まず、透明な腎臓組織サンプルを調製します。次に、最初にレーザー出力をアクティブにし、次に共焦点制御スイッチをオンにして、共焦点顕微鏡の電源を入れます。次に、コンピュータを起動し、顕微鏡の電源を入れ、共焦点ハードウェアを起動します。
セルフテストを実行した後、共焦点ソフトウェアを起動します。適切なレンズを選択します。立方晶R試薬からサンプルを取り出し、共焦点ディッシュに入れます。
立方体R試薬が乾燥しないように蓋をしてください。サンプルを視野の中央に移動し、サンプルにピントが合うまでピントを調整します。3D再構成の場合は、蛍光が見えなくなるまでズーム面を一方向に調整し、この位置を上端と定義します。
次に、蛍光が見えなくなるまでズーム面を反対方向に調整し、この位置を下と定義します。ダイアログボックスの右下隅にある実行ボタンをクリックして、スキャンを開始します。大きな画像を再構成する場合は、視野をサンプルの中央に配置し、これを中心として設定します。
2 x 2 の視野を選択します。ND多機能インターフェースで、Zスタックを選択して大きな画像を再構成します。必要に応じてパネルのさまざまなオプションを調整し、実行ボタンを押してスキャンを開始します。
透明な腎臓をサンプル固定アダプターに接着剤で接着し、腎臓がしっかりと取り付けられるまで待ちます。次に、腎臓をサンプルビンに浸し、サンプルビンを顕微鏡システムにスライドさせます。ハッチを密閉します。
位置指定インターフェースで、サンプルを適切な観察位置に調整します。取得インターフェースに切り替えて、光路を設定します。488ナノメートルレーザーを選択します。
405-488-561-640の光ビームフィルターを選択し、光分割フィルターブロックをSBS LP 490に設定します。カメラ 2 を選択し、疑似色を緑に変更します。チャンネルサブメニューから取得した左右のZオフセットを入力します。
最小のズームを選択し、光学的明瞭さのために微調整します。臓器全体の XY 境界と Z 範囲を特定します。次に、レーザー強度と露光時間を10ミリ秒未満に変調します。
[テストを開始] をクリックしてプロセスを開始します。組織が大きすぎる場合は、顕微鏡ソフトウェアを使用して、2つ以上の画像を画像ステッチングで組み合わせます。キャプチャしたファイルを開き、処理を選択します。
次にメソッドとステッチ、その後にメソッドパラメータが続きます。「適用」をクリックして、画像のつなぎ合わせを確定します。血管内に注入されたfitindex鎖は、糸球体の標識に利用されました。
透明化された腎臓では、ライトシート顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して糸球体をはっきりと観察することができました。
