分析 3D 培养物体外细胞侵袭的替代策略

摘要

侵袭是癌症发生发展中的主要生物现象。这个过程受非肿瘤细胞和肿瘤微环境成分的影响。本研究的目的是描述一种使用 3D （3D） 培养物在 体外 分析肿瘤细胞侵袭的替代方法。

摘要

球状体培养是一种 3D 模型，与传统的二维 （2D） 培养相比，它提供了改进的体内微环境复制。侵袭是癌症生物学中最感兴趣的细胞结果。在该方案中，我们设计了一种替代策略来评估 体外癌细胞侵袭，采用由口腔鳞状细胞癌 （OSCC）、癌症相关成纤维细胞 （CAF） 和单核细胞组成的异球体。这些异球体旨在模拟肿瘤微环境 （TME），包括癌细胞旁边的两种相关非肿瘤细胞类型。在球状体形成之前，每种细胞类型都用以不同波长发射的重要荧光标记物标记。形成后，将异球接种到微孔膜上部隔室中人平滑肌瘤衍生的细胞外基质层上。使用共聚焦显微镜在 z 轴上评估浸润。在相应的荧光通道中以 10 μm 的间隔获得数字图像，在 z 轴上覆盖 90 μm 的深度。使用免费软件图像软件通过计算每个图像和荧光通道中的集成荧光强度进行分析。这种方法能够在多层环境中对细胞侵袭模式进行更动态的分析，以及检查侵袭过程中不同细胞类型的空间共定位。

引言

侵袭是肿瘤细胞通过细胞外基质迁移到周围组织的过程 ^1,2。随着肿瘤的进展，肿瘤细胞会暴露在越来越复杂的微环境中。肿瘤微环境包括细胞外基质和非肿瘤细胞类型的各种成分。基质细胞，包括成纤维细胞和驻留巨噬细胞，通过分泌细胞外基质成分和生长因子以及细胞因子来重塑微环境，这反过来又影响肿瘤细胞功能³。基质和浸润白细胞也直接与肿瘤细胞相互作用，彼此相互作用，并与三维微环境中的细胞外基质相互作用。总而言之，TME 组成会影响肿瘤细胞侵袭的疗效和模式⁴。

肿瘤微环境的复杂性要求实施有效的方法来理解肿瘤组织内的细胞间相互作用。大多数用于评估侵袭的体外测定主要在传统的 2D 模型和/或单细胞型培养物中进行 ^5,6,7,8，这过度简化了侵袭的复杂过程，并具有多种局限性，例如缺乏组织结构、基质成分和体内可重复性。球状体培养物代表了一种模拟肿瘤块状的体外 3D 培养模型，允许涉及物理和....

研究方案

原代人类细胞的使用已获得 Araraquara 牙科学院 - UNESP 的机构人类研究伦理委员会 （CAAE 57895822.0.0000.5416） 的批准。材料 表中列出了研究中使用的试剂和设备的详细信息。

1. 用于 3D 细胞培养的细胞制备

注意：本节中的所有步骤都必须在层流罩内进行。

1. 获得将形成异球体的细胞的单细胞悬液。
   注意：在本实验中，我们生成了由 OSCC 细胞系 （SCC9）、成纤维细胞（来自舌癌活检的原代癌症相关成纤维细胞）和单核细胞（来自健康供体的原代单核细胞）组成的球体（参见步骤 2）。根据实验兴趣选择细胞类型。
2. 使用血细胞计数器和台盼蓝染色检查细胞数量和活力。
   注意：该方案中的细胞比例为 5：3：2（5,000 个肿瘤：3,000 个成纤维细胞：2,000 个单核细胞），每个球体总计 10,000 个细胞。根据实验兴趣优化细胞的比例和总数。
3. 使用适合每种细胞类型的非补充培养基（例如，对于肿瘤细胞 - DMEM/F12;对于成纤维细胞 - DMEM;对于单核细胞 - RPMI），分别在 1.5 mL 试管中稀释细胞，以达到每孔 5,000 个肿瘤细胞、每孔 3,000 个成纤维细胞和每孔 2,000 个单核细胞，或 500,000 个细胞/毫升的适当接种密....

讨论

三维球状体培养是研究细胞生物学各个方面的强大方法。在这项研究中，我们报告了一种使用异球体评估肿瘤细胞侵袭的方案，该异球体以多层和更动态的方式模拟肿瘤微环境。该方法允许在非肿瘤基质细胞存在下评估共定位和侵袭模式。

有一些关键步骤值得考虑。首先，选择能够形成球体的细胞很重要¹²。其次，细胞以不同的速度侵袭，因此在实验方案中.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Bioprinting Kit	Greiner Bio-one	655840	Spheroid drive magnetic field. Holding drive. 96 well microplate, cell-repellent surface
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit	Invitrogen, ThermoFisher Scientific	C34554
CellTracker Red CMTPX	Invitrogen, ThermoFisher Scientific	C34552
CellTracker Violet BMQC Dye	Invitrogen, Thermo Fisher	C10094
DMEM	Gibco, ThermoFisher Scientific	31600-034
DMEM/F12	Gibco, ThermoFisher Scientific	12400-024
Extracellular matrix with Myogel	doi: 10.1186/s12885-015-1944-z		Mix composed of myogel (2.4 mg/mL), collagen (0.8 mg/mL) and non-supplemented medium of neoplastic cell
FBS	Gibco, ThermoFisher Scientific	12657-029
Hydrocortisone	Sigma	H088
ImageJ	National Institutes of Health		Software
Nanoshuttle-PL	Greiner Bio-one	657841	Magnetic nanoparticles
Needle 23 G	Medix	AHMD004	25 x 0.60 mm (23 G x 1)
PBS pH 7.2 (1x)	Gibco, ThermoFisher Scientific	2012-027
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)	Gibco, ThermoFisher Scientific	15070063
Pipet Tips	Axygen, Corning Inc.	TF-200-L-R-S	Pipet tip with barrier (filter), 200 µL Low Retention Filter, short, maximum recovery
RPMI	Gibco, ThermoFisher Scientific	31800-022
TransWell 24 well	Costar, Corning Inc.	3422	Transwell Permeable Supports 6.5 mm Insert, 24 well plate; 0.8 µm Polycarbonate Membrane
Zen 3.4 (blue edition)	Zeiss Group		Software