まず、10cmの皿で培養した293FTの細胞を取り出し、培地を吸引します。細胞を5ミリリットルのPBSで洗浄します。次に、1ミリリットルのトリプシンEDTAを加え、摂氏37度で3〜5分間インキュベートして、皿から細胞を分離します。
インキュベーション後、9ミリリットルの完全DMEMを細胞に加え、トリプシンを中和します。ピペットを上下に繰り返して均質な単一細胞懸濁液を生成し、細胞を15ミリリットルのチューブに移します。直ちに20マイクロリットルの細胞を1.7ミリリットルのチューブに移し、20マイクロリットルのトリパンブルー染色と混合する。
自動セルカウンターまたは血球計算盤を使用して細胞をカウントします。適切な量の細胞を50ミリリットルのチューブに移し、完全なDMEMで希釈します。2ミリリットルの細胞懸濁液を6ウェルプレートの各ウェルに加えます。
細胞を摂氏37度、二酸化炭素10%で一晩インキュベートします。トランスフェクションに先立ち、ナノルシフェラーゼ CRAF および 1433 ゼータ ハロープラスミドを希釈し、TE バッファー中の pCDNA3 エンプティベクターを pCDNA3 エンプティベクターと共に調製します。滅菌済みの1.7ミリリットルチューブのセットにラベルを付けます。
100マイクロリットルのトランスフェクション培地を、発現コンストラクトとともに各チューブに加えます。次に、2マイクロリットルのトランスフェクション試薬を加え、穏やかにボルテックスして混合します。パルスは、微量遠心分離機でチューブを短時間回転させた後、チューブを摂氏約25度で15分間インキュベートして、トランスフェクション複合体を形成する。
その後、トランスフェクション複合体を細胞に滴下し、摂氏37度で16〜20時間インキュベートして、ハロータンパク質とナノタグタンパク質を発現させます。
