まず、抽出したマウス組織を、50%の氷冷生理食塩水と50%のメタノールを含むティッシュグラインダーチューブに入れます。乳棒をグラインダーチューブに挿入し、ゆっくりと5回回転させて組織を均質化します。均質化した組織を直ちに15ミリリットルのチューブに移します。
ホモジナイズしたサンプルに、2ミリリットルのメタノールと1ミリリットルの0.1モルヒドロキシルアミンを加えます。混合物を室温で15分間放置します。レチノイド抽出の場合は、ホモジネートに10ミリリットルのヘキサンを加え、チューブを少なくとも10秒間水平にボルテックスします。
ホモジネートヘキサン混合物を1000 x gで3分間遠心分離し、相を分離します。ピペットを使用して、ヘキサン層を別の15ミリリットルのガラス管に移し、サンプルを真空遠心分離機に入れて、抽出されたサンプルからヘキサンを完全に蒸発させます。乾燥したレチノイドを15ミリリットルのチューブに100マイクロリットルのヘキサンとボルテックスウェルで再懸濁し、すべてのレチノイドが溶解していることを確認します。
100マイクロリットルのヘキサン全体を2番目のガラス管にピペットで入れ、チューブをボルテックスしてレチノイドを溶解します。次に、100マイクロリットルのヘキサン全体をHPLC分析用の単一のガラス不活性にピペットで移します。適切な条件を使用して HPLC ランをセットアップします。
標準試料に基づく各対象レチノイドの保持時間とUVスペクトルを使用してピークを同定します。クロマトグラフィーデータシステムを使用して、同定したピークを統合し、外部標準曲線を参照して分析種を定量します。生体組織クロマトグラムでは、保持時間のばらつきを考慮して、ピークを手動で波形解析します。
対照マウスの眼のクロマトグラムでは、13-シス-レチナール、11-シス-レチナール、オールトランスレチナール、11-シス-レチノール、およびオールトランスレチノールが同定されました。ヒドロキシルアミンで処理したマウスの眼のクロマトグラムでは、保持時間が増加しました。これらのレチナールデヒドのSynおよび抗異性体も存在しました。
マウスの肝臓組織のクロマトグラムでは、ビタミンAの主な形態としてパルミチン酸レチニルとオールトランスレチノールが同定され、マウスの血液中のレチノールはトランスレチノールのピークを示しました。UV 吸収スペクトルにより、クロマトグラムのピークにレチノイドアイソフォームが存在することが確認されました。
