Strategia alternativa per analizzare l'invasione cellulare in vitro di colture 3D

Riepilogo

L'invasione è un importante fenomeno biologico nello sviluppo e nella progressione del cancro. Questo processo è influenzato dalle cellule non neoplastiche e dai componenti del microambiente tumorale. Lo scopo di questo studio è quello di descrivere un metodo alternativo per analizzare l'invasione delle cellule tumorali in vitro utilizzando colture tridimensionali (3D).

Abstract

La coltura sferoidale è un modello 3D che fornisce una migliore replica del microambiente in vivo rispetto alle tradizionali colture bidimensionali (2D). L'invasione è un esito cellulare di estremo interesse nella biologia del cancro. In questo protocollo, abbiamo ideato una strategia alternativa per valutare l'invasione delle cellule tumorali in vitro, impiegando eterosferoidi costituiti da carcinoma orale a cellule squamose (OSCC), fibroblasti associati al cancro (CAF) e monociti. Questi eterosferoidi mirano a imitare il microambiente tumorale (TME), includendo due tipi di cellule non neoplastiche rilevanti accanto alle cellule tumorali. Ogni tipo di cellula è stato etichettato con marcatori fluorescenti vitali che emettono in lunghezze d'onda distinte prima della formazione degli sferoidi. Una volta formati, gli eterosferoidi sono stati seminati su uno strato di matrice extracellulare derivata dal leiomioma umano nel compartimento superiore di una membrana microporosa. L'invasione è stata valutata sull'asse z utilizzando la microscopia confocale. Le immagini digitali sono state ottenute nei corrispondenti canali fluorescenti a intervalli di 10 μm, coprendo una profondità di 90 μm nell'asse z. L'analisi è stata eseguita utilizzando un software di immagini freeware calcolando l'intensità di fluorescenza integrata in ciascuna immagine e canale di fluorescenza. Questo approccio consente un'analisi più dinamica dei pattern di invasione cellulare in un contesto multistrato, nonché l'esame della co-localizzazione spaziale di diversi tipi di cellule durante l'invasione.

Introduzione

L'invasione è un processo in cui le cellule neoplastiche migrano attraverso la matrice extracellulare nel tessuto circostante ^1,2. Con il progredire del tumore, le cellule neoplastiche sono esposte a microambienti sempre più complessi. Il microambiente tumorale comprende vari componenti della matrice extracellulare e tipi di cellule non neoplastiche. Le cellule stromali, compresi i fibroblasti e i macrofagi residenti, rimodellano il microambiente secernendo componenti della matrice extracellulare e fattori di crescita e citochine, che a loro volta influenzano le funzioni delle cellule neoplastiche

Protocollo

L'uso di cellule umane primarie è stato approvato dal Comitato Etico Istituzionale per la Ricerca Umana (CAAE 57895822.0.0000.5416) della Scuola di Odontoiatria di Araraquara - UNESP. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Preparazione delle cellule per la coltura cellulare 3D

NOTA: Tutti i passaggi di questa sezione devono essere eseguiti all'interno di una cappa a flusso laminare.

1. Ottenere sospensioni unicellulari delle cellule che andranno a formare l'eterosferoide.
   NOTA: In questo esperim....

Discussione

Le colture di sferoidi tridimensionali sono un approccio potente per studiare vari aspetti della biologia cellulare. In questo studio, riportiamo un protocollo per la valutazione dell'invasione cellulare neoplastica utilizzando eterosferoidi che mimano il microambiente tumorale in un approccio multistrato e più dinamico. Questa metodica consente di valutare la co-localizzazione e i pattern di invasione in presenza di cellule stromali non neoplastiche.

Ci sono alcuni passaggi critici che merit.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Bioprinting Kit	Greiner Bio-one	655840	Spheroid drive magnetic field. Holding drive. 96 well microplate, cell-repellent surface
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit	Invitrogen, ThermoFisher Scientific	C34554
CellTracker Red CMTPX	Invitrogen, ThermoFisher Scientific	C34552
CellTracker Violet BMQC Dye	Invitrogen, Thermo Fisher	C10094
DMEM	Gibco, ThermoFisher Scientific	31600-034
DMEM/F12	Gibco, ThermoFisher Scientific	12400-024
Extracellular matrix with Myogel	doi: 10.1186/s12885-015-1944-z		Mix composed of myogel (2.4 mg/mL), collagen (0.8 mg/mL) and non-supplemented medium of neoplastic cell
FBS	Gibco, ThermoFisher Scientific	12657-029
Hydrocortisone	Sigma	H088
ImageJ	National Institutes of Health		Software
Nanoshuttle-PL	Greiner Bio-one	657841	Magnetic nanoparticles
Needle 23 G	Medix	AHMD004	25 x 0.60 mm (23 G x 1)
PBS pH 7.2 (1x)	Gibco, ThermoFisher Scientific	2012-027
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)	Gibco, ThermoFisher Scientific	15070063
Pipet Tips	Axygen, Corning Inc.	TF-200-L-R-S	Pipet tip with barrier (filter), 200 µL Low Retention Filter, short, maximum recovery
RPMI	Gibco, ThermoFisher Scientific	31800-022
TransWell 24 well	Costar, Corning Inc.	3422	Transwell Permeable Supports 6.5 mm Insert, 24 well plate; 0.8 µm Polycarbonate Membrane
Zen 3.4 (blue edition)	Zeiss Group		Software