CRISPR/Cas9を介した CENP-E ノックアウトHeLa細胞の免疫蛍光染色および高分解能共焦点顕微鏡

まず、野生型とカバースリップ上で増殖するCENP-E変異体HeLa細胞のプレートを取ります。細胞を4%パラホルムアルデヒドとPBS固定液で室温で10分間固定します。その後、PBSに5分ずつ2ラウンド浸します。

次に、0.25%Triton X-100とPBSで細胞を室温で10分間透過処理します。PBSにそれぞれ5分間2ラウンド浸します。1%BSA PBSと0.1%Tween 20で室温で1時間細胞をブロッキングします。

一次抗体を1%BSAおよびPBSTで希釈し、サンプルを摂氏4度で12時間インキュベートします。一次抗体溶液を廃棄します。次に、細胞をPBSでそれぞれ5分間、3回すすぎます。

希釈した二次抗体を細胞に添加し、室温で2時間インキュベートします。次に、二次抗体を廃棄します。次に、細胞をPBSで3回、それぞれ5分間すすぎます。

DAPIを用いて室温で5分間核を染色します。スライドに封入剤を取り付け、マニキュアで密封します。倍率63倍、開口数1.40の対物レンズを取り付けた走査型共焦点顕微鏡で蛍光画像を観察し、記録してさらに分析します。

対照群およびCENP-E変異群の免疫蛍光染色により、CENP-E変異体クローン1細胞ではCENP-Eタンパク質の蛍光強度が完全にノックアウトされ、CENP-E変異体クローン3細胞では有意に低下したことが示された。染色体がずれている中期細胞の割合は、対照細胞と比較して、クローン1および3で増加しました。一方、中期細胞の割合は、クローン1細胞とクローン3細胞で有意に増加しました。

さらに、CENP-E欠失後のクローン1および3群では、対照群と比較して、間期細胞の割合がわずかに増加しました。前期細胞、後期細胞、終期細胞の割合は、CENP-E欠失後にわずかに減少したが、中期細胞の割合はCENP-E欠失後に増加した。