Cell-Free DNA Extraction and Analysis from Eye Humor

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January 12th, 2024

DOI :

10.3791/200817-v

January 12th, 2024

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Noah A. Brown¹, Rajesh C. Rao¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸, Bryan L. Betz¹

¹Department of Pathology, University of Michigan, Ann Arbor, ²Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Kellogg Eye Center, University of Michigan, Ann Arbor, ³Department of Human Genetics, University of Michigan, Ann Arbor, ⁴Rogel Cancer Center, University of Michigan, Ann Arbor, ⁵Center of Computational Medicine and Bioinformatics, University of Michigan, Ann Arbor, ⁶Center for RNA Biomedicine, University of Michigan, Ann Arbor, ⁷A. Alfred Taubman Medical Research Institute, University of Michigan, Ann Arbor, ⁸Section of Ophthalmology, Surgery Service, Veterans Administration Ann Arbor Healthcare System

文字起こし

まず、無細胞の上質性眼液の違反1ミリリットルごとに70マイクロリットルのコンディショニングバッファーを追加します。クリアビーズをボルテックスして完全に混ぜます。次に、ビーズをサンプルに加え、サンプルとビーズの混合物をボルテックスします。

この混合物を3000gで室温で15分間遠心分離します。ペレットを除去せずに、上層塩を抽出し、等量の尿ペレット消化バッファーをペレットに加えます。溶液を上下にピペットで移し、ペレットを再懸濁します。

次に、再懸濁したペレット混合物にプロテイナーゼKを加えます。混合物を摂氏55度で30分間インキュベートし、次に同量のゲノム溶解バッファーを消化混合物に加えます。溶液を完全にボルテックスしてよく混ぜます。

次に、市販のスピンカラムを新しいコレクションチューブに入れます。200マイクロリットルの尿DNA調製バッファーをスピンカラムに加えます。室温で 16 、 000 G で 1 分間遠心分離し、フロースルーを廃棄します。

次に、700マイクロリットルの尿DNA洗浄バッファーをカラムにピペットで移し、実証したように遠心分離します。フロースルーを廃棄した後、スピンカラムをDNase、RNaseフリーのマイクロ遠心チューブに移します。最後に、適切な量のDNA溶出バッファーをカラムマトリックスに直接添加し、室温で3〜5分間放置した後、再び遠心分離して無細胞DNAを得ます。

眼液の細胞成分と無細胞成分の両方のDNA収量は類似していました。網膜硝子体リンパ腫関連変異の細胞性および無細胞成分のPCR分析を実施した。より高い突然変異率は、サイクル閾値の低下によって実証されたように、無細胞成分に存在しました。

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