まず、冷凍したNaegleria gruberi栄養型を摂氏37度に3分間置きます。栄養型をPYNFH培地で摂氏25度で約80%コンフルエントになるまで培養します。コンフルエントフラスコを氷の上に5〜10分間置き、付着した栄養型をプラスチックから放出します。
次に、フラスコを静かに回転させて、残っている付着細胞を取り除きます。培地を滅菌包嚢培地と交換して、Naegleria gruberi細胞を包嚢します。48時間後、フラスコから嚢胞を取り除きます。
嚢胞を600 x gで摂氏4度で10分間遠心分離します。遠心分離後、嚢胞を10%ウシ胎児血清を含む2ミリリットルのPYNFH培地に再懸濁して細胞を脱栄養型が出現して80%の合流性に達するまで、嚢胞を摂氏25度で72時間インキュベートします。
栄養型をトランスフェクションするには、まず1ミリリットルの栄養型を6ウェルの平底組織培養プレートにプレートします。次に、プラスミドトランスフェクション試薬混合物を室温で10分間インキュベートします。トランスフェクションの直前に、栄養型単層から約800マイクロリットルの培地をピペットで取り出します。
次に、200マイクロリットルのプラスミドトランスフェクション試薬混合物を栄養型試薬に加えます。15分ごとにプレートを静かに回転させて、メディアがプレートの端に集まり、乾燥するのを防ぎます。1時間後、10mLの10X DNaseバッファーに10ユニットのDNaseを添加し、ウェルに加えます。
プレートを摂氏37度で15分間インキュベートし、残留プラスミドDNAを除去します。次に、プレートを1ミリリットルの成長培地で一度洗い、次に2ミリリットルの新鮮な培地を追加します。プレートを摂氏25度で24〜36時間インキュベートします。
インキュベーションが完了したら、ウェルの内容物を新しいプレートに1:2の比率で分割します。次に、残りの井戸から栄養型を採取し、さらに分析します。Naegleria gruberiの栄養型はアメーバ状で、標準的な培養条件下で培養フラスコに付着していました。
氷上でのインキュベーションにより、丸くて付着しない栄養型になりました。栄養型をエンシストメント培地でインキュベートすると、栄養型がエンシスト化されました。
