まず、EMDBの追加データからアポエノラーゼのシャープ化されていないハーフマップをダウンロードします。次に、ChimeraXを開き、ツールバーの[開く]をクリックします。アポエノラーゼのハーフマップを選択します。
これをコマンドラインに入力してハーフマップを結合し、apo-enolaseのシャープ化されていないマップを取得します。マップのしきい値を 0.0595 に調整して、ノイズを減らします。次に、このコマンドを入力して、結合されたマップの名前を変更します。
[開く]をクリックします。PEP enolase unsharpened half-maps を選択し、コマンド ラインにこのコマンドを入力します。マップの閾値を 0.0721 に調整してノイズを減らし、マップの名前を変更します。
次に、アポエノラーゼとPEPエノラーゼのシャープ化されていないマップを表示し、マップパネルでフィットをクリックして差分マップを計算します。このコマンドをコマンドラインに入力して、apo-enolaseマップからPEPエノラーゼマップを減算し、しきい値を調整します。減算されたマップを緑で色付けし、正の密度を示します。
次に、PDBを開き、結核菌八量体エノラーゼの座標をダウンロードします。次に、ChimeraXで、ツールバーから[開く]をクリックし、ファイル名を選択します。Molecule Display、Hide Atoms、Show Cartoon をクリックします。
このコマンドを入力して、モデルの名前を変更します。[モデル]パネルからモデルを選択します。ツールバーの右マウスをクリックします。
次に、[Move Model] をクリックし、モデルを PEP エノラーゼ マップの近くに配置します。マップに対してモデルを位置合わせします。このモデルを PEP エノラーゼのシャープ化されていないマップに当てはめるには、コマンド ラインに次のコマンドを入力します。
フィット感を確認してください。色と構造の表現を調整します。ターミナルから「coot」と入力して「Coot」を開き、「File」をクリックし、「Open Coordinates」をクリックして、Apo-enolase.pdbを選択します。
次に、EMDBからPEP結合エノラーゼシャープマップをダウンロードします。このマップをCootで表示するには、[ファイル]と[マップを開く]をクリックします。マウスの中央ボタンをスクロールして、しきい値を 7.00 シグマに設定します。
[検証] をクリックし、次に [モデル化されていない BLOB] をクリックします。新しいウィンドウで、RMSD として「7.00」と入力し、[BLOB の検索] をクリックします。モデル化されていないリガンド密度を活性部位残基であるセリン42、リジン386、およびアルギニン364の近くに配置してください。
次に、[ファイル]、[モノマーの取得]の順にクリックし、「PEP」と入力して、Coot Monomer LibraryからPEPモノマーモデルファイルを取得します。サイドバーメニューの「Rotate Translate Zone Chain Molecule」オプションを使用して、PEP分子を密度に移動します。次に、サイドバーメニューの[Real Space Refined Zone]をクリックして、PEP分子を密度に合わせます。
適合性を評価し、完了したら[同意する]をクリックします。EditタブのMerge Moleculeオプションを使用して、フィットしたリガンドをapo-enolaseモデルにマージし、モデルをPEP enolase.pdbとして保存します。次に、[Calculate]、[NCS Tools]、[NCS Ligands]の順にクリックして、座標ファイル内の残りのモノマーに配位子を追加します。
「protein with NCS」オプションの場合は、座標ファイル apo-enolase を選択します。pdb とチェーン ID A を NCS マスターチェーンとして使用します。次に、リガンドを含む分子として、アポエノラーゼを選択します。
pdb を座標ファイルとして、チェーン ID J、残基番号 121 です。「Find Candidate Positions」をクリックします。個々の候補リガンドをクリックし、フィットを視覚的に分析します。
次に、ポインタのところで「Place Atom」をクリックし、「Pointer Atom Type」リストから「MG」を選択して、活性部位密度の 2 つのマグネシウムイオンをモデル化します。また、対称性に関連するモノマーにマグネシウムイオンを添加します。対称性に関連するマグネシウム原子の適合度を評価します。
[ファイル]をクリックし、[座標を保存]をクリックしてモデルを保存します。ファイル名を選択し、「enolase」、「PEP」、「MG.pdb」と入力します。次に、PhoenixGUIを開きます。
既定のパラメーターを使用して、保存されたモデルと PEP バインドのシャープ化されたマップで、実空間の細分化ジョブを実行します。モデル化されたリガンドを可視化するには、PyMOL を開き、[ファイル] をクリックし、[開く] をクリックして、Phoenix リファインメント ジョブからリファインされたモデルを読み込みます。また、PEPバウンドのシャープマップをロードします。
マップの名前を PEP sharpened に変更するには、[アクション] をクリックし、[名前の変更] をクリックします。次に、Displayをクリックし、次にSequenceをクリックしてリガンドを選択します。これをコマンドラインに入力し、Enterキーを押します。
これにより、選択内容の周囲にマップの密度が刻まれます。mesh_ligandオブジェクトの横にある最後のボックスCをクリックして、リガンドメッシュの色を青に変更します。PEPイオンとマグネシウムイオンと相互作用する活性部位残基をスティックと球体で、エノラーゼ酵素を漫画で表示します。
メッシュサイズを設定します。これをコマンド ラインに入力すると、レイ トレーシングが実行され、イメージが PNG ファイルとして保存されます。解糖中に、エノラーゼは2つのホスホグリセリン酸を、さまざまな代謝経路の重要な中間体であるホスホエノールピルビン酸に変換します。
アポ酵素とPEP結合酵素の差マップは、明確なリガンド密度を示しました。また、モデル化されたタンパク質の活性部位に余分な密度が観察されました。ホスホエノールピルビン酸イオンと2つのマグネシウムイオンは、リガンド近傍で観察された密度でモデル化されました。
ホスホエノールピルビン酸は、リジン386やアルギニン364などのいくつかの活性部位残基と水素結合を形成しました。マグネシウムイオンは、アスパラギン酸241、グルタミン酸283、アスパラギン酸310、およびホスホエノールピルビン酸のリン酸塩と金属配位結合を形成しました。
