まず、200マイクロリットルの容量の10、000個の肝細胞癌細胞をDMEMと10%FBSで96ウェルプレートに播種します。加湿したインキュベーター内で、5%の二酸化炭素下で37°Cで細胞を一晩インキュベートします。翌日、培地を交換し、細胞をさまざまな濃度の過酸化水素とメナジオンで処理します。
5ミリグラムのDHEを1ミリリットルのDMSOに溶解します。使用溶液については、100マイクロモルのアリコートを予め温めたDMEM培地で10マイクロモルの濃度に希釈します。作業染料溶液を5〜10秒間ボルテックスして、適切に混合します。
次に、癌細胞を静置する前に、各ウェルから試験培地を取り除きます。次に、各ウェルをPBSで静かに洗浄します。100マイクロリットルの作業用染料溶液を各ウェルにピペットで移します。
プレートを摂氏37度で30分間インキュベートします。DHEを含むメディアを各ウェルから取り出します。マルチチャンネルピペットを使用して、PBSで各ウェルを3回洗浄します。
次に、Hoechst 33342核染色色素を含む200マイクロリットルのPBSを各ウェルにピペットで移します。インキュベーション後、プレートをハイコンテントスクリーニングプラットホームに移します。Cellomics CX7ハイコンテントスクリーニングソフトウェアを起動します。
メーカーの仕様に従ってイメージングプラットフォームを校正します。装置データベースでプレートのブランドに固有のシステムパラメータを開きます。次に、サンプルの入ったプレートをイメージングシステムの加熱ステージに慎重に置きます。
プレートがしっかりと配置され、正しい方向にあることを確認します。次に、マイクロプレートをそっと押し下げて、ステージに対して平らに固定されるようにします。プレートが正しく配置されたら、Controlキーを押し続けます。
次に、[制御]と[OK]をクリックして、[プレートのロード/アンロード]ダイアログ ボックスを開きます。イメージングパラメータを選択するには、Cellomics BioApplications インターフェースでターゲット活性化モードを開きます。核染色およびDHE蛍光プローブと互換性のあるデュアルチャンネルデータ取得のための新しいプロトコルを作成します。
次に、画像取得に必要な対物レンズを指定し、適切な倍率を選択します。次に、露光時間、カメラの曲げ、Z スタック間隔を指定します。イメージングパラメータを設定したら、装置のさまざまなアルゴリズムを使用して、関心のある主要な追跡オブジェクトを特定します。
同定されたオブジェクトをセグメント化した後、各セルタイプに固有の特定のサイズ、形状、および強度パラメータに基づいてプライマリオブジェクトを検証します。オブジェクトの周囲に関心領域を定義し、その周囲に 20 マイクロメートルの円を設定します。[Population Characterization] タブをクリックし、スキャン制限をウェルあたり 1000 セルに設定し、フィールドあたり最低 10 個のオブジェクトを設定します。
次に、[Launch View]をクリックして、各ウェルプレートをスキャンします。次に、ビュー分析ソフトウェアを起動し、定量的データパラメータをCSV形式でエクスポートして、追加の分析を行います。過酸化物曝露は、用量依存的にすべての細胞株にわたってROS誘導蛍光の統計的に有意な増加をもたらしました。
メナジオンでは、JHH-4細胞は用量依存的な蛍光強度の増加を示しました。しかし、蛍光の有意差は、他の2つの細胞株において高濃度でのみ観察された。
