Alternative Strategie zur Analyse der in vitro Zellinvasion von 3D-Kulturen

Zusammenfassung

Die Invasion ist ein wichtiges biologisches Phänomen bei der Entstehung und dem Fortschreiten von Krebs. Dieser Prozess wird durch nicht-neoplastische Zellen und Bestandteile der Tumormikroumgebung beeinflusst. Das Ziel dieser Arbeit ist es, eine alternative Methode zur Analyse der Tumorzellinvasion in vitro mit Hilfe von dreidimensionalen (3D) Kulturen zu beschreiben.

Zusammenfassung

Die Sphäroidkultur ist ein 3D-Modell, das im Vergleich zu herkömmlichen zweidimensionalen (2D) Kulturen eine verbesserte Replikation der in vivo-Mikroumgebung ermöglicht. Die Invasion ist ein zelluläres Ergebnis, das für die Krebsbiologie von größtem Interesse ist. In diesem Protokoll haben wir eine alternative Strategie zur Bewertung der Invasion von Krebszellen in vitro entwickelt, bei der Heterosphäroide verwendet werden, die aus dem oralen Plattenepithelkarzinom (OSCC), krebsassoziierten Fibroblasten (CAF) und Monozyten bestehen. Diese Heterosphäroide zielen darauf ab, die Tumormikroumgebung (TME) nachzuahmen, einschließlich zweier relevanter nicht-neoplastischer Zelltypen neben den Krebszellen. Jeder Zelltyp wurde mit lebenswichtigen Fluoreszenzmarkern markiert, die vor der Sphäroidbildung in unterschiedlichen Wellenlängen emittierten. Nach ihrer Bildung wurden Heterosphäroide auf eine Schicht aus humaner Leiomyom-abgeleiteter extrazellulärer Matrix im oberen Kompartiment einer mikroporösen Membran ausgesät. Die Invasion wurde in der z-Achse mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie beurteilt. Digitale Bilder wurden in den entsprechenden Fluoreszenzkanälen im Abstand von 10 μm aufgenommen, die eine Tiefe von 90 μm in der z-Achse abdecken. Die Analyse wurde mit Hilfe einer Freeware-Bildsoftware durchgeführt, indem die integrierte Fluoreszenzintensität in jedem Bild und Fluoreszenzkanal berechnet wurde. Dieser Ansatz ermöglicht eine dynamischere Analyse von Zellinvasionsmustern in einem mehrschichtigen Kontext sowie die Untersuchung der räumlichen Kolokalisation verschiedener Zelltypen während der Invasion.

Einleitung

Die Invasion ist ein Prozess, bei dem neoplastische Zellen durch die extrazelluläre Matrix in das umgebende Gewebe wandern ^1,2. Mit fortschreitendem Tumor werden neoplastische Zellen immer komplexeren Mikroumgebungen ausgesetzt. Die Mikroumgebung des Tumors umfasst verschiedene Bestandteile der extrazellulären Matrix und nicht-neoplastische Zelltypen. Stromazellen, einschließlich Fibroblasten und ansässiger Makrophagen, gestalten die Mikroumgebung um, indem sie extrazelluläre Matrixkomponenten und Wachstumsfaktoren sowie Zytokine sezernieren, die wiederum die neoplastischen Zellfunktionen beeinflussen

Protokoll

Die Verwendung von primären menschlichen Zellen wurde von der Institutionellen Ethikkommission für die Humanforschung (CAAE 57895822.0.0000.5416) der Fakultät für Zahnmedizin in Araraquara - UNESP genehmigt. Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der in der Studie verwendeten Ausrüstung sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Zellen für die 3D-Zellkultur

HINWEIS: Alle Schritte in diesem Abschnitt müssen innerhalb einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden.

1. Erhalten Sie einzellige Suspensionen der Zellen, die das Heterosphäroid bilden.
   HINWEIS: I....

Diskussion

Dreidimensionale Sphäroidkulturen sind ein leistungsfähiger Ansatz, um verschiedene Aspekte der Zellbiologie zu untersuchen. In dieser Studie berichten wir über ein Protokoll zur Bewertung der neoplastischen Zellinvasion mit Heterospheroiden, die die Tumormikroumgebung in einem mehrschichtigen und dynamischeren Ansatz nachahmen. Diese Methode ermöglicht die Beurteilung der Kolokalisation und der Invasionsmuster in Gegenwart von nicht-neoplastischen Stromazellen.

Es gibt einige kritische Sc.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Bioprinting Kit	Greiner Bio-one	655840	Spheroid drive magnetic field. Holding drive. 96 well microplate, cell-repellent surface
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit	Invitrogen, ThermoFisher Scientific	C34554
CellTracker Red CMTPX	Invitrogen, ThermoFisher Scientific	C34552
CellTracker Violet BMQC Dye	Invitrogen, Thermo Fisher	C10094
DMEM	Gibco, ThermoFisher Scientific	31600-034
DMEM/F12	Gibco, ThermoFisher Scientific	12400-024
Extracellular matrix with Myogel	doi: 10.1186/s12885-015-1944-z		Mix composed of myogel (2.4 mg/mL), collagen (0.8 mg/mL) and non-supplemented medium of neoplastic cell
FBS	Gibco, ThermoFisher Scientific	12657-029
Hydrocortisone	Sigma	H088
ImageJ	National Institutes of Health		Software
Nanoshuttle-PL	Greiner Bio-one	657841	Magnetic nanoparticles
Needle 23 G	Medix	AHMD004	25 x 0.60 mm (23 G x 1)
PBS pH 7.2 (1x)	Gibco, ThermoFisher Scientific	2012-027
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)	Gibco, ThermoFisher Scientific	15070063
Pipet Tips	Axygen, Corning Inc.	TF-200-L-R-S	Pipet tip with barrier (filter), 200 µL Low Retention Filter, short, maximum recovery
RPMI	Gibco, ThermoFisher Scientific	31800-022
TransWell 24 well	Costar, Corning Inc.	3422	Transwell Permeable Supports 6.5 mm Insert, 24 well plate; 0.8 µm Polycarbonate Membrane
Zen 3.4 (blue edition)	Zeiss Group		Software