3D 배양의 In vitro 세포 침입을 분석하기 위한 대안 전략

요약

침습은 암의 발병과 진행에 있어 중요한 생물학적 현상입니다. 이 과정은 비종양 세포와 종양 미세환경의 구성 요소에 의해 영향을 받습니다. 이 연구의 목적은 3차원(3D) 배양을 사용하여 종양 세포 침입을 in vitro 분석하는 대체 방법을 설명하는 것입니다.

초록

스페로이드 배양은 기존의 2차원(2D) 배양에 비해 생체 내 미세환경의 향상된 복제를 제공하는 3D 모델입니다. 침습은 암 생물학에서 가장 큰 관심을 끄는 세포의 결과입니다. 이 프로토콜에서는 구강 편평 세포 암종(OSCC), 암 관련 섬유아세포(CAF) 및 단핵구로 구성된 헤테로이드를 사용하여 시험관 내 암세포 침입을 평가하기 위한 대체 전략을 고안했습니다. 이러한 헤테로스페로이드는 암세포와 함께 두 가지 관련 비종양 세포 유형을 포함하여 종양 미세환경(TME)을 모방하는 것을 목표로 합니다. 각 세포 유형은 스페로이드가 형성되기 전에 뚜렷한 파장에서 방출되는 중요한 형광 마커로 표지되었습니다. 일단 형성되면, 헤테로페로이드는 미세 다공성 막의 상부 구획에 있는 인간 평활근종 유래 세포외 기질층의 층에 파종되었습니다. 침습은 컨포칼 현미경을 사용하여 z축에서 평가되었습니다. 디지털 이미지는 z축에서 90μm 깊이를 커버하는 10μm 간격으로 해당 형광 채널에서 획득되었습니다. 분석은 프리웨어 이미지 소프트웨어를 사용하여 각 이미지 및 형광 채널의 통합 형광 강도를 계산하여 수행되었습니다. 이 접근 방식을 사용하면 다층적 맥락에서 세포 침입 패턴을 보다 동적으로 분석할 수 있을 뿐만 아니라 침입 중 다양한 세포 유형의 공간적 공동 국소화를 검사할 수 있습니다.

서문

침습은 종양 세포가 세포외 기질을 통해 주변 조직 ^1,2로 이동하는 과정입니다. 종양이 진행됨에 따라 종양 세포는 점점 더 복잡한 미세환경에 노출됩니다. 종양 미세환경에는 세포외 기질과 비종양 세포 유형의 다양한 구성 요소가 포함됩니다. 섬유아세포(fibroblast)와 상주대식세포(resident macrophage)를 포함한 기질세포(stromal cell)는 세포외 기질 성분과 성장 인자, 사이토카인(cytokine)을 분비하여 미세환경을 리모델링하며, 이는 다시 종양세포 기능에 영향을 미친다³. 기질 및 침윤 백혈구 세포는 또한 3차원 미세환경에서 종양 세포와 직접 상호 작용하고 서로 상호 작용하며 세포외 기질과 상호 작용합니다. 전체적으로, TME 조성은 종양 세포 침습의 효능과 패턴에 영향을 미친다⁴.

종양 미세환경의 복잡한 특성으로 인해 종양 조직 내 세포 간 상호 작용을 이해하기 위한 효과적인 방법론의 구현이 필요합니다. 침습을 평가하는 데 사용되는 대부분의 in vitro assay는 주로 전통적인 2D 모델 및/또는 단일....

프로토콜

1차 인간 세포의 사용은 UNESP(Araquara at Araquara School of Dentistry)의 기관 인간 연구 윤리 위원회(CAAE 57895822.0.0000.5416)의 승인을 받았습니다. 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 3D 세포 배양을 위한 세포 준비

알림: 이 섹션의 모든 단계는 층류 후드 내에서 수행해야 합니다.

1. 헤테로스페로이드를 형성할 세포의 단세포 현탁액을 얻습니다.
   참고: 이 실험에서는 OSCC 세포주(SCC9), 섬유아세포(설암 생검에서 얻은 원발성 암 관련 섬유아세포) 및 단핵구(건강한 기증자의 일차 단핵구)로 구성된 스페로이드(2단계 참조)를 생성했습니다. 실험적 관심도에 따라 세포 유형을 선택합니다.
2. 혈구측정기와 trypan blue 염색을 사용하여 세포 수와 생존율을 확인합니다.
   참고: 이 프로토콜의 세포 비율은 5:3:2(신생물 5,000개: 섬유아세포 3,000개: 단핵구 2,000개)이며, 스페로이드당 총 10,000개의 세포입니다. 실험적 관심사에 따라 세포의 비율과 총 수를 최적화합니다.

결과

이 연구는 다양한 세포 유형으로 구성된 스페로이드를 사용하여 체외에서 세포 침입을 평가하는 대체 방법을 제시합니다. 이를 통해 다층적 맥락에서 세포 침습 패턴을 분석하고 침습 중 세포 공동 국소화 역학을 조사할 수 있습니다(그림 1).

명시야 이미지는 어둡은/검은색 응집체로 식별되는 스페로이드/세포 국소화를 나타냅니다(

토론

3차원 스페로이드 배양은 세포 생물학의 다양한 측면을 조사할 수 있는 강력한 접근 방식입니다. 이 연구에서는 종양 미세환경을 모방하는 헤테로스페로이드를 사용하여 다층적이고 보다 역동적인 접근 방식으로 종양 세포 침입을 평가하기 위한 프로토콜을 보고합니다. 이 방법을 사용하면 비종양성 기질 세포의 존재 하에서 co-localization 및 침입 패턴을 평가할 수 있습니다.

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Bioprinting Kit	Greiner Bio-one	655840	Spheroid drive magnetic field. Holding drive. 96 well microplate, cell-repellent surface
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit	Invitrogen, ThermoFisher Scientific	C34554
CellTracker Red CMTPX	Invitrogen, ThermoFisher Scientific	C34552
CellTracker Violet BMQC Dye	Invitrogen, Thermo Fisher	C10094
DMEM	Gibco, ThermoFisher Scientific	31600-034
DMEM/F12	Gibco, ThermoFisher Scientific	12400-024
Extracellular matrix with Myogel	doi: 10.1186/s12885-015-1944-z		Mix composed of myogel (2.4 mg/mL), collagen (0.8 mg/mL) and non-supplemented medium of neoplastic cell
FBS	Gibco, ThermoFisher Scientific	12657-029
Hydrocortisone	Sigma	H088
ImageJ	National Institutes of Health		Software
Nanoshuttle-PL	Greiner Bio-one	657841	Magnetic nanoparticles
Needle 23 G	Medix	AHMD004	25 x 0.60 mm (23 G x 1)
PBS pH 7.2 (1x)	Gibco, ThermoFisher Scientific	2012-027
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)	Gibco, ThermoFisher Scientific	15070063
Pipet Tips	Axygen, Corning Inc.	TF-200-L-R-S	Pipet tip with barrier (filter), 200 µL Low Retention Filter, short, maximum recovery
RPMI	Gibco, ThermoFisher Scientific	31800-022
TransWell 24 well	Costar, Corning Inc.	3422	Transwell Permeable Supports 6.5 mm Insert, 24 well plate; 0.8 µm Polycarbonate Membrane
Zen 3.4 (blue edition)	Zeiss Group		Software