著者は、財団Leducq（僧）と通信社国立がこの研究に資金を提供するためにLAルシェルシュ（ANR Specistemを付与）を注ぐ認める。

1。準備動物の手続き動物の倫理委員会の承認を得て、ウイルスに仕事のための施設のガイドラインに従って、HuESCおよび/またはIPSC（該当する場合）だけでなく、マウス操作、マウス胚を取得し、マウスの手術を行う。時限交配のために、プラグの日は胎生（E）0.5 / 0.5日後に交尾と考えられている。 <ol><li>マイクロインジェクション針： 子宮外マイクロインジェクションのために、1または10μMの内部先端径はそれぞれ、DNAまたは細胞を注入するシャープで円錐先端形状を取得するために、ピペットプラー/ bevellerを用いてガラスピペット（1.2ミリメートル外径ホウケイ酸キャピラリーチューブ）を引き出します。超音波媒介注射のために、35分の50ミクロンの外径/内径の先端で、1.14 mm/0.53 mmで、内/外径（OD / ID）を持つカスタマイズされた無菌の注射針を使用しています。 </li><li>シリコンで満たされたペトリ皿： マニュアルに記載されているようにシリコンを準備します。埋める〜1cmのエラストマー層との清浄なガラス直径60mmのペトリ皿。空気の泡を避けてください。 </li><li>楽器： 手術中前および無菌すべて手術器具を保管してください。 </li><li> DNAの調製： 1チューブ内で3μgのDNAと12μLのOpti-MEMを追加します。 3μLリポフェクタミン2000および12μLのOpti-MEMを別のチューブに追加します。室温で5分間インキュベートし、両方の溶液を混合。すぐに使用してください。 </li><li>細胞調製： 10 6個/ mLのDMEM（ダルベッコのイーグル培地、高グルコース、50％ラット血清）の懸濁液を準備します。最終的な細胞懸濁液50μlを8月10日の胚のために十分である。 </li><li>染料の準備： 緑色蛍光CDCFDA-SEは、25 mg / mlのDMSOで使用してください。 -20℃で20μlを、ストアを準備します使用前に滅菌生理食塩水またはPBSで1:100 / 1:200に希釈する。 </li><li>ウイルス調製： 約10 9〜10 10のtraの力価を有する市販の第3 世代 PGK-GFPを発現するレンチウイルスを使用単位/ mlのDMEMをnsducing。レンチウイルスの調製のために、Tiscornia らを参照してください。14個人用保護具を着用し、安全に使用し、ウイルスを処分。 </li></ol> 生体外注射用E9.5とE10.5胚の2。コレクション<ol><li>胎生9.5または10.5で、妊娠中のマウスを安楽死させる。 </li><li> 70％エタノールでマウスの胸部と腹部を消毒。 </li><li>腹部を開き、PBS中に室温で子宮角を取得し、M16培地を有するシリコーンで満たされたペトリ皿に2回のPBS洗浄後にそれを転送するために腹側正中切開を行います。 </li><li>子宮の血管化側が下になるようにシリコーン層に虫ピンで子宮角をピン。 </li><li>細かい鉗子で子宮の表面をカットし、表面下1ミリメートルの脱落膜のキャップ。 </li><li>優しく脱落膜の壁を広げることにより、卵黄嚢に胚を取得します。 </li><li> 37℃で胚を保存する;細胞注入の前にM16培地中のC。注射のために、各胚をM16培地で37℃で予備加温しが充填されたシリコーン皿に転送される</li></ol>実体顕微鏡下で3。、DNAや細胞注入<ol><li>ハミルトンシリンジを背面からガラスピペットを記入し、先端に気泡を除去するために、ピペットを振る。 </li><li>マイクロインジェクションホルダーにピペットを設定します。 50保持圧力（DNA）または30（セル）ヘクトパスカル、および300（セル）に150の噴射圧（DNA）ヘクトパスカルに設定してください。 0.2秒（DNA）または0.5秒（セル）に噴射時間を設定します。これらの設定は、わずかにマイクロインジェクターやピペットの種類に応じて異なる場合があります。 </li><li>適切な胚を触れることなく、卵黄嚢を通してシリコン底に胚をピン。心の領域を見て、ちょうどこの領域の上方に嚢を開きます。 </li><li>細胞注入の際に任意の運動を防止するために、胚の周囲に4つのピンを追加します。 </li><li> （manualに設定）マイクロマニピュレーターを用いて、slowlただ（図1）を注入することで、心臓の領域の上方心膜上45°の角度で、y位置ピペットチップ、。 </li><li>関心領域にピペットを移動して、注入を誘発する。可能な限り迅速にピペットを取り出します。心臓が正常にDNA /細胞注入後に暴行されていることを確認してください。 </li></ol> 4。胚、単離心臓、外植文化<ol><li>培養25％M2培地およびペニシリン/ストレプトマイシンを補充した75％ラット血清、37℃で予備加温し、40％O 2で酸素化におけるE9.5胚。 </li><li>チューブにキャップをねじ込む前に、25 mlのガラスチューブ中の2mlの培養培地を穏やかに入れる胚を追加し、40％のO 2を有する含酸素化合物。回転又は（30回転/分）で振盪しながら37℃で36時間までインキュベートする。 </li><li>所望の時点（ 例えば、24時間）で、第1の逆によって、心臓に触れることなく、微細なピンセットで慎重に心臓を解剖胚をcapitating;心臓は、遠位流出路を使用してそれを引き出して切除することは容易である。 </li><li>文化12ウェルプレートにセットマトリゲル被覆されたインサートを50％FCSを含むDMEM中で、別の36〜48時間の心臓を単離した。心臓の文化15の改良プロトコルに対してダイアー·パターソン（2013）を参照してください。 </li><li>関心領域のいずれかの外植片を作る。例として、1型コラーゲンゲル16上で48時間、房室運河（AVC）や文化を解剖。 </li></ol>ハートI N子宮内 5。超音波ガイド下注入<ol><li>超音波装置やマイクロインジェクターのセットアップ： <ol><li>レール上の40 MHzのトランスデューサおよびマイクロインジェクションのセットアップを高解像度の超音波システムを使用してください。 </li><li>注射あたり69 NLでマイクロインジェクターで注入量を設定します。マイクロインジェクターをプログラミングするためのメーカーのマイクロインジェクションのマニュアルを参照してください。 </li></ol></li><li> microiの調製njectionセットアップと注入： <ol><li>マイクロインジェクターガラスマイクロピペットを置きます。最大音量まで吸引することにより、効率的な注入、第一コートのミネラルオイルをピペットの内側を確保する。その後、針内のオイルに1-2mmを残して、再び油を取り出します。 </li><li>最大音量に達するまで注入液を吸引する。これは、先端を鈍らし、注入がより困難になりますので、針の先端を任意の表面に触れないように注意してください。 </li><li>注入中に胚を含む子宮角を安定させるために、中央にカットし、小さなスリットを備えた薄いシリコーン膜で覆われて中央に穴を有する変性ペトリ皿（直径2.5cm）を使用し、切開部位の上にそれを置く。お皿の縁の下に粘土の3-4塊を配置することによって、マウス操作テーブル上のペトリ皿を安定させる。 </li></ol></li><li>注入手順： <ol><li>麻酔し前に（必要な胚段階で）妊娠したマウスの腹部を剃るSIAは、髪を削除します。残留毛髪を除去し、70％エタノールで滅菌する化学的除毛剤で腹部を治療する。 </li><li>フェイスマスクを介して酸素/イソフルランを妊娠マウスを麻酔。残りの手順の間に1から1.5パーセントに続いて、最初の麻酔のための100％酸素、3〜5％イソフルランを使用してください。マウスが十分に静かに足および/または尾をつまんで麻酔していることを確認します。 </li><li> （37℃に加熱するように設定された）マウス操作テーブルの上にマウス仰臥位を置き、角膜の脱水を防ぐために、潤滑剤の目をカバーしています。 </li><li>電極上に電極ゲルを適用し、心拍数、呼吸数、およびECGを監視するために、電極に足をテープ。体温を監視するために、直腸温度計を置きます。 </li><li>最初のマウスを可視化し、超音波によって胚をカウントすることで妊娠していることを確認してください。腹部に超音波ゲルを適用し、膀胱の上にスキャンヘッドを配置します。一貫性を保つため、第1の袋を視覚化、膀胱の位置から開始して、左右の子宮角に胚を数える。胚の心は正常に鼓動していることを確認します。 </li><li>マウスが妊娠している場合には、粘土との将来の切開部位上のペトリ皿を置きます。料理が直接接触するように、少し腹の上の皿を押してください。 </li><li>お皿を取り外し、再び腹部を消毒。腹部と腹膜を開くには、約0.75〜1センチメートル膣の上に、1.5〜2センチメートル腹側正中切開を行います。内臓への損傷を避ける。 </li><li>ピンセットで左または右の子宮角を体外に、静かに皿のシリコン膜を介して、それを引っ張って、もう一度粘土上のお皿を安定させる。これは子宮血管の出血や、女性および/または胚の早すぎる死を引き起こす可能性があるので、引っ張って広範または操作を防ぐ。 </li><li>胚を注入したの十分な記録管理を確実にするために、再び胚を数える。 </li><li> Uに超音波ゲルを適用画像terineホーン心と脱水を防ぐために。 </li><li>画像を注射された最初の胚。胚心臓の正常な鼓動を確認し、胚の尾側頭蓋左右方向の記録を保持。必要に応じて、適切な配向を確実にするためにわずかに子宮角の位置を変更する。これは困難なことが判明した場合、次の胚に移動します。 </li><li>わずかに心膜（ 図3）の外側に、胚上記45°の角度で針を位置決めするマイクロインジェクション針を慎重に子宮を穿刺する。それは房室溝（ 図3）に向かって指すように心外膜細胞の標識のために、画像4腔像における心と針を配置。角度を調整する必要がある場合には、針を引き出し、および再配置します。これは、針を破る可能性があるため、子宮の内側の針と角度を調整しないでください。このような手足や胎盤などの他の組織を穿刺することは避けてください。 </li><li>針を動かす心膜の壁の上に、穏やかな、しかし迅速な動きでそれを穿刺。一般的には、そこにいくつかの抵抗になりますが、速すぎて針を移動すると、針の先端が心臓自体を穿刺する可能性があります。先端は房室溝の心膜腔に終わる必要があります。心膜出血例では、血液細胞は、白い雪のようなパターンとして表示されます。このような場合は、胚を注入停止し、別の胚に移る。 </li><li>注入液を注入する。心の発達への悪影響を防ぐために、心膜腔に最大限700 NLを注入する。心膜嚢のわずかな時間的膨潤させることで、適切な注入を監視します。 </li><li>注射後、外針を引き出し、その注入液を確認し、まだ針が組織断片により目詰まりしなかったことを確実にするために吐出することができる。 </li><li>画像に処理テーブルの位置を変更し、次の胚を注入する。防止するために、（1子宮角で）3-4訳注注入した胚の数を維持する反対子宮角の制御の胚を可能にするために、プロシージャは、胚発生を妨げないことを確実にするために、麻酔を延長した。 </li><li>胚の希望数を注入した後、余分な超音波ゲルを取り外し、ゆっくりとその適切な位置に戻って腹部に子宮角に配置します。 </li><li>腹膜や腹筋、および皮膚の縫合糸の第二層のための縫合糸の1層を用いて母体の腹部を閉じます。 </li><li>鎮痛薬の初回投与でマウスを注入する。前12時間の間隔で麻酔し、3つの追加の注入を終了する0.05〜0.1 mg / kgのブプレノルフィン15分の1の注入を使用してください。 </li><li>麻酔を中止し、プロシージャから十分な回復のためのマウスを監視します。家のフォローアップの所望の期間のための個々のケージに妊娠したマウス。 </li></ol></li></ol>

<ol>
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著者らは、開示することは何もありません。

上述の心臓内エクスビボ注入プロトコルは、中間段（E9.5〜E11.5）のマウス胚において少なくとも48時間心筋機能を維持するように設計されている。これらの注入のアプローチは、DNAや細胞の空間的に目標と注入を可能にします。 図1〜図3に示すいくつかの例は、ex vivoで 、そのような心内膜または心外膜細胞のEMTとして制限された心臓の地域で行われる発生過程の...

10年以上前に、ヒト胚性幹細胞（HuESCs）は、ヒト胚盤胞1に由来している。それ以来、これらの細胞は、ヒト発生生物学において未だ満たされていない質問に対処する重要な研究分野の対象となっている。 HuESCsはさらに再生医療に希望を提供してきた。近年、ヒト人工多能性幹細胞（iPS細胞）が遺伝病2のモデルを提供し、患者特有の体細胞から生成されている。心臓系統3を含む種々の細胞系列に向かって胚または誘導多能性幹細胞の分化のためのインビトロプロトコルにおける多くが、報告されている。分化した細胞は、しばしば免疫染色、および/ ​​またはインビトロ機能試験において 、RNAおよびタンパク質発現の表現型解析によってれる。しかし、多能性幹細胞誘導体は、それらが完全にセルを獲得するかどうかを試験するために適切な胚性環境に置かれなければならLの彼らの胚相手の運命と、彼らは、地域の合図に応答した、本物の生体内機能を再現するかどうか。組織工学は有望であるが、それはまだ胚組織4,5の開発、生体内での適切なすべての既知および未知の手がかりを提供していません。 マウス胚を含む胚中の染料またはレトロウイルスベクターを用いた細胞標識は、心臓の開発6時の細胞系譜の胚起源に関して重要な情報を持ってきた。例えば、単離された心臓のin vitro培養したex vivoでのマウス胚の心膜腔への注射色素は、心外膜細胞およびその子孫7を標識するために使用した。しかし、染料およびレトロウイルス細胞標識は、ほとんどが8より簡単にアクセスできますまだよく開発された臓器、またはニワトリ胚とマウス初期胚に適用されている。例外はEでターゲットしやすい脳、あるmbryos 9,10。このようなアプローチはまだ破っ胚性マウスの心臓に適用されていない。 染料またはウイルスに直接標識を補完するために、より進行した段階のマウス胚および成体マウスにおけるトレース系統を実行するために、細胞標識法は、Cre /ロックス技術を用いて、トランスジェニックマウスの分析と組み合わされている。のCre /ロックスアプローチ11しかしリコンビナーゼの発現を駆動するために使用するゲノム調節領域の時空間特異性、およびのCre / lox組換え12の効率のためにいくつかの制限を提供しています。それだけでCre発現を駆動するために使用される調節領域の活性化後に前駆体を標識することができるように、さらに、このアプローチは、完全に細胞運命の細胞移動駆動の取得の具体的な質問に対処していない。また、明らかに倫理的な問題のために、人間の胚に適用することはできません。 これらの制限を考えると、我々は新しい一連のpを設計しの標的領域にこのような蛍光色素、ウイルス、そのようなshRNAは、およびDNAベースの細胞標識ベクターとしての遺伝子発現モジュレーター、またはE9.5および開発の後期段階におけるマウス胚における細胞のような細胞標識種々の薬剤を注入するrotocols心。 DNA /細胞注入は、実体顕微鏡および48時間、または48〜72時間のために孤立した心臓や胚移植片培養までのex vivoでの胚の培養と組み合わせたシンプルなマイクロインジェクション装置を用いる。我々はまた、 子宮内マウス胎児心超音波媒介マイクロインジェクションプロトコルを報告している。この方法は胚13の開発を監視することができますし、注入物および/ ​​または標識された細胞の長期的なフォローアップが可能になります。 我々は、これらのアプローチは、臓器の機能を保存し、幹細胞の潜在的なin vitro試験よりも代表的な環境を提供することを見出した。また、移動を追跡する機会を提供標識および/またはそれらの運命をモニターするための細胞の注射。最終的に、これは、地域、組織パターニングおよびキー生物学的プロセスのより良い理解を得るべきである。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="986">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Setups / Hardware</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:411px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">40 MHz Transducer</td>
			<td style="width:175px;">VisualSonics</td>
			<td>MS550S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microinjector</td>
			<td style="width:175px;">VisualSonics</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjector&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td>5242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulator&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td>5171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Nitrogen</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>required to pressurize the injector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Rail system</td>
			<td style="width:175px;">VisualSonics</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">rotator</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>to rotate glass tube with embryos inside the incubator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Standard incubator</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>5% CO2, 37 C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">stereomicroscope</td>
			<td style="width:175px;">Zeiss</td>
			<td style="width:104px;">Discovery. V8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Vevo 2100</td>
			<td style="width:175px;">VisualSonics</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microinjection</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">borosilicate capillary tubes</td>
			<td style="width:175px;">World Precision Instrument</td>
			<td style="width:104px;">KTW-120-6</td>
			<td>1.2 mm external diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pipette puller&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sutter</td>
			<td style="width:104px;">Model P87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">microinjection needles</td>
			<td>Origio-Humagen&#160;</td>
			<td>C060609</td>
			<td>OD/ID 1.14mm/53mm, with 50/35 um OD/ID tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hamilton syringes&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Petridishes</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>10 cm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mineral oil&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td>M8410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Silicon membrane</td>
			<td style="width:175px;">Visualsonics</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>4.3x4.3 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Play-Doh</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:175px;">Vet One</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hair removal agent&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Nair</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:297px;">eye lubricant</td>
			<td style="width:175px;">Optixcare</td>
			<td>31779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Electrode gel (Signa)</td>
			<td style="width:175px;">Parker</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Suture</td>
			<td style="width:175px;">Sofsilk 5-0</td>
			<td style="width:104px;">S1173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Ultrasound gel</td>
			<td style="width:175px;">Aquasonic</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride)</td>
			<td style="width:175px;">Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.</td>
			<td style="width:104px;">NDC 12496-0757-1</td>
			<td>0.05-0.1 mg/kg in saline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone Elastomer</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Glass petridishes</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>60mm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">insect pins&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Media and culture reagents</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optimem medium</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">51985026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M2 medium&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Eagle Medium</td>
			<td style="width:175px;">Lonza</td>
			<td style="width:104px;">BE12-640F</td>
			<td>high glucose and 50% rat serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M16 medium&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">M7292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">rat serum</td>
			<td style="width:175px;">Janvier</td>
			<td style="width:104px;">ODI 7158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pennicilin/streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">15140-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">oxygen 40%</td>
			<td style="width:175px;">Air liquid</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>required to oxygenate the embryo culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">fetal calf serum</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td style="width:104px;">RVJ35882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">matrigel</td>
			<td style="width:175px;">BD</td>
			<td style="width:104px;">356230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">collagen type I</td>
			<td style="width:175px;">BD</td>
			<td style="width:104px;">354236</td>
			<td>to coat culture dishes for explant culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">culture dishes</td>
			<td style="width:175px;">Dutcher /Orange</td>
			<td style="width:104px;">131020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Injectates</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CDCFDA-SE&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Molecular Probes&#160;</td>
			<td>C1165</td>
			<td>25mg/ml DMSO. Store at -20 C. Dilute 1:100-200 in saline before use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PGK-GFP-expressing lentivirus&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>~8E9 transducing units/ml DMEM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell labeling and injection in developing embryonic mouse hearts

試験管内のプロトコルでの胚性または多能性幹細胞誘導体の運命をテストすることは、必ずしもそれらのインビボの可能性を反映していない論争の成果につながっている。好ましくは、これらの細胞は、それらの明確な表現型を獲得するために適切な胚性環境に置かれるべきである。さらに、染料またはレトロウイルスベクターで細胞を標識した後、マウスでの研究をトレースする細胞系譜はまだよく開発された臓器を、初期段階のマウス胚の大部分が制限されたままである。これらの制限を克服するために、我々は、E9.5および開発の後期段階でのマウス胚の心臓の標的領域に様々な薬剤を注入するために、標準的な超音波媒介性マイクロインジェクションプロトコールを設計した。胚性外植片または胚培養したり、さらに子宮内で開発することが残されている。これらの薬剤は、蛍光染料、ウイルス、shRNAは、細胞または由来始原幹細胞を含む。私たちのアプローチは、FUの保存を可能に臓器のnction移行し、標識および/または注入された細胞の運命を監視しながら。これらの技術は、他の臓器に拡張することができ、開発の生物学の重要な生物学的な質問への回答が非常に参考になります。

上述した注入プロトコルを用いて、細胞を標識および/または、胚性マウスの心臓に注入することができる。概念の証明として、いくつかの例は、注入プロトコルおよび ex vivo AVC外植片、単離された心臓、又は全胚培養物（ 図1）を組み合わせたものに示されている。 図1は、細胞の注入前の胚の調製を示す。卵黄嚢（ 図1A）</s...

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Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

我々は、（E）9.5およびそれ以降の段階の胚日でのマウス胚内に胚または多能性細胞に由来する内因性および移植細胞の細胞運命および表現型の両方を監視するために、染料を注入するためにDNAベクター、ウイルス、および細胞を一連の方法を記載開発。

マウス胎児心臓の開発に細胞標識と注入

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...

cell-labeling-and-injection-in-developing-embryonic-mouse-hearts

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K ビュー.  Aix-Marseille University. 我々は、（E）9.5およびそれ以降の段階の胚日でのマウス胚内に胚または多能性細胞に由来する内因性および移植細胞の細胞運命および表現型の両方を監視するために、染料を注入するためにDNAベクター、ウイルス、および細胞を一連の方法を記載開発。 

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Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

FMラベリングを用いた神経細胞の測定エキソサイトーシス

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

生物学

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of the predominant imaging modalities to assess the restoration of the injured myocardium. Furthermore, ex-vivo labeling agents, such as iron-oxide nanoparticles, have been employed to track and localize the transplanted stem cells. However, this method does not monitor a fundamental cellular biology property regarding the viability of transplanted cells. It has been known that manganese chloride (MnCl2) enters the cells via voltage-gated calcium (Ca2+) channels when the cells are biologically active, and accumulates intracellularly to generate T1 shortening effect. Therefore, we suggest that manganese-guided MRI can be useful to monitor cell viability after the transplantation of hESC into the myocardium.
In this video, we will show how to label hESC with MnCl2 and how those cells can be clearly seen by using MRI in vitro. At the same time, biological activity of Ca2+-channels will be modulated utilizing both Ca2+-channel agonist and antagonist to evaluate concomitant signal changes.

In this video, we are showing how to label human embryonic stem cells (hESC) with manganese chloride (MnCl2) which can enter cells via voltage-gated calcium channels when the cells are biologically active. Additionally, we show the use of MnCl2 as cellular MRI contrast agent to determine the in vitro viability of hESC.

磁気共鳴イメージングのためのヒト胚性幹細胞のin vitroでラベリングの

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

の電子顕微鏡のための胚の調製ショウジョウバエ胎児心臓の管

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

マウスES胚細胞の単離と導出

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is often the most effective and noninvasive form of delivery of an agent of interest. In the zebrafish (Danio rerio), IV injection of drugs has long been a challenge because of the small vessel diameter. This has also proved a significant hurdle for the injection of cells during hematopoeitic stem cell transplantation. Historically, injections into the bloodstream were done directly through the heart. However, this intra-cardiac procedure has a very high mortality rate as the heart is often punctured during injection leaving the fish prone to infection, massive blood loss or fatal organ damage. Drawing on our experience with the mouse, we have developed a new injection procedure in the zebrafish in which the injection site is behind the eye and into the retro-orbital venous sinus. This retro-orbital (RO) injection technique has been successfully employed in both the injection of drugs in the adult fish as well as transplantation of whole kidney marrow cells. RO injection has a much lower mortality rate than traditional intra-cardiac injection. Fish that are injected retro-orbitally tend to bleed less following injection and are at a much lower risk of injury to a major organ like the heart. Further, when performed properly, injected cells and/or drugs quickly enter the bloodstream allowing compounds to exert their effect on the whole fish and kidney cells to easily home to their niche. Thus, this new injection technique minimizes mortality while allowing efficient delivery of material into the bloodstream of adult fish. Here we exemplify this technique by retro-orbital injection of Tg(globin:GFP) cells into adult casper fish as well as injection of a red fluorescent dye (dextran, Texas Red ) into adult casper fish. We then visualize successful injections by whole animal fluorescence microscopy.

Here we show how to do retro-orbital injection in adult zebrafish.

アダルトゼブラフィッシュにおける眼窩インジェクション

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

マウスの錐体光受容体からの単一細胞サクション録音

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

ヒト胚性幹細胞のコロニーの成長のビデオバイオインフォマティクス解析

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

生体イメージングおよび卵巣癌の同所性マウスモデルにおける治療的処置の

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

のためのシステム<em&gt; ex vivoで</em胚膵臓&gt;培養

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme

Orofacial clefts are the most frequent craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal facial development3. In human and mouse, initial growth and patterning of the face relies on several small buds of tissue, the facial prominences4,5. The face is derived from six main prominences: paired frontal nasal processes (FNP), maxillary prominences (MxP) and mandibular prominences (MdP). These prominences consist of swellings of mesenchyme that are encased in an overlying epithelium. Studies in multiple species have shown that signaling crosstalk between facial ectoderm and mesenchyme is critical for shaping the face6. Yet, mechanistic details concerning the genes involved in these signaling relays are lacking. One way to gain a comprehensive understanding of gene expression, transcription factor binding, and chromatin marks associated with the developing facial ectoderm and mesenchyme is to isolate and characterize the separated tissue compartments.
Here we present a method for separating facial ectoderm and mesenchyme at embryonic day (E) 10.5, a critical developmental stage in mouse facial formation that precedes fusion of the prominences. Our method is adapted from the approach we have previously used for dissecting facial prominences7. In this earlier study we had employed inbred C57BL/6 mice as this strain has become a standard for genetics, genomics and facial morphology8. Here, though, due to the more limited quantities of tissue available, we have utilized the outbred CD-1 strain that is cheaper to purchase, more robust for husbandry, and tending to produce more embryos (12-18) per litter than any inbred mouse strain8. Following embryo isolation, neutral protease Dispase II was used to treat the whole embryo. Then, the facial prominences were dissected out, and the facial ectoderm was separated from the mesenchyme. This method keeps both the facial ectoderm and mesenchyme intact. The samples obtained using this methodology can be used for techniques including protein detection, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay, microarray studies, and RNA-seq.

A protocol for separation of embryo facial ectoderm and mesenchyme is described. We use Dispase II to treat whole embryos first, dissect whole facial prominences out, and then separate the facial ectoderm and mesenchyme.

マウス胚性外胚葉顔と間葉の分離

 Orofacial clefts are the most frequent  craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal ...