fresco il giorno successivo e aggiungere 25 μL di sospensione di lentivirus (5,00E+08 TU/mL) con adiuvanti, seguiti da incubazione a 37 °C.
      NOTA: Il confezionamento dei lentivirus è stato eseguito utilizzando il plasmide Mito-GFP (pCT-Mito-copGFP) (vedi Tabella dei materiali e Figura supplementare S1) da un'azienda.
   2. Dopo 6 ore di incubazione, sostituire il terreno contenente il virus con 2 mL di terreno fresco. Continuare a incubare e cambiare il terreno una volta al giorno.
      NOTA: Una significativa espressione di fluorescenza mitocondriale è osservata nelle MSC 48 ore dopo la trasfezione, con un ulteriore aumento evidente al punto temporale di 72 ore.
   3. Lo screening delle cellule trasfettate con successo integrando il terreno di coltura con puromicina (1 μg/mL) 2 giorni dopo la trasfezione. Contemporaneamente, aggiungere una concentrazione equivalente di puromicina alle cellule staminali mesenchimali prive di trasfezione virale come controllo.
      NOTA: Il vettore virale mito-GFP è progettato per includere il gene di resistenza alla puromicina.
   4. Cambiare il terreno ogni giorno con l'introduzione di puromicina (1 μg/mL). Interrompere l'aggiunta di puromicina dopo la morte cellulare quasi completa nel gruppo di controllo.
      NOTA: Il terreno non contiene questa concentrazione di puromicina. L'aggiunta di puromicina è necessaria solo quando il terreno viene aggiunto a una piastra a 6 pozzetti.
   5. Continuare la coltura senza puromicina fino a quando le cellule non vengono passate e congelate. Nomina questo tipo di cellula come MSC-mito-GFP.
      NOTA: Le cellule ARPE19 sono state derivate dalla banca cellulare ATCC e coltivate in DMEM/F12 contenenti il 10% di FBS e l'1% di penicillina e streptomicina (vedi Tabella dei materiali), e i metodi di digestione e passaggio sono gli stessi di quelli delle MSC. Il plasmide Mito-RFP è stato modificato da Mito-GFP da un'azienda. Infine, abbiamo chiamato le cellule trasfettate con successo come ARPE19-mito-RFP.

2. Co-coltura diretta di cellule MSC e ARPE19

NOTA: In questo sistema di co-coltura, le cellule MSC-mito-GFP fungeranno da cellule donatrici mentre le cellule ARPE19-mito-RFP funzioneranno come cellule riceventi. Per distinguere tra cellule donatrici e riceventi, abbiamo tracciato le cellule ricettori.

1. Marcare le cellule ARPE19-mito-RFP con CellTrace Violet (vedi Tabella dei materiali) nella membrana citoplasmatica.
   NOTA: L'eccitazione e l'emissione del colorante viola CellTrace sono rispettivamente di 405 nm e 450 nm.
   1. Preparare una soluzione madre di CellTrace Violet (vedere la Tabella dei materiali) aggiungendo 20 μL di dimetilsolfossido (DMSO) a un flaconcino di reagente CellTrace Violet e mescolando bene immediatamente prima dell'uso.
   2. Far crescere le cellule ARPE19-mito-RFP alla densità desiderata dell'80%-90%.
   3. Diluire la soluzione madre CellTrace Violet in DPBS preriscaldato (37 °C) alla concentrazione di lavoro desiderata (1:1.000). Questa è la soluzione di caricamento.
      NOTA: La diluizione di CellTrace Violet deve essere eseguita con DPBS e non può essere sostituita con il terreno di coltura in quanto ciò porterà a risultati di colorazione molto scarsi.
   4. Rimuovere il terreno di coltura e sostituirlo con 1 mL di soluzione di caricamento. Incubare le cellule per 10 minuti a 37 °C.
      NOTA: Se le condizioni lo consentono, la colorazione può essere osservata al microscopio a fluorescenza dopo 5 minuti. La colorazione può essere interrotta non appena si ottengono i risultati desiderati, poiché alcune cellule potrebbero non essere in grado di tollerare un'esposizione prolungata alla DPBS.
   5. Rimuovere la soluzione di caricamento, lavare le cellule 2 volte con DPBS e sostituirle con 2 mL di terreno completo fresco. Incubare le cellule per almeno 10 minuti dopo la colorazione per consentire a CellTrace Violet di subire l'idrolisi dell'acetato.
      NOTA: Questo passaggio è necessario affinché le cellule ritornino al loro stato ottimale e per evitare di interferire con gli esperimenti successivi.
2. Preparare una piastra a 24 pozzetti aggiungendo 50 μl di DPBS in ciascun pozzetto. Successivamente, inserire il vetro di copertura (con un diametro specificato di 15 mm) (vedi Tabella dei materiali) nella piastra e lasciarlo riposare per 1 minuto. Rimuovere il DPBS dai pozzetti, utilizzando una pressione negativa per assicurarsi che il vetrino del coperchio sia vicino al fondo del piatto.
3. Tripsinizzare le MSC del donatore e le cellule ARPE19 riceventi come descritto nel passaggio 1.1.1.
4. Conteggio delle cellule
   1. Porre 10 μl di sospensione cellulare su una piastra di conteggio per il conteggio.
      NOTA: Se la densità delle celle è troppo alta, queste possono essere diluite 10 volte con il terreno e poi procedere come sopra.
   2. Semina 10.000 MSC e 10.000 cellule ARPE19 in 500 μL di terreno per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Mescolare bene le cellule prima di aggiungerle alla piastra a 24 pozzetti. Vedere i calcoli mostrati di seguito in base a una conta MSC di A/mL e una conta cellulare ARPE19 di B/mL.
      NOTA: Per 4 pozzetti, sono necessarie 40.000 MSC e 40.000 cellule ARPE19 in 2 mL di terreno.
      Volume della sospensione di MSC (C) contenente 40.000 MSC = 40.000/A μL
      Volume della sospensione ARPE19 (D) contenente 40.000 MSC = 40.000/B μL
      Portare il volume a 2 ml con 2 - (C + D) ml di terreno.
5. Osservare le cellule al microscopio, agitare la piastra fino a quando le cellule non sono distribuite uniformemente, quindi incubarle nella coltura per 24 ore.

3. Co-coltura indiretta di cellule MSC e ARPE19 in un sistema transwell

1. Eseguire la coltura cellulare, l'etichettatura, la digestione e il conteggio come descritto nei passaggi da 2.1 a 2.4.1.
2. Seminare 20.000 cellule ARPE19 in 1 mL di terreno per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti.
   NOTA: In questo esperimento, abbiamo utilizzato cellule ARPE19 senza mitocondri marcati.
3. Posizionare l'inserto nel pozzetto in cui è stata seminata la cellula.
4. Seminare 10.000 MSC in 100 μL di terreno nella camera cellulare superiore per pozzetto.
5. Ripetere il passaggio 2.5.

4. Colorazione del citoscheletro

NOTA: Proteggere dalla luce durante l'esperimento.

1. Rimuovere il fluido dalle piastre a 24 pozzetti. Lavare tutte le cellule una volta con 500 μL/pozzetto di poliformaldeide (PFA) al 4%, aggiungere 500 μL di PFA fresco al 4% e fissare i campioni per 20 minuti.
   NOTA: Gli inserti del sistema transwell vengono scartati.
   NOTA: Poiché i nanotubi sono molto fragili, abbiamo lavato le cellule direttamente con PFA al 4% invece di DPBS per massimizzare la ritenzione di nanotubi intatti.
2. Rimuovere il fissativo e lavare i campioni per 3 x 10 minuti con DPBS.
3. Aggiungere 500 μL/pozzetto di soluzione bloccante composta da Triton X-100 allo 0,5% (vedere la Tabella dei materiali) e al 4% di albumina sierica bovina (BSA) (vedere la Tabella dei materiali) e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
4. Rimuovere la soluzione bloccante e lavare i campioni per 3 x 10 minuti con DPBS.
5. Preparazione della soluzione colorante falloidina (vedi Tabella dei materiali)
   NOTA: L'eccitazione e l'emissione di falloidina sono rispettivamente di 650 nm e 668 nm.
   1. Preparare le soluzioni madre sciogliendo il contenuto della fiala in 150 μl di DMSO anidro per ottenere una soluzione madre 400x.
   2. Preparare la soluzione colorante diluendo la soluzione di conservazione 400x a 1x con DPBS. Questa è la soluzione colorante della falloidina.
6. Aggiungere 200 μl di soluzione colorante di falloidina in ciascun pozzetto e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
7. Recuperare la soluzione colorante e lavare il campione 3 x 10 minuti con DPBS.
   NOTA: Quando si lavano le celle con DPBS, sarà meglio lasciare la piastra su uno shaker.
8. Prelevare il vetro di copertura con un ago per siringa e lasciarlo asciugare all'aria.
   NOTA: Lo stato ottimale è quello in cui non è visibile alcun liquido visibile sul vetro di copertura, ma non è nemmeno asciutto.
9. Applicare una piccola quantità di mezzo di montaggio (vedere la Tabella dei materiali) sulla diapositiva e capovolgere con cautela il vetro di copertura sulla diapositiva per assicurarsi che il supporto ricopra uniformemente l'intera superficie. Sigillare i bordi con lo smalto.
   NOTA: Attendere qualche minuto per consentire allo smalto di asciugarsi.
10. Acquisisci prontamente un'immagine confocale o trasferiscila in una scatola a fette e conservala a 4 °C per un breve periodo.
    NOTA: Il tempo di conservazione ideale è di 2 settimane. Se questo tempo viene superato, l'effetto di imaging potrebbe deteriorarsi.

5. Imaging confocale

NOTA: L'imaging confocale viene eseguito secondo il manuale operativo e può variare da un microscopio all'altro. Qui diamo solo alcuni dei passaggi chiave.

1. Avviare il microscopio confocale e aprire quattro canali laser (405, 488, 561, 640) secondo il manuale operativo.
2. Accedere al software sul computer ed eseguire le parametrizzazioni preliminari del software.
   1. Aggiungere i canali fluorescenti CF-405, CF-488, CF-561 e CF-640 all'interno del pannello Gestione processi .
   2. Regolare il tempo di esposizione di ciascun canale di fluorescenza su 200 ms e impostare l'intensità del guadagno su 2 nel pannello di controllo della fotocamera .
   3. Regolare il combinatore laser/LED su un valore di 80.
3. Manipolare il pannello di controllo esterno del microscopio per regolare la lente dell'obiettivo su un ingrandimento di 20x e assicurarsi che la lente sia posizionata al minimo.
4. Posizionare la slitta con orientamento invertito sul tavolo portante.
5. Attiva il laser a 405 nm e manipola la messa a fuoco utilizzando le spirali di messa a fuoco grossolana e fine. Osservare il campione sotto l'oculare fino a quando non sono visibili le cellule fluorescenti blu.
6. Selezionare Live Imaging nell'interfaccia software del computer, passare al canale CF-405 e regolare nuovamente l'elica di messa a fuoco fine fino a quando sullo schermo del computer non è visibile un'immagine distinta delle cellule che mostrano fluorescenza blu.
7. Regolare l'obiettivo su un ingrandimento di 40x e passare al canale CF-640, quindi regolare attentamente la messa a fuoco fino a quando non è visibile una struttura di microfilamenti cellulari distinta.
8. Mantenendo una lunghezza focale costante, passando ai canali CF-405, CF-488 e CF-561 in sequenza e modificando i parametri del tempo di esposizione ottimale, dell'intensità del guadagno e del combinatore laser/LED per l'imaging all'interno di ciascun canale, se necessario.
9. Attiva la funzione Z Image Stack e definisci i punti iniziale e finale dell'asse Z manipolando la lunghezza focale per acquisire un'immagine con profondità utilizzando l'asse Z.
10. Fare clic sul pulsante Avvia nel pannello Gestione processi per scattare una foto.
11. Seleziona 10 campi visivi in modo casuale per ogni sezione.
    NOTA: Non dovrebbero esserci sovrapposizioni tra due campi visivi.
12. Attivare la funzione time-lapse, specificando una durata totale dell'imaging di 24 ore e un intervallo fotografico di 5 minuti dopo l'identificazione del campo visivo desiderato.
    NOTA: Per catturare una sequenza time-lapse, è necessario inoculare le cellule in una capsula con fondo di vetro e posizionarle all'interno di una scatola ventilata contenente il 5% di gas CO₂ .
13. Salva ed esporta tutte le immagini.
    NOTA: Per migliorare l'esame del TNT e del trasferimento mitocondriale, è stata impiegata l'imaging a super risoluzione. L'imaging a super-risoluzione è stato eseguito utilizzando HIS-SIM commercializzato, denominato HIS-SIM (High Intelligent and Sensitive SIM) fornito da un'azienda. Le immagini sono state acquisite utilizzando un obiettivo a immersione in olio 100x/1,5 NA.

6. Analisi dei dati

1. Per l'analisi statistica di ciascuna immagine, quantificare il numero totale di cellule, il numero di nanotubi, il numero di cellule ARPE19-mito-RFE Violet-positive, il numero di cellule Violet-positive che mostrano fluorescenza verde (che rappresenta il numero di cellule ARPE19 con trasferimento mitocondriale da MSC) e il numero di cellule Violet-negative che mostrano fluorescenza rossa (che rappresenta il numero di cellule MSC con trasferimento mitocondriale da cellule ARPE19).
   1. Per quantificare la formazione di TNT, calcolare il rapporto tra il numero di nanotubi intercellulari e il numero totale di cellule.
   2. Calcolare la velocità di trasferimento mitocondriale come il rapporto tra il numero di cellule viola positive che mostrano fluorescenza verde e il numero totale di cellule viola positive (che rappresenta il trasferimento mitocondriale dalle MSC alle cellule ARPE19) o il rapporto tra il numero di cellule viola negative che mostrano fluorescenza rossa e il numero totale di cellule viola negative (che rappresenta il trasferimento mitocondriale dalle cellule ARPE19 alle MSC).

Risultati

Il diagramma schematico che illustra la co-coltura diretta di cellule staminali mesenchimali (MSC) e cellule ARPE19 è illustrato nella Figura 1. Le MSC, ingegnerizzate per esprimere la mito-GFP, come cellule donatrici e le cellule ARPE19-mito-RFP con membrane citoplasmatiche marcate in viola come cellule riceventi sono state co-coltivate con un rapporto di 1:1. Dopo un periodo di co-coltura di 24 ore, le cellule sono state colorate per la falloidina ed esam...

Discussione

Numerosi studi hanno dimostrato che il fenomeno del trasferimento mitocondriale mediato da TNT è un processo fisiologico prevalente in vari tipi di cellule tissutali 10,11,12,13. La donazione mitocondriale funzionale da MSC a cellule con disfunzione mitocondriale mostra un forte potenziale terapeutico ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110
6-well plate	NEST	703001
15 mL centrifuge tube	BD Falcon	352097
24-well plate	NEST	702001
ARPE19 cells	ATCC	CRL-2302	Cell lines
Bovine serum albumin (BSA)	Beyotime	ST025
CellTrace violet	Invitrogen	C34557
Cover slide	NEST	801007
DMSO	sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
DMEM/F-12-GlutaMAX	Gibco	10565-042
Fetal Bovine Serum (FBS)	VivaCell	C04002-500
FluorSave Reagent	Millipore	345789
MSCs	Nuwacell	RC02003	Cell lines
ncMission	Shownin	RP02010
Pen Strep	Gibco	15140-122
pCT-Mito-GFP	SBI	CYTO102-PA-1	Plasmid; From  https://www.systembio.com/mitochondria-cyto-tracer-pct-mito-gfp-cmv
Puromycin	MCE	HY-B1743A
Pipette	Axygen	TF-1000-R-S
Phalloidin	Invitrogen	A22287
Triton X-100	Solarbio	T8200
Transwell plate	Corning	3470