Para começar, coloque os tecidos extraídos do camundongo no tubo do moedor de tecidos contendo 50% de solução salina gelada e 50% de metanol. Insira o pilão no tubo do moedor e gire-o suavemente cinco vezes para homogeneizar o tecido. Transferir imediatamente o tecido homogeneizado para um tubo de 15 mililitros.
Adicione dois mililitros de metanol e um mililitro de hidroxilamina 0,1 molar à amostra homogeneizada. Deixe a mistura descansar por 15 minutos em temperatura ambiente. Para extração de retinóides, adicione 10 mililitros de hexano ao homogeneizado e vortex o tubo horizontalmente por pelo menos 10 segundos.
Centrifugar a mistura homogeneizada de hexano durante três minutos a 1000 x g para separar as fases. Usando uma pipeta, transfira a camada de hexano para um tubo de vidro separado de 15 mililitros e coloque a amostra em uma centrífuga a vácuo para evaporar completamente o hexano da amostra extraída. Ressuspenda os retinóides secos no tubo de 15 mililitros com 100 microlitros de hexano e vórtice para garantir que todos os retinóides sejam dissolvidos.
Pipete todos os 100 microlitros de hexano no segundo tubo de vidro e vortex o tubo para dissolver os retinóides. Em seguida, pipete todos os 100 microlitros de hexano em um único vidro inerte para análise por HPLC. Configure a execução de HPLC usando as condições apropriadas.
Identifique picos usando tempos de retenção e espectros UV para cada retinóide de interesse com base em padrões. Utilizando o sistema de dados cromatográficos, integrar os picos identificados e referenciar a curva-padrão externa para quantificar a substância a analisar. Para cromatogramas de tecido biológico, integre manualmente os picos para levar em conta as variabilidades nos tempos de retenção.
No cromatograma do olho de camundongo controle, foram identificados 13-cis-retinal, 11-cis-retinal, all-trans-retinal, 11-cis-retinol e all-trans-retinol. No cromatograma do olho de camundongo tratado com hidroxilamina, os tempos de retenção foram aumentados. Syn e anti isômeros desses retinaldeídos também estavam presentes.
No cromatograma do tecido hepático de camundongos, o palmitato de retinila e o all-trans-retinol foram identificados como as principais formas de vitamina A, e no sangue de camundongo apresentaram pico de trans-retinol. Os espectros absorventes de UV confirmaram a presença de isoformas retinóides nos picos cromatográficos.
