この手順では、低分子粉末から3次元構造まで数分で進む方法を示します。これは、化学コミュニティにとって変革的な手法です。多くの化合物は容易に大きな結晶に成長しません。
MicroEDでは、ナノメートルサイズの結晶から原子分解能の構造を決定することができます。手順を実演するのは、UCLAの教授であるマイク・マルティノウィッツ博士です。はじめに、少量の粉末、液体、または固体を小さなバイアルまたはチューブに移します。
すでに粉末状のサンプルの場合は、サンプルが必要になるまでキャップを使用してチューブを密封します。同様に、液体サンプルを粉末に乾燥させます。スライドガラスカバーの一方の端にプラスチックフィルムを巻き付けます。
TEMグリッドをカバースライドの上のフィルムに置き、茶色のカーボン面を上に向けて配置します。次に、グリッド付きのスライドをグロー放電チャンバーに入れ、30ピコアンペアの負の設定を使用してカバースライドを約15秒間グロー放電します。サンプルをグリッドに追加する前に、ろ紙で裏打ちされたガラスペトリ皿内のカバースライドにグリッドを保管します。
ピンセットを使用して、覆われたペトリ皿からグロー放電TEMグリッドを取り外し、カーボン側を上に向けて円形のろ紙の上に置きます。小さなへらを使用して、非常に小さな粉末のスクープを取り除き、ろ紙のTEMグリッドのすぐ隣にある小さな正方形のガラスカバースリップに置きます。パウダーの上に別の小さな正方形のスライドガラススライドまたはカバースリップを置きます。
指で、2つのスライドガラスをそっとこすり合わせて微粉末を作りました。カバースリップを傾けてろ紙のTEMグリッドのすぐ上に配置し、グロー放電TEMグリッドのわずか数センチ上でカバースリップをこすり合わせ続けます。粉末がグリッドに向かって落下しているかどうかを確認します。
2つのガラスカバースリップの1つを取り外して、細かく粉砕された粉末のカバーを外します。次に、ろ紙を使用して、カバースリップからTEMグリッド上に微粉末をそっと払い落とします。ピンセットのセットを使用してTEMグリッドの端をつかみ、チップがグリッドの正方形に穴を開けないようにします。
グリッドをろ紙から1〜2センチ上に持ち上げ、グリッドを下の紙に対して90度の角度にします。グリッドをしっかりとピンセットしたままピンセットを軽くたたいて、緩い粉を取り除きます。ピンセットの先端をグリッドで液体窒素容器に直接手で動かしてグリッドを凍結し、グリッドとピンセットの沸騰が止まるまで待ちます。
液体窒素下で、カーボン支持フィルムの前にサンプルがビームに当たるように、カーボン側を向けたサンプルホルダーにグリッドを配置します。サンプルホルダーをTEMにロードし、グリッドが常に液体窒素温度に保たれるようにします。オートローダーシステムの場合、クリップされたグリッドを液体窒素冷却容器内のカセットに入れると、オートローダーロボットは、オートローダーとカラムの間を行き来するためにサンプルを安全に保ちながらカセットを受け入れることができます。
TEMカラムバルブを開き、ハンドパネルを使用して倍率を可能な限り低い倍率に調整します。ハンドパネルの強度ノブを調整して、蛍光スクリーンに丸い明るい領域が表示されるようにして、ビームを見つけます。高解像度のMicroEDデータを収集する前に、適切なソフトウェアを使用して低倍率ですべてのグリッドアトラスを取得し、顕微鏡が低倍率と高倍率の両方のイメージングに対して適切に位置合わせされていることを確認します。
カーボンが壊れておらず、フィルム上に黒または暗い粒子が見えるグリッドの正方形を特定します。ハンドパネルのジョイスティックを使用して物理的にグリッド内を移動するか、収集されたアトラスを仮想的にナビゲートして、壊れておらず、微小結晶を含むグリッドの正方形を検索します。これらの各正方形の中心を調査用のグリッド位置のリストに追加し、顕微鏡のユーザーインターフェイスまたは顕微鏡自動化ソフトウェアのノートブックに追加できます。
倍率を500〜1300倍に設定します。格納されている各グリッド位置の中心高さを調整し、保存した Z 値をメモした位置に更新します。蛍光灯またはフラットカメラで、グリッド上の小さな黒い斑点や粒子を検索します。
良いサンプルは、多くの場合、高倍率で鋭いエッジを持ち、順番に結晶を示唆しています。位置したポテンシャル結晶を画面の中央に移動し、TEMが高倍率モードに入るように倍率を上げます。選択した領域の開口部を挿入し、絞りを大きいサイズまたは小さいサイズに変更して、選択した領域が水晶振動子よりも大きくなるようにします。
蛍光スクリーンが挿入されていることを確認するTEMハンドパネルの屈折ボタンを押して、屈折モードに切り替えます。拡大ノブを使用してカメラの長さを調整し、エッジが少なくとも1オングストローム解像度になるようにします。中心スポットができるだけシャープで小さくなるように回折焦点を調整します。
回折シフトノブを使用して、中央ビームを蛍光スクリーンの中央に移動します。ビームストップを挿入して、ビームがその後ろにあることを確認します。蛍光スクリーンを持ち上げて、カメラで短時間露光します。
対応する回折パターンを調べて、パターンに列と行に規則的に配置された鋭いスポットがあることを確認します。結晶座標をTEMユーザーインターフェイスに保存するか、書き留めてから、現在のグリッド正方形上の関心のあるすべての潜在的な結晶に対して回折スクリーニングを繰り返します。遮蔽された水晶振動子を1000倍以上の倍率で中央に配置し、自動ルーチンまたは手作業を使用して水晶の中心高さを調整します。
結晶のサイズと形状に最適な選択した領域開口部を挿入します。ステージを負方向と正方向に傾けて、画像がグリッドバーで遮られるようにします。また、ローリングシャッター読み出しモードを備えた最新のカメラで1秒ごとにデータを読み取ることにより、データ収集の目的でこれらの角度に注意してください。
最大傾斜速度の割合と停止するタイミングを顕微鏡のユーザーインターフェースまたは専用ソフトウェアで指定して、回転速度を設定します。さまざまな形式でデータを保存すると、個々のフレームまたは画像のスタックとして記録されます。微小結晶から収集された結晶学的形式の屈折動画は、TEMグリッド上で同定されたカルバマゼピン微結晶からの連続回転MicroEDデータセットを示しています。
データ収集、統合、および構造ソリューションの後、高解像度の構造が決定され、その明確さはデータの品質と完全性に依存します。サンプルをグリッドに適用することは、良好なデータを取得するために重要です。この方法に従って、標準的な結晶学ソフトウェアを使用してデータをさらに処理することができます。
MicroEDが低分子の強力な方法であることを実証することで、非常に重要な分子の新しい構造を解決するために世界中で使用が開かれました。
