まず、滅菌された1.7ミリリットルのチューブを3セット、滅菌された15ミリリットルの円錐形ボトムチューブを1セットラベル付けします。15ミリリットルのチューブインサートを備えたスイングバケット遠心分離機を準備し、摂氏4度に予冷します。トランスフェクションした293FT細胞を入れた6ウェル細胞培養プレートを取ります。
井戸からメディアを吸引します。250マイクロリットルのトリプシン-EDTAを加え、細胞が剥離し始めるまで37度でインキュベートします。次に、10%FBSを添加したアッセイ培地1ミリリットルを各ウェルに加え、激しくピペットで動かしてシングルセル懸濁液を作製します。
1ミリリットルの細胞懸濁液を標識済みの15ミリリットルチューブに移します。これらの各チューブに1ミリリットルの10%FBS添加アッセイ培地を加え、5回反転させて混合します。その後、直ちに20マイクロリットルの細胞懸濁液をチューブセット1に移します。
次に、予冷した遠心分離機で15ミリリットルのチューブを250gで5分間遠心分離します。20マイクロリットルのトリパンブルー細胞染色液をセット1の細胞と混合し、セルカウンターまたは血球計算盤を使用してカウントします。遠心分離機から15ミリリットルのチューブを取り出した後、細胞ペレットから培地を吸引し、ペレットを無血清アッセイ培地に再懸濁してシングルセル懸濁液を作成します。
384ウェルプレートと6ウェルプレートで細胞をリフレレートするには、15ミリリットルのチューブを数回反転させて均一な細胞懸濁液にし、セット2とセット3で500マイクロリットルを1.7ミリリットルのチューブに移します。0.5マイクロリットルのDMSOをセット2に加え、0.5マイクロリットルのHalo 618リガンドをチューブセット3に追加してよく混合します。DMSOおよびリガンド陽性細胞懸濁液を試薬リザーバーの別々のウェルに移します。
マルチチャンネルピペットを使用して、各懸濁液の40マイクロリットルを384ウェル培養プレートに移します。残りの細胞を新鮮な6ウェル培養プレートに移し、その後のウェスタンブロット分析を行い、384ウェルプレートと6ウェルプレートの両方を摂氏37度、二酸化炭素5%で一晩インキュベートします。摂氏37度に予熱した無血清アッセイ培地を服用してください。
解凍したナノルシフェラーゼ基質を無血清アッセイ培地で1:100に希釈し、試薬リザーバーに移します。マルチチャンネルピペットを使用して、10マイクロリットルの基質混合物を384ウェル培養プレートの各ウェルに移します。プレートを1分間ゆっくりと回転させます。
384ウェルプレートをマルチモードプレートリーダーに挿入し、セルを持つすべてのウェルからの460ナノメートルと618ナノメートルの放射を記録します。与えられた式を使用して、ビヒクル陽性とリガンド陽性の生のBRET比をミリブレット単位で計算します。リガンド正のBRET比からビヒクル正のBRET比を差し引いて、補正されたBRET比を計算します。
ナノCRAFS259A変異体はBRETシグナルを約45%、ナノCRAFS621A変異体は約25%減少しますダブル変異体はBRETシグナルをほぼ排除します。
