Mitochondrialer Transfer durch Tunneln von Nanoröhren zwischen mesenchymalen Stammzellen und retinalem Pigmentepithel in vitro

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das mitochondriale Tracing, direkte Co-Kulturverfahren von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) und retinalen Pigmentepithelzellen (ARPE19) sowie die Methoden zur Beobachtung und statistischen Analyse der Bildung von tunnelnden Nanoröhren (TNT) und des mitochondrialen Transfers umfasst, um den mitochondrialen Austausch über TNTs zwischen MSCs und ARPE19-Zellen zu charakterisieren.

Zusammenfassung

Der mitochondriale Transfer ist ein normales physiologisches Phänomen, das bei verschiedenen Zelltypen weit verbreitet ist. In der bisherigen Studie ist der wichtigste Weg für den mitochondrialen Transport das Tunneln von Nanoröhren (TNTs). Es gibt viele Studien, die berichten, dass mesenchymale Stammzellen (MSCs) Mitochondrien durch TNTs auf andere Zellen übertragen können. Nur wenige Studien haben jedoch das Phänomen des bidirektionalen mitochondrialen Transfers nachgewiesen. Hier beschreibt unser Protokoll einen experimentellen Ansatz zur Untersuchung des Phänomens des mitochondrialen Transfers zwischen MSCs und retinalen Pigmentepithelzellen in vitro mit Hilfe von zwei mitochondrialen Tracing-Methoden.

Wir co-kultivierten mito-GFP-transfizierte MSCs mit mito-RFP-transfizierten ARPE19-Zellen (einer retinalen Pigmentepithelzelllinie) für 24 Stunden. Anschließend wurden alle Zellen mit Phalloidin gefärbt und durch konfokale Mikroskopie abgebildet. Wir beobachteten Mitochondrien mit grüner Fluoreszenz in ARPE19-Zellen und Mitochondrien mit roter Fluoreszenz in MSCs, was darauf hindeutet, dass ein bidirektionaler mitochondrialer Transfer zwischen MSCs und ARPE19-Zellen stattfindet. Dieses Phänomen deutet darauf hin, dass der mitochondriale Transport ein normales physiologisches Phänomen ist, das auch zwischen MSCs und ARPE19-Zellen auftritt, und dass der mitochondriale Transfer von MSCs zu ARPE19-Zellen viel häufiger stattfindet als umgekehrt. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass MSCs Mitochondrien in das retinale Pigmentepithel überführen können, und sagen in ähnlicher Weise voraus, dass MSCs in Zukunft ihr therapeutisches Potenzial durch den mitochondrialen Transport im retinalen Pigmentepithel erfüllen können. Darüber hinaus muss der mitochondriale Transfer von ARPE19-Zellen zu MSCs noch weiter erforscht werden.

Einleitung

Mitochondrien dienen als primäre Energiequelle für die meisten Zelltypen, wobei mitochondriale Dysfunktionen besonders energieintensive Gewebe wie die Netzhaut betreffen¹. Stoffwechselveränderungen in der Netzhaut können eine bioenergetische Krise auslösen, die letztlich zum Absterben von Photorezeptoren und/oder RPE-Zellen führt². Auf mesenchymalen Stammzellen (MSC) basierende Therapien haben sich bei der Behandlung von Augendegeneration als wirksam erwiesen, und einer der genauen Mechanismen, die den positiven Wirkungen von MSCs auf das Netzhautgewebe zugrunde liegen, kann auf den funk....

Protokoll

1. Erzeugung von MSC-mito-GFP- und ARPE19-mito-RFP-Zelllinien

1. Zellkultur
   HINWEIS: Als Beispiel werden hier nur MSCs verwendet.
   1. Kulturieren Sie humane MSCs in einer 6-Well-Platte in hMSC-Medium mit 1 % Penicillin und Streptomycin (siehe Materialtabelle), bis die Zelldichte 80 %-90 % erreicht. Wechseln Sie je nach Dichte des Zellwachstums das Medium alle 2-3 Tage.
      1. Entfernen Sie das ursprüngliche Medium und waschen Sie die Zellen einmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) (siehe Materialtabelle). 1 ml des Trypsin-EDTA-DPBS-Gemisches (0,05 % Trypsin-ED....

Diskussion

Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass das Phänomen des TNT-vermittelten mitochondrialen Transfers ein weit verbreiteter physiologischer Prozess in verschiedenen Arten von Gewebezellen ist 10,11,12,13. Die funktionelle mitochondriale Spende von MSCs an Zellen mit mitochondrialer Dysfunktion weist ein starkes therapeutisches Potenzial^auf.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110
6-well plate	NEST	703001
15 mL centrifuge tube	BD Falcon	352097
24-well plate	NEST	702001
ARPE19 cells	ATCC	CRL-2302	Cell lines
Bovine serum albumin (BSA)	Beyotime	ST025
CellTrace violet	Invitrogen	C34557
Cover slide	NEST	801007
DMSO	sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
DMEM/F-12-GlutaMAX	Gibco	10565-042
Fetal Bovine Serum (FBS)	VivaCell	C04002-500
FluorSave Reagent	Millipore	345789
MSCs	Nuwacell	RC02003	Cell lines
ncMission	Shownin	RP02010
Pen Strep	Gibco	15140-122
pCT-Mito-GFP	SBI	CYTO102-PA-1	Plasmid; From  https://www.systembio.com/mitochondria-cyto-tracer-pct-mito-gfp-cmv
Puromycin	MCE	HY-B1743A
Pipette	Axygen	TF-1000-R-S
Phalloidin	Invitrogen	A22287
Triton X-100	Solarbio	T8200
Transwell plate	Corning	3470