CENP-EノックアウトHeLa細胞のトランスフェクション、単離、スクリーニング

まず、0.25%トリプシン-EDTA溶液をHeLa細胞に添加し、摂氏37度で2〜3分間インキュベートします。ピペッティングで細胞を穏やかに解離し、細胞継代用に1対4の比率で新しいプレートに播種します。プラスミドをHeLa細胞にトランスフェクションするには、1マイクログラムのバリデーション済みPX458 sgRNAプラスミドと50マイクロリットルの還元血清培地をチューブ A.In チューブBで混合し、2マイクロリットルのトランスフェクション試薬と50マイクロリットルの還元血清培地を穏やかに混合し、室温で5分間インキュベートします。

次に、チューブAとBの内容物を混ぜ合わせ、室温でさらに5分間インキュベートします。混合物を12ウェルプレートに加え、細胞を摂氏37度で6時間インキュベートします。インキュベーションの最後に、培地を新しいDMEM培地と交換します。

24時間後または48時間後、蛍光顕微鏡でHeLa細胞を調べてトランスフェクション効率を評価します。0.25%トリプシンEDTAを使用してトランスフェクションしたHeLa細胞を完全に解離し、摂氏37度で3〜5分間インキュベートします。次に、ノイバウアーチャンバーまたは自動セルカウンターを使用して細胞をカウントします。

段階希釈法に従って、トランスフェクションした集団ごとに細胞を3つの別々の96ウェルプレートに播種します。細胞を加湿したインキュベーターに1〜2週間戻します。CENP-Eノックアウトの表現型ベースのスクリーニングおよびバリデーションでは、24ウェルまたは12ウェルプレートで細胞を5〜7日間解離および増殖させます。

コロニー径の小さい変異細胞を、倍率10倍、20倍の対物レンズを備えた倒立顕微鏡でスクリーニングします。次に、メーカーの指示に従って、Column Animal Genomic DNA Extraction Kitを使用してDNA抽出用の細胞を回収し、ポリメラーゼ連鎖反応をセットアップします。ターゲットDNAをpMD18-Tベクターにライゲーションします。

ライゲーションしたプラスミドをコンピテントDH5-Alpha細胞にトランスフェクションし、クローン選択のための培養を進めます。CENP-Eノックアウトの種類を特定するには、メーカーのガイドラインに従って、プラスミド抽出キットを使用してプラスミドDNAを単離します。次に、M13フォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて、各コロニーのプラスミドDNAのサンガーシーケンシングを実施します。

野生型およびCENP-E変異体HeLa細胞を、24ウェルプレートの12mmガラスカバースリップに播種します。DMEM培地全体を除去し、4%パラホルムアルデヒドおよびPBS溶液を用いて室温で10分間細胞を固定します。次に、核をDAPIで室温で5分間染色します。

蛍光顕微鏡を用いて、染色体アライメント表現型に基づくCENP-E変異細胞の観察と検証を行います。コロニーの表現型スクリーニングにより、CENP-Eノックアウト細胞は対照群と比較して染色体のミスアライメントの増加を示しました。