Stratégie alternative pour analyser l’invasion cellulaire in vitro de cultures 3D

Résumé

L’invasion est un phénomène biologique majeur dans le développement et la progression du cancer. Ce processus est influencé par les cellules non néoplasiques et les composants du microenvironnement tumoral. Le but de cette étude est de décrire une méthode alternative pour analyser l’invasion des cellules tumorales in vitro à l’aide de cultures tridimensionnelles (3D).

Résumé

La culture de sphéroïdes est un modèle 3D qui offre une meilleure réplication du microenvironnement in vivo par rapport aux cultures bidimensionnelles (2D) traditionnelles. L’invasion est un résultat cellulaire du plus grand intérêt pour la biologie du cancer. Dans ce protocole, nous avons conçu une stratégie alternative pour évaluer l’invasion des cellules cancéreuses in vitro, en utilisant des hétérosphéroïdes composés d’un carcinome épidermoïde oral (OSCC), de fibroblastes associés au cancer (CAF) et de monocytes. Ces hétérosphéroïdes visent à imiter le microenvironnement tumoral (TME), y compris deux types de cellules non néoplasiques pertinents aux côtés des cellules cancéreuses. Chaque type de cellule a été marqué avec des marqueurs fluorescents vitaux émettant dans des longueurs d’onde distinctes avant la formation des sphéroïdes. Une fois formés, les hétérosphéroïdes ont été ensemencés sur une couche de matrice extracellulaire dérivée d’un léiomyome humain dans le compartiment supérieur d’une membrane microporeuse. L’invasion a été évaluée dans l’axe z à l’aide de la microscopie confocale. Des images numériques ont été obtenues dans les canaux fluorescents correspondants à des intervalles de 10 μm, couvrant une profondeur de 90 μm dans l’axe z. L’analyse a été effectuée à l’aide d’un logiciel d’imagerie gratuit en calculant l’intensité de fluorescence intégrée dans chaque image et canal de fluorescence. Cette approche permet une analyse plus dynamique des modèles d’invasion cellulaire dans un contexte multicouche, ainsi que l’examen de la co-localisation spatiale de différents types de cellules pendant l’invasion.

Introduction

L’invasion est un processus dans lequel les cellules néoplasiques migrent à travers la matrice extracellulaire dans les tissus environnants ^1,2. Au fur et à mesure que la tumeur progresse, les cellules néoplasiques sont exposées à des microenvironnements de plus en plus complexes. Le microenvironnement tumoral comprend divers composants de la matrice extracellulaire et des types de cellules non néoplasiques. Les cellules stromales, y compris les fibroblastes et les macrophages résidents, remodèlent le microenvironnement en sécrétant des composants de la matrice extracellulaire et des facteurs de croissance, ai....

Protocole

L’utilisation de cellules humaines primaires a été approuvée par le Comité d’éthique de la recherche humaine institutionnelle (CAAE 57895822.0.0000.5416) de l’École de médecine dentaire d’Araraquara - UNESP. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation des cellules pour la culture cellulaire 3D

REMARQUE : Toutes les étapes de cette section doivent être effectuées à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire.

1. Obtenir des suspensions unicellulaires des cellules qui formeront l’hétérosphéroïde.

Discussion

Les cultures tridimensionnelles de sphéroïdes sont une approche puissante pour étudier divers aspects de la biologie cellulaire. Dans cette étude, nous rapportons un protocole d’évaluation de l’invasion cellulaire néoplasique à l’aide d’hétérosphéroïdes qui imitent le microenvironnement tumoral dans une approche multicouche et plus dynamique. Cette méthode permet d’évaluer la co-localisation et les schémas d’invasion en présence de cellules stromales non néoplasiques.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Bioprinting Kit	Greiner Bio-one	655840	Spheroid drive magnetic field. Holding drive. 96 well microplate, cell-repellent surface
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit	Invitrogen, ThermoFisher Scientific	C34554
CellTracker Red CMTPX	Invitrogen, ThermoFisher Scientific	C34552
CellTracker Violet BMQC Dye	Invitrogen, Thermo Fisher	C10094
DMEM	Gibco, ThermoFisher Scientific	31600-034
DMEM/F12	Gibco, ThermoFisher Scientific	12400-024
Extracellular matrix with Myogel	doi: 10.1186/s12885-015-1944-z		Mix composed of myogel (2.4 mg/mL), collagen (0.8 mg/mL) and non-supplemented medium of neoplastic cell
FBS	Gibco, ThermoFisher Scientific	12657-029
Hydrocortisone	Sigma	H088
ImageJ	National Institutes of Health		Software
Nanoshuttle-PL	Greiner Bio-one	657841	Magnetic nanoparticles
Needle 23 G	Medix	AHMD004	25 x 0.60 mm (23 G x 1)
PBS pH 7.2 (1x)	Gibco, ThermoFisher Scientific	2012-027
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)	Gibco, ThermoFisher Scientific	15070063
Pipet Tips	Axygen, Corning Inc.	TF-200-L-R-S	Pipet tip with barrier (filter), 200 µL Low Retention Filter, short, maximum recovery
RPMI	Gibco, ThermoFisher Scientific	31800-022
TransWell 24 well	Costar, Corning Inc.	3422	Transwell Permeable Supports 6.5 mm Insert, 24 well plate; 0.8 µm Polycarbonate Membrane
Zen 3.4 (blue edition)	Zeiss Group		Software