3D培養物へのIn vitro細胞浸潤を解析するための代替戦略

要約

浸潤は、がんの発生と進行における主要な生物学的現象です。このプロセスは、腫瘍微小環境の非腫瘍性細胞および成分の影響を受けます。この研究の目的は、三次元(3D)培養を使用して in vitro で腫瘍細胞の浸潤を分析するための代替方法を説明することです。

要約

スフェロイド培養は、従来の2次元(2D)培養と比較して、in vivo微小環境の複製が改善された3Dモデルです。浸潤は、がん生物学において最も関心のある細胞結果です。このプロトコルでは、口腔扁平上皮がん(OSCC)、がん関連線維芽細胞(CAF)、および単球で構成されるヘテロスフェロイドを使用して、 in vitroでがん細胞の浸潤を評価するための代替戦略を考案しました。これらのヘテロスフェロイドは、がん細胞と並んで2つの関連する非腫瘍性細胞タイプを含む腫瘍微小環境(TME)を模倣することを目的としています。各細胞タイプは、スフェロイド形成前に異なる波長で発光する重要な蛍光マーカーで標識されました。形成されたヘテロスフェロイドは、微多孔質膜の上部コンパートメントにあるヒト平滑筋腫由来の細胞外マトリックスの層に播種されました。共焦点顕微鏡を用いてz軸での浸潤を評価した。デジタル画像は、対応する蛍光チャネルで10μm間隔で取得され、z軸の深さ90μmをカバーしました。解析は、フリーウェアの画像ソフトウェアを用いて、各画像と蛍光チャネルの積分蛍光強度を計算して行いました。このアプローチにより、多層的な状況での細胞浸潤パターンのより動的な解析が可能になり、浸潤中の異なる細胞タイプの空間的共局在を調べることができます。

概要

浸潤は、腫瘍性細胞が細胞外マトリックスを通って周囲の組織に移動するプロセス^です1,2。腫瘍が進行するにつれて、腫瘍細胞はますます複雑な微小環境にさらされます。腫瘍微小環境には、細胞外マトリックスのさまざまな成分と非腫瘍性細胞型が含まれます。線維芽細胞や常在マクロファージなどの間質細胞は、細胞外マトリックス成分や成長因子、サイトカインを分泌して微小環境をリモデリングし、これが腫瘍細胞機能に影響を与える³。間質細胞および浸潤性白血球細胞も、腫瘍細胞と直接相互作用し、互いに相互作用し、三次元微小環境において細胞外マトリックスと相互作用します。全体として、TME組成物は、腫瘍性細胞浸潤の有効性およびパターンに影響を与える⁴。

腫瘍微小環境の複雑な性質は、腫瘍組織内の細胞間相互作用を理解するための効果的な方法論の実装を必要とします。浸潤の評価に使用されるほとんどのin vitroアッセイは、主に従来の2Dモデルおよび/または単一細胞タイプの培養5,6,7,8で行われてきましたが、これは浸潤の複雑なプロセスを過度に単純化し、組織構造、間質成分、....

プロトコル

初代ヒト細胞の使用は、アララクアラの歯学部の機関向けヒト研究倫理委員会(CAAE 57895822.0.0000.5416)によって承認されました - ユネスコ。本試験で使用した試薬および機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1. 3D細胞培養用細胞の調製

注意: このセクションのすべての手順は、層流フード内で実行する必要があります。

1. ヘテロスフェロイドを形成する細胞の単一細胞懸濁液を取得します。
   注:この実験では、OSCC細胞株(SCC9)、線維芽細胞(舌がん生検からの原発性がん関連線維芽細胞)、および単球(健康なドナーからの初代単球)からなるスフェロイド(ステップ2を参照)を作製しました。実験の興味に応じて細胞の種類を選択します。
2. 血球計算盤とトリパンブルー染色を用いて細胞数と生存率を確認します。
   注:このプロトコルの細胞比は5:3:2(5,000腫瘍性:3,000線維芽細胞:2,000単球)、スフェロイドあたり合計10,000細胞です。実験の関心に応じて細胞の比率と総数を最適化します。
3. 各細胞タイプに適した非補充培地(例えば、腫瘍細胞の場合 - DMEM/F12、線維芽細胞の場合 - DMEM、単球の場合 - RPMI)で1.5 mLチューブで細胞を別々に希釈し、ウェルあ....

ディスカッション

三次元スフェロイド培養は、細胞生物学のさまざまな側面を調査するための強力なアプローチです。この研究では、腫瘍微小環境を模倣するヘテロスフェロイドを使用して腫瘍細胞の浸潤を評価するためのプロトコルを、多層的でより動的なアプローチで報告します。この方法により、非腫瘍性間質細胞の存在下での共局在と浸潤パターンの評価が可能になります。

考?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Bioprinting Kit	Greiner Bio-one	655840	Spheroid drive magnetic field. Holding drive. 96 well microplate, cell-repellent surface
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit	Invitrogen, ThermoFisher Scientific	C34554
CellTracker Red CMTPX	Invitrogen, ThermoFisher Scientific	C34552
CellTracker Violet BMQC Dye	Invitrogen, Thermo Fisher	C10094
DMEM	Gibco, ThermoFisher Scientific	31600-034
DMEM/F12	Gibco, ThermoFisher Scientific	12400-024
Extracellular matrix with Myogel	doi: 10.1186/s12885-015-1944-z		Mix composed of myogel (2.4 mg/mL), collagen (0.8 mg/mL) and non-supplemented medium of neoplastic cell
FBS	Gibco, ThermoFisher Scientific	12657-029
Hydrocortisone	Sigma	H088
ImageJ	National Institutes of Health		Software
Nanoshuttle-PL	Greiner Bio-one	657841	Magnetic nanoparticles
Needle 23 G	Medix	AHMD004	25 x 0.60 mm (23 G x 1)
PBS pH 7.2 (1x)	Gibco, ThermoFisher Scientific	2012-027
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)	Gibco, ThermoFisher Scientific	15070063
Pipet Tips	Axygen, Corning Inc.	TF-200-L-R-S	Pipet tip with barrier (filter), 200 µL Low Retention Filter, short, maximum recovery
RPMI	Gibco, ThermoFisher Scientific	31800-022
TransWell 24 well	Costar, Corning Inc.	3422	Transwell Permeable Supports 6.5 mm Insert, 24 well plate; 0.8 µm Polycarbonate Membrane
Zen 3.4 (blue edition)	Zeiss Group		Software