共焦点レーザー走査型顕微鏡による脱細胞化リンゴ由来足場の細孔径測定と細胞分布解析

まず、脱細胞化したリンゴの足場をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄します。細孔径を測定するには、1 mLの10%カルコフルオウ白色溶液中で、室温の暗所で25分間、足場をインキュベートします。PBSで足場を洗浄した後、高速共鳴共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用し、レーザー発光フィルターの構成を設定します。

レーザー出力と検出器を手動で調整して、最適な画像取得を確保します。5マイクロメートルのステップサイズで20枚の画像のZスタックを取得します。次に、ImageJソフトウェアで、Z project to maximum intensity関数を使用して画像を作成し、find edges関数を適用して細孔のエッジを強調表示します。

フリーハンド選択ツールを使用して、毛穴を手動でトレースします。各細孔を楕円としてフィットさせ、長径の長さを測定します。すべての測定値をコンパイルし、平均長さを計算します。

細胞分布の解析には、適当培地で培養した細胞播種スキャフォールドをPBSで3回洗浄した後、4%パラホルムアルデヒドで10分間固定します。次に、各足場を脱イオン水で十分に洗浄し、Triton X-100溶液で細胞を5分間透過処理し、PBSで再度洗浄します。足場を1ミリリットルの1%過ヨウ素酸で40分間インキュベートし、脱イオン水ですすいでください。

次に、足場を1ミリリットルの染色液に完全に浸してインキュベートします。足場をPBSで洗浄し、足場を5ミリグラム/ミリリットルのDAPI溶液中で暗所で10分間インキュベートして細胞核を染色します。もう一度よく洗い、足場をPBSに保管します。

ここに示す設定を使用して、高速共鳴共焦点レーザー走査型顕微鏡で細胞播種したスキャフォールドを10倍の倍率で画像化します。レーザー出力と検出器を手動で調整して、最適な画像取得を確保し、5マイクロメートルのステップサイズで20枚の画像のZスタックを取得します。次に、ImageJソフトウェアを使用して共焦点画像を処理し、Z project to maximum intensity関数を使用して、画像解析用のz軸に最大投影を作成します。

共焦点顕微鏡画像の定量化により、73〜288マイクロメートルの細孔径分布が示され、平均は約154マイクロメートルでした。大部分の細孔は100〜200マイクロメートルの範囲でした。分化培地で培養した後、足場にミネラルの堆積が観察されました。

細胞播種された足場は、石灰化作用を示唆する不透明な白色を示しましたが、これは空白の足場では観察されませんでした。さらに、共焦点レーザー走査型顕微鏡分析により、足場内の細胞分布が均一であることが明らかになりました。