まず、切除したばかりの人間の大網を層流フード内の収集容器から取り出します。大網をPBSに浸し、残っている血液や破片をやさしく洗い流します。メスと鉗子を使用して、組織を細かく切ります。
大網片を24ウェル培養プレートの個々のウェルに入れます。次に、ウェルに500マイクロリットルの大網培地を満たします。コンフルエントなヒトmCherry陽性卵巣がん細胞75%が入った培養フラスコに10ミリリットルの滅菌PBSを加えます。
フラスコを静かに揺らして細胞を洗浄します。PBSを除去し、EDTAに0.05%トリプシンを3ミリリットル添加します。培養フラスコを再び静かに揺らし、トリプシンEDTAを付着細胞に均等に分散させます。
次に、フラスコをインキュベーターに摂氏37度、5%の二酸化炭素で5分間入れます。その後、フラスコをインキュベーターから取り外します。次に、培養フラスコをタップして、細胞を完全に剥離します。
次に、トリプシンを中和するために3ミリリットルの大網培地を加えます。細胞懸濁液を複数回ピペットで移し、よく混ぜます。懸濁液を15ミリリットルの円錐形チューブに移します。
懸濁液を1, 200 Gで摂氏24度で5分間遠心分離します。次に、上清をピペットで取り出し、細胞ペレットを6ミリリットルの新鮮な大網培養培地に再懸濁します。10マイクロリットルの細胞懸濁液を取り、セルカウンターを使用して細胞をカウントします。
細胞懸濁液を新鮮な培地で必要な密度に希釈します。1ミリリットルの注射器で、がん細胞懸濁液を吸い上げます。シリンジに26ゲージの針を取り付けます。
次に、一対の小さな外科用鉗子を使用して、切り取られた大網の一部を拾い上げ、大網片を別の機能する滅菌皿に入れます。次に、約100マイクロリットルのがん細胞懸濁液を組織に注入します。あるいは、等量の融解した基底膜マトリックスを大網培養液と混合します。
注入するまで混合物を氷上に置きます。大網片を培養プレートのウェル内のマトリックスミックスに浸した後、プレートを20分間インキュベートします。その後、インキュベーターからプレートを取り外します。
混合物が固まったら、大網片にがん細胞を注入します。蛍光イメージングを使用して、がん細胞の注入が成功したことを確認します。確認として、注射部位に蛍光シグナルの縞が見られます。
大網細胞とがん細胞の共培養を促進するために、48〜72時間ごとに500〜200マイクロリットルの新鮮な培地を追加します。最後に、蛍光顕微鏡を使用して、卵巣がん腫瘍の成長を監視します。腫瘍の増殖は2週間で目に見えることがあります。
卵巣がん細胞は、14日目までに大網片にうまく統合されました。がん細胞は、最初の1週間で最初に大網表面に広がりました。時間が経つにつれて、細胞は集まって腫瘍を形成しました。
腫瘍量は、赤から黄色に変わった大網培地の色の変化によって確認された。
