まず、イメージングソフトウェアの電源を入れます。「取得」ウィンドウを開きます。露光時間を 500 ミリ秒に、カメラ領域をフルチップに、ビニングを 1 に設定してから、必要なチャンネルの照明を設定します。
細胞質攪拌では、透過光を使用して卵母細胞の核小体に焦点を合わせます。核スペックル実験では、SRSF2 GFP液滴に着目します。取得速度を最適化するには、[特殊]タブで、カメラのシャッターを露出用に開き、クリアモードを設定してプリシーケンスをクリアします。
次に、[Stream Acquisition] ウィンドウを開きます。[Acquire]タブで、アクイジション・モードを[stream to RAM]に、フレーム数を480に設定します。フレームレートで画像を取得するためのカメラパラメータと、スキップするフレーム数をゼロに設定します。
デジタル カメラ コントローラーのパラメーター タブで、カメラの状態を [停止] に、シャッター モードを [開かない] に、クリア モードに設定してプリ シーケンスをクリアし、フレーム数の平均を 1 に設定します。次に、オブジェクトの周囲の関心領域を調整します。[Stream Acquisition] ウィンドウで [Acquire] をクリックしてムービーを起動します。
取り込み後、ムービーをtiffファイルとして保存します。画像解析の場合は、ImageJ または Fiji を開きます。プラグインで、CIRBをクリックしてVerlhacメニューを開き、Oocyte Nucleus Shapeを選択します。
ダイアログボックスで、解析するムービーを含むフォルダーを選択します。次に、シータ角度とトリミングの余白を選択します。次に、XYキャリブレーションと時間間隔を選択し、をクリックして、時間の経過とともに平均形状をプロット OK.To、スプレッドシートで、定義されたシータ角度ごとにすべての時間点Tの平均半径Rを計算します。
各 T と θ について、半径小文字の r から経時的な平均半径 R を減算します。最後に、1 つの条件から、各原子核とすべての原子核のすべての時点 T とすべての角度 θ の変動の平均を計算します。対照卵母細胞では、核プローブYFP Rangoで可視化されたように、核は有意な末梢変動を示しました。
対照的に、細胞骨格力が破壊された卵母細胞の核は、時間の経過とともに安定していました。核重心からその周辺までの距離のばらつきは、細胞骨格力が破壊された卵母細胞と比較して、対照卵母細胞が6倍に増加することを明らかにしました。対照卵母細胞の核スペックルは、破壊された細胞質力と比較して、液滴表面の変動が大きかった。
