نود أن نشكر الدكتور هشام Abdelbary لتوفير العينات الجراحية الإنسان عن البيانات الواردة في الشكل 2.

1. معالجة الأنسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على أفضل النتائج ، يجب أن يتم تنفيذ هذا البروتوكول باستخدام الأنسجة المعزولة المودعة حديثا في وسائل الإعلام التي تحتوي على 10 ٪ DMEM FBS ، 1 ٪ Pennicilin / الستبرتوميسين الحل ، والحل ب 0.1 ٪ Amphothericin مباشرة بعد عملية جراحية قبل تجهيزها. إذا لم يكن ذلك ممكنا ، يمكن ترك الأنسجة بين عشية وضحاها في هذه الوسيلة في 4 درجات قبل تجهيزها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل تجهيز العينة ، تعقيم الملقط المعدني القابل للتصرف من جانب وريش ايداعها في محلول الإيثانول 70 ٪ على الأقل 5 دقائق. أيضا بإعداد طبق بشكل جيد مع 24 2 مل من وسائل الإعلام التي تحتوي على 10 ٪ DMEM FBS ، 1 ٪ Pennicilin / الستبرتوميسين الحل ، و 0.1 ٪ B. Amphothericin </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع عينات الأنسجة في غطاء تدفق الصفحي ثقافة الخلية باستخدام ملقط معقم وإيداع الأموال والأنسجة في 15 سم فارغة طبق بتري ، والحفاظ على الغطاء على الجانب ، الجانب المعقمة تصل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الخلية هود والثقافة ، واستخدام 2 مم خزعة لكمة للحصول على عينات مختلفة من مختلف المناطق داخل النسيج كما في الشكل 1. إيداع النوى في غطاء بتري 15 سم بمساعدة ملقط ، وترك مساحة كافية بين كل الأساسية بحيث يمكن بسهولة قطعوا على طول المحور الأفقي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقسيم كل نواة في 4 / 4 حتى باستخدام شفرة حلاقة معقمة كما في الشكل 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تلميح باستخدام الماصة ، وطرح كل ربع الأساسية من مجموعة أساسية معينة في بئر مختلفة من A1 إلى A4 كما في الشكل 1 ، الذي يتضمن بالفعل 1.5 مل من DMEM تحتوي على 10 ٪ FBS ، 1 ٪ Pennicilin / الستبرتوميسين الحل ، والحل ب 0.1 ٪ Amphothericin . كرر لكل الأساسية. هذا يجب أن تسمح عينة ممثلة من الورم ، مع تقليل التحيز في بئر معين / الشرط. لأفضل تمثيل ، وزيادة عدد النوى. </li></ol> 2. تقييم الجدوى الأنسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معالجة الأنسجة التالية ، إضافة 25μl الامار الزرقاء إلى A1 و A2 # # جيدا كما هو موضح في الشكل (1) ويحضن لمدة 1 ساعة على 37 درجة في حاضنة ترطيب مع 5 ٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حضانة التالية مع الأزرق الامار ، إزالة 3 مرات 100 ميكرولتر من بئر A1 و A2 كل ونقل إلى 6 آبار مختلفة من لوحة 96 - جيدا. قراءة الإشارات باستخدام قارئ لوحة مضان (530 الإثارة ، 590 الانبعاث) والحفاظ على البيانات للسجلات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد قراءة الامار الزرقاء إشارة ، ونقل كل قطعة من النسيج باستخدام الماصة غيض من A1 إلى C1 كذلك يحتوي DMEM ، و 10 ٪ FBS + + PS AmphoB. يجب الحرص على عدم نقل كمية مفرطة من وسائل الاعلام من A1 جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصيب آبار A3 و A4 على التوالي مع PFU 6 10 من التعبير عن وGFP - luciferase ، معربا عن الوقس فيروس مخفف في 25 ميكرولتر من وسائل الإعلام. ويمكن أيضا أن يصاب بفيروس A2 أن يعبر عن أي التحوير بما في ذلك إعطاء شيء على الإطلاق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 72 ساعة في وقت لاحق ، إضافة 25 ميكرولتر الامار الزرقاء لC1 الآبار وD1 وكرر الخطوة 2.2 </li></ol> 3. التصور والتعبير التحوير GFP بواسطة المجهر تنوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة جميع وسائل الإعلام التي تغطي زراعة الخلايا القطع الأنسجة من أجل التقاط صور جيدة مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مجهر تشريح مضان قادرة ، تأخذ لأول مرة في صورة النقيض من المرحلة القرار المناسب </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل إلى وضع مضان والتقاط صورة باستخدام مرشح مناسب لتصور التحوير من الاهتمام في هذا GFP القضية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مرشح آخر لمضان الطول الموجي بقدر من احتمال ان من التحوير المصالح (مثل RFP) لالتقاط صورة للخلفية مضان </li></ol> 4. التصور والتعبير luciferase باستخدام نظام التصوير في فيفو (IVIS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن تتم تهيئة IVIS قبل أن تبدأ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الآبار وA4 B4 ، إضافة 5 ميكرولتر من الركيزة luciferin 10 ملغ / مل ، وتخلط جيدا واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط وقت التعرض IVIS إلى 5 ثوان ، والتقاط صورة من الآبار الخاصة بك. إذا المشبعة الصورة ، مع مرور الوقت أقل تكرار التعرض. إذا كان هناك أي إشارة ، وزيادة وقت التعرض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام برنامج التصوير IVIS ، يمكنك إزالة الخلفية باستخدام الإشارة من B4 جيدا وتحديد المنطقة التي تهم تحديد إشارة التلألؤ. </li></ol> 5. تقييم التتر الفيروسية التي مقايسة البلاك <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل التتر الكمي الفيروسي ، يجب أولا أن الأنسجة المتجانس للافراج عن الجسيمات الفيروسية. يمكن القيام بذلك بعد عدة أشهر في عينات الأنسجة المصابة يتم تخزينها في -80 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وزن العينة التي يجب أن يكون متجانس باستخدام مقياس تحليلي. في هذه الحالة ، سوف نستخدم عينة تم جمعها من A2 جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان النسيج هو في البوليسترين 5 مل أنبوب الصقر ذهابا والقاع ، وإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني. تجانس النسيج باستخدام الخالط الأنسجة. إذا لزم الأمر ، في تخزين جناسة -80 لتقييم التتر الفيروسية في وقت لاحق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفيروس الوقس عيار ، لوحة الأولى 1 مليون خلية U2OS في صفيحة 6 - جيدا واحتضان بين عشية وضحاها في درجة 37 ، 5 ٪ CO 2 الرطبةified الحاضنة بحيث وصلت إلى حوالي 95 ٪ confluency في اليوم التالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام وسائل الإعلام الحرة المصل للقيام التخفيفات المتسلسلة لفيروس ، والتأكد من نصائح لتغيير بين كل خطوة التخفيف. عادة ما نقوم به في 10 1 التخفيفات واستخدام 100 ميكرولتر تحويله إلى 900 ميكرولتر. كم من التخفيفات مصنوعة يعتمد على العائد المتوقع الفيروس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التالية جعل التخفيفات ، وإزالة وسائل الاعلام التي تغطي الخلايا U20S مطلي ثم إضافة 500 ميكرولتر من مخزون الفيروس المخفف (لكل تمييع) لتصيب الخلايا U2OS. احتضان الخلايا لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية في حاضنة 5 ٪ CO 2 مرطب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال هذا الوقت ، الاحماء X 2 تتركز DMEM تحتوي على 20 ٪ FBS ، والحل 3 ٪ CMC في حمام المياه 37 درجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حضانة 1 ساعة ، وإزالة وسائل الاعلام التي تغطي الخلايا المصابة U2OS. مزيج من وحدات التخزين 01:01 CMC 3 ٪ : 2X DMEM ، و 20 ٪ FBS معا واستخدام 2 مل من هذا الخليط لتغطية كل بئر من الخلايا المصابة U2OS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الخلايا مرة أخرى في 37 درجة 5 ٪ CO 2 حاضنة مرطب لمدة 48 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 48 ساعة ، إضافة 2 مل من الميثانول حامض الخليك مثبت على الجزء العلوي من تراكب CMC في كل بئر ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة في خلية غطاء الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل تراكب الثابتة وتغسل ما تبقى الخروج من الآبار باستخدام مياه الحنفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار الثابتة U2OS الخلايا مع 2ml حل الزرقاء coomassie لكل بئر واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بسرعة منخفضة على لوحة شاكر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة البقع coomassie من الآبار ، وتغسل الصحون استخدام مياه الحنفية. السماح ليجف مع قبالة غطاء لمدة ساعة تقريبا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن لويحات الفيروسية الناجمة يمكن تصور بسهولة في 2C الرقم. ويمكن تخزين لوحات لأجل غير مسمى في هذه المرحلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عدد اللوحات في الخطوة التخفيف حيث تتراوح بين 10 و 100 لوحات مرئية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضرب عدد من اللوحات التي عدها التخفيف المستخدمة وضرب الرقم الناتج بنسبة 2 إلى إعطاء عيار في PFU / مل. على سبيل المثال ، إذا تم احتساب 25 ويحات في البئر حيث تم استخدام تخفيف مليون أمثالها ، من عيار العينة مخفف الأولي هو 25 مضروبة 1000000 مضروبا 2 أو 50000000 PFU / مل. مزيد من تقسيم هذا العدد من الوزن في البداية لقياس العينة لتقرير التتر في PFU / ز </li></ol> 6. ممثل النتائج : بغية تحديد بدقة ما إذا كان الحصول على عينة جراحيا الأنسجة الطبيعية / ورم أو غير infectable مع الفيروس ، ويجب على المرء أولا التأكد من أن عينات الأنسجة على الأقل قابلة للحياة. ويبين الشكل 1A يمكن تقييم الجدوى التي تستخدم صبغة الأيضية (الامار الأزرق) وذلك على حد سواء طبيعية والأنسجة السرطانية يمكن أن تبقى نشطة عملية الأيض خلال فترة لا تقل عن 72H. هذا يشير إلى أن أنسجة الجسم الحي السابقين مثقف يمكن أن تدعم تكاثر الفيروس. وهناك ميزة كبيرة من الفيروسات oncolytic هو أنه يمكن هندستها لهم التعبير عن الجينات المحورة العلاجية أو التصوير. التين 2D - E يظهر أنه يمكن الكشف عن GFP Luciferase أو الأنسجة المصابة من خارج الحي ، ودعم كذلك أن هذه الأنسجة هي قابلة للحياة وinfectable أيضا. على الرغم من أن يترافق عادة مع زيادة التعبير التحوير تكاثر الفيروس ، فإنه لا يعني بالضرورة أن دورة حياة المنتج الفيروسية التي تؤدي إلى تضخيم الذات وانتشرت ، والتي يعتقد أنها مهمة للنشاط العلاجية. لهذا السبب ، من الضروري تحديد ما إذا كان الفيروس أنتجت أكثر مما كان يستخدم في البداية لإصابة الأنسجة. التين 2B يبين أنه عند الكمي الفيروسي بواسطة فحص اللوحة ، هو الحصول على مزيد من عدوى الفيروس بعد 72 ساعة ثم الأنسجة التي تم جمعها بعد العدوى مباشرة. عموما ، هذه البيانات تظهر أن تستأصل جراحيا نسيج الورم يمكن أن تبقى قابلة للحياة في الثقافة خلية لمدة 72 ساعة على الأقل ، وخلالها يمكن أن تدعم النسخ المتماثل الوقت الفيروسية. <img src="/files/ftp_upload/2854/2854fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1. نظرة عامة على أخذ عينات من أنسجة / sectioning البروتوكول. تتم معالجتها عن طريق إزالة عينة الأنسجة العديد من العينات مم 2 وهي مقسمة إلى أربعة أرباع لاحقا والتي يتم توزيعها عشوائيا في آبار A1 - A4. رموز تدل على لون الكواشف المستخدمة في كل بئر. مربعات رمادية مظللة داخل الآبار تمثل كل ربع من النوى الفردية يصور 6. يتم نقل الأنسجة في A1 جيدا لحفر بئر جديدة (C1) مع وسائل الاعلام بعد القراءة الأولية الزرقاء الامار. تتم قراءة ثانية في نهاية الحضانة 72 ساعة مع الفيروسات. وتستكمل الآبار A4 و B4 مع Luciferin بعد حضانة 72 ساعة بعد الإصابة <img src="/files/ftp_upload/2854/2854fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2. سلامة وinfectability عينات الأنسجة المريضة. أ) صلاحية الأنسجة كما تقاس إشارة زرقاء الامار في 2 ساعة و 72 ساعة لجمع آخر. العمودي يمثل فارغة تصحيح الامار الزرقاء إشارة باء) العيار الحجمي للفيروس الوقسجمعها في كل غرام من عينات الأنسجة 2 و 72 ساعة بعد الاصابة. C) مثال لويحات الفيروس على الخلايا الوقس U2OS التالية تلطيخ coomassie. D) إشارة التلألؤ تم الحصول عليها من الأنسجة VV - luciferase المرضى المصابين به تصوير IVIS. E) الصور المجهري الإسفار عينة الأنسجة المريضة مصابة VV - GFP.

<ol>
	<li>Parato, K. A., Senger, D., Forsyth, P. A., Bell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+the+battle+between+oncolytic+viruses+and+cancer.">Recent progress in the battle between oncolytic viruses and cancer.</a> Nat Rev Cancer. 5, 965-976 (2005).</li><li>Renouf, L. C., Thway, K., Sibtain, A., McNeish, I. A., Newbold, K. L., Goldsweig, H., Coffin, R., Nutting, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I/II+study+of+oncolytic+HSV+GM-CSF+in+combination+with+radiotherapy+and+cisplatin+in+untreated+stage+III/IV+squamous+cell+cancer+of+the+head+and+neck.">Phase I/II study of oncolytic HSV GM-CSF in combination with radiotherapy and cisplatin in untreated stage III/IV squamous cell cancer of the head and neck.</a> Clin Cancer Res. 16, 4005-4015 (2010).</li><li>Lal, R., Harris, D., Postel-Vinay, S., de Bono, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reovirus:+Rationale+and+clinical+trial+update.">Reovirus: Rationale and clinical trial update.</a> Curr Opin Mol Ther. 11, 532-539 (2009).</li><li>Park, B. H., Hwang, T., Liu, T. C., Sze, D. Y., Kim, J. S., Kwon, H. C., Oh, S. Y., Han, S. Y., Yoon, J. H., Hong, S. H., Moon, A., Speth, K., Park, C., Ahn, Y. J., Daneshmand, M., Rhee, B. G., Pinedo, H. M., Bell, J. C., Kirn, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+targeted+oncolytic+poxvirus,+JX-594,+in+patients+with+refractory+primary+or+metastatic+liver+cancer:+a+phase+I+trial.">Use of a targeted oncolytic poxvirus, JX-594, in patients with refractory primary or metastatic liver cancer: a phase I trial.</a> Lancet Oncol. 9, 533-542 (2008).</li><li>Breitbach, C. J., Reid, T., Burke, J., Bell, J. C., Kirn, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Navigating+the+clinical+development+landscape+for+oncolytic+viruses+and+other+cancer+therapeutics:+no+shortcuts+on+the+road+to+approval.+Cytokine+Growth+Factor+Rev.">Navigating the clinical development landscape for oncolytic viruses and other cancer therapeutics: no shortcuts on the road to approval. Cytokine Growth Factor Rev.</a> 21, 85-89 (2010).</li><li>Boeuf, F. L. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interaction+between+oncolytic+viruses+augments+tumor+killing.">Synergistic interaction between oncolytic viruses augments tumor killing.</a> Mol Ther. 18, 888-895 (2010).</li><li>Silva, N. D. e., Atkins, H., Kirn, D. H., Bell, J. C., Breitbach, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+trouble+for+tumours:+exploiting+the+tumour+microenvironment+to+enhance+anticancer+effect+of+oncolytic+viruses.">Double trouble for tumours: exploiting the tumour microenvironment to enhance anticancer effect of oncolytic viruses.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 21, 135-141 (2010).</li><li>Diallo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+pharmacoviral+approach+identifies+novel+oncolytic+virus+sensitizers.">A high-throughput pharmacoviral approach identifies novel oncolytic virus sensitizers.</a> Mol Ther. 18, 1123-1129 (2010).</li><li>Cooke, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-tumour+genetic+heterogeneity+and+poor+chemoradiotherapy+response+in+cervical+cancer.">Intra-tumour genetic heterogeneity and poor chemoradiotherapy response in cervical cancer.</a> Br J Cancer. , (2010).</li><li>Pennington, K., Chu, Q. D., Curiel, D. T., Li, B. D. L., Mathis, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Utility+of+a+Tissue+Slice+Model+System+to+Determine+Breast+Cancer+Infectivity+by+Oncolytic+Adenoviruses.">The Utility of a Tissue Slice Model System to Determine Breast Cancer Infectivity by Oncolytic Adenoviruses.</a> J Surg Res. , 1-6 (2010).</li><li>Hochberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropism+of+herpes+simplex+virus+type+1+to+non-melanoma+skin+cancers.">Tropism of herpes simplex virus type 1 to non-melanoma skin cancers.</a> Br J Dermatol. , (2010).</li><li>Kuip, H. v. a. n. d. e. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+term+culture+of+breast+cancer+tissues+to+study+the+activity+of+the+anticancer+drug+taxol+in+an+intact+tumor+environment.">Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment.</a> BMC Cancer. 6, 86-86 (2006).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

واحدة من الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول هو الحصول على عينة الأنسجة الطازجة. وإذا وضعت العينة في الثقافة الخلية بعد انتظار طويل في غرفة العمليات في وسائل الاعلام غير ملائمة (مثل PBS) ، وهذا قد حل وسط بقاء الأنسجة ومنع infectability. من المذكرة ، الأنسجة الطبيعية هي بطبيعتها أكثر عرضة لهذه الآثار من الأنسجة السرطانية. نقطة أخرى الحاسم هو كيفية العديد من النوى المستخدمة لأخذ عينات من الأنسجة وتناسق حجمها. والتناقضات في الحجم تؤدي إلى تقلب عبر عينات من المرضى منذ عوامل مثل نقص الأكسجين والأنسجة السطحية infectectable سوف تتقلب تبعا لحجم النوى وأرباع الأساسية. في حين أن هذا يمكن أن تحل جزئيا باستخدام ماكينات تقطيع الأنسجة ، وميزة واحدة من الأسلوب المقدمة هنا هو أنه من السهل نسبيا ، وأقل عرضة للتلوث ، وقابلة للتطبيق على نطاق واسع لمجموعة متنوعة من أنواع الأنسجة ، بما في ذلك الأنسجة اللينة أو اللزجة التي لا تتقبل بسهولة لتشريح الأنسجة. خصوصا ، ويمكن زيادة عدد النوى من أجل الحصول على تمثيل أفضل الأنسجة. أيضا ، يمكن خفض النوى في أكثر من قطعة (على سبيل المثال 5-8) لاستيعاب المقايسات المحتملين الآخرين إلى أن يتم بالتوازي مثل الحمض النووي ، والجيش الملكي النيبالي ، أو استخراج البروتين. ومع ذلك ، فإن عدد القطع التي يمكن من خلالها خفض أحجام العينات لاستنساخه تعتمد على الحجم الفعلي للالنوى ، والتي يمكن تعديلها باستخدام المثاقيب مختلفة الحجم. اختياريا ، طريقة واحدة للمساعدة في الحصول على قطعة نسيج الحجم بتكاثر هو حتى من طول النوى باستخدام مسطرة قبل اقتطاع مزيد منهم الى أجزاء اصغر. بطبيعة الحال يمكن للبروتوكول يمكن تعديلها لاستيعاب الفيروسات الأخرى وقد وجدنا أن الأنسجة يمكن أن تكون قابلة للبقاء ودعم النسخ المتماثل لمدة تصل إلى 6 أيام. كذلك يمكن للبروتوكول أن تمتد إلى قياسات الجينات المحورة فيروسي ، وأعرب الأخرى بما في ذلك cytrokines. بعد الإصابة ، ويمكن أيضا أن تكون جزءا لا يتجزأ من الأنسجة في البارافين لمزيد من sectioning وتلطيخ بالطرق المناعى ، مما يسمح للمزيد من الصقل من الأنسجة الأنسجة ومدى ارتباطه عدوى فيروسية 10-12.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات (اختياري) </th></tr><tr><td> ارتفاع الجلوكوز DMEM </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.01 </td><td></td></tr><tr><td> المصل البقري الجنين </td><td> شركة NorthBio </td><td> NBSF - 701 </td><td></td></tr><tr><td> Amphothericin B الحل </td><td> سيغما الدريتش </td><td> A2942 </td><td> استخدام عند 0.1 ٪ </td></tr><tr><td> Pennicilin - الستربتوميسين </td><td> سيغما الدريتش </td><td> P4333 </td><td> استخدام وبنسبة 1 ٪ </td></tr><tr><td> الامار الأزرق </td><td> Invitrogen </td><td> DAL1025 </td><td></td></tr><tr><td> D - Luciferin البوتاسيوم الملح </td><td> منتجات التصوير الجزيئي </td><td> D - Luciferin البوتاسيوم ملح 1G </td><td> Resuspend في برنامج تلفزيوني في 10 مل / ملغ و تصفية على 0.22 ميكرون فلتر </td></tr><tr><td> MEM مسحوق </td><td> Gibco </td><td> # 41500018 </td><td> جعل النصف في الحجم المقترح لجعل MEM 2X وتصفية على 0.22 ميكرون التصفية قبل استخدامها </td></tr><tr><td> Carboxymethyl السليلوز (CMC) </td><td> سيغما الدريتش </td><td> C9481 </td><td> جعل الحل 3 ٪ في الماء منزوع الأيونات والأوتوكلاف. علما بأن مسحوق يمكن أن يستغرق بعض الوقت لresuspend </td></tr><tr><td> Coomassie بريليانت الأزرق R </td><td> سيغما الدريتش </td><td> B7920 </td><td></td></tr><tr><td> 2 مم خزعة لكمة </td><td> Miltex </td><td> MX - 33-31 </td><td></td></tr><tr><td> نصول مستقيمة مزدوجة الإعدادية </td><td> Personna العناية الطبية </td><td> 74-0002 </td><td></td></tr><tr><td> مضان disection مجهر </td><td> لايكا </td><td> طراز M205 FA </td><td></td></tr><tr><td> نظام التصوير في فيفو (IVIS) </td><td> الفرجار العلوم الحياتية </td><td> IVIS ® المجموعة 200 </td><td></td></tr><tr><td> نسيج Tearor </td><td> منتجات Biospec </td><td> نموذج 985370-395 </td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo infection of live tissue with oncolytic viruses

Oncolytic الفيروسات (OVS) هي العلاجات التي تحاكي الرواية بشكل انتقائي في وتقتل الخلايا السرطانية 1. العديد من التجارب السريرية بتقييم فعالية مجموعة متنوعة من المنصات بما فيها oncolytic HSV ، الفيروسة الريوية وOVS الوقس لعلاج السرطان في الوقت الراهن 2-5 جارية. واحدة سمة رئيسية من الفيروسات oncolytic هو أن تكون معدلة وراثيا في التعبير عن الجينات المحورة المراسل الذي يجعل من الممكن تصور إصابة الأنسجة البيولوجية المجهري أو التلألؤ التصوير 6،7. هذه ميزة فريدة من نوعها نظرا لأنه من الممكن أن تصيب أنسجة الجسم الحي السابقين من المرضى قبل العلاج وذلك للتأكد من احتمال نجاح virotherapy oncolytic 8. ولهذه الغاية ، فمن الأهمية بمكان مناسب لعينة الأنسجة للتعويض عن عدم تجانس الأنسجة وتقييم الجدوى الأنسجة ، وبصفة خاصة للإصابة قبل 9. من المهم أيضا أن تتبع تكاثر الفيروس باستخدام الجينات المحورة إذا مراسل التي أعرب عنها منصة oncolytic فضلا عن المعايرة المباشرة للأنسجة التالية من أجل التجانس تميز بين العدوى فاشلة ومنتجة. الهدف من هذا البروتوكول هو لمعالجة هذه القضايا ، ويصف هذه الوثيقة 1. أخذ العينات وإعداد الأنسجة السرطانية للثقافة الخلية 2. تقييم جدوى استخدام أنسجة الأيضية صبغة زرقاء الامار 3. المجراة سابقا عدوى الأنسجة مثقف مع فيروس الوقس يعبر عن GFP أو يراعة luciferase 4. الكشف عن التعبير عن طريق التحوير أو مضان المجهري باستخدام نظام تصوير في الجسم الحي (IVIS) 5. الكمي من الفيروس عن طريق فحص اللوحة. هذا الأسلوب شامل يقدم العديد من المزايا بما في ذلك سهولة تصنيع الأنسجة ، والتعويض عن عدم تجانس النسيج ، والسيطرة على بقاء الأنسجة ، والتمييز بين العدوى فاشلة والعظام تكاثر الفيروس النية.

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses at JoVE.com

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic الفيروسات واعدة لمداواة السرطان. القدرة على التأكد من عينات الأنسجة infectability يعيش الحصول عليها من المرضى قبل العلاج هو ميزة فريدة من نوعها لهذا النهج العلاجي. هذا البروتوكول توضح كيفية معالجة الأنسجة ل<em&gt; خارج الحي</em&gt; العدوى بفيروس oncolytic النوعي والكمي الفيروسي لاحقة.

فيفو السابقين العدوى من الأنسجة الحية مع الفيروسات Oncolytic

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

ex-vivo-infection-of-live-tissue-with-oncolytic-viruses

Google

Research

JoVE Journal

Medicine

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

12.5K Views.  Ottawa Hospital Research Institute (OHRI). Oncolytic الفيروسات واعدة لمداواة السرطان. القدرة على التأكد من عينات الأنسجة infectability يعيش الحصول عليها من المرضى قبل العلاج هو ميزة فريدة من نوعها لهذا النهج العلاجي. هذا البروتوكول توضح كيفية معالجة الأنسجة ل خارج الحي العدوى بفيروس oncolytic النوعي والكمي ال?...

Video: Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery. Fresh patient tissue obtained at the time of surgery is sliced and maintained in culture. The ex vivo model system allows for the physical delivery of genes into intact patient tissue and gene expression is analysed by bioluminescence imaging using the IVIS detection system. The bioluminescent detection system demonstrates rapid and accurate quantification of gene expression within individual slices without the need for tissue sacrifice. This slice tissue culture system may be used in a variety of tissue types including normal and malignant tissue and allows us to study the effects of the heterogeneous nature of intact tissue and the high degree of variability between individual patients. This model system could be used in certain situations as an alternative to animal models and as a complementary preclinical mode prior to entering clinical trial.

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

This article describes the culture of patient tissue slices for gene delivery studies and subsequent analysis of gene expression using IVIS bioluminescence imaging.

فيفو السابقين الثقافة من الأنسجة للمريض وفحص الجينات التسليم

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact. For this strategy to be successful, recent studies have shown that involvement of the host immune system is essential. Therefore, oncolytic virotherapy should be evaluated within the context of an immunocompetent model. Furthermore, the study of antitumor therapies in tolerized animal models may better recapitulate results seen in clinical trials. Cotton rats, commonly used to study respiratory viruses, are an attractive model to study oncolytic virotherapy as syngeneic models of mammary carcinoma and osteosarcoma are well established. However, there is a lack of published information on the proper handling procedure for these highly excitable rodents. The handling and capture approach outlined minimizes animal stress to facilitate experimentation. This technique hinges upon the ability of the researcher to keep calm during handling and perform procedures in a timely fashion. Finally, we describe how to prepare cotton rat mammary tumor cells for consistent subcutaneous tumor formation, and how to perform intratumoral and intraperitoneal injections. These methods can be applied to a wide range of studies furthering the development of the cotton rat as a relevant pre-clinical model to study antitumor therapy.

Cotton rats are extremely excitable and have a strong flight-or-fight response. A handling method optimized to reduce the stress of the animals is described which will make cotton rats more accessible as a preclinical model.

التعامل مع الفأر القطن في الدراسات لتقييم ما قبل السريرية من حال الورم الفيروسات

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact.  For this strategy to be ...

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular and molecular processes that govern metastatic dissemination and growth are still elusive. Live imaging allows visualization of the dynamic and spatial interactions of cells and their microenvironment. Solid tumors commonly metastasize to the lungs. However, the anatomical location of the lungs poses a challenge to intravital imaging. This protocol provides a relatively simple and quick method for ex vivo live imaging of the dynamic interactions between tumor cells and their surrounding stroma within lung metastasis. Using this method, the motility of cancer cells as well as interactions between cancer cells and stromal cells in their microenvironment can be visualized in real time for several hours. By using transgenic fluorescent reporter mice, a fluorescent cell line, injectable fluorescently labeled molecules and/or antibodies, multiple components of the lung microenvironment can be visualized, such as blood vessels and immune cells. To image the different cell types, a spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid, four-color image acquisition has been used. Time-lapse movies compiled from images collected over multiple positions and focal planes show interactions between live metastatic and immune cells for at least 4 hr. This technique can be further used to test chemotherapy or targeted therapy. Moreover, this method could be adapted for the study of other lung-related pathologies that may affect the lung microenvironment.

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

We describe a relatively simple method for ex vivo live imaging of the tumor cell-stroma interactions within lung metastasis, utilizing fluorescent reporters in mice. Using spinning-disk confocal microscopy, this technique enables visualization of live cells for at least 4 hr and could be adapted to study other inflammatory lung conditions.

فيفو تصوير لايف الرئة ورم خبيث والمكروية بهم

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...

Transarterial Administration of Oncolytic Viruses for Locoregional Therapy of Orthotopic HCC in Rats

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a disease with limited treatment options and poor prognosis. In recent years, oncolytic virotherapies have proven themselves to be potentially powerful tools to fight malignancy. Due to the unique dual blood supply in the liver, it is possible to apply therapies locally to orthotopic liver tumors, which are predominantly fed by arterial blood flow. We have previously demonstrated that hepatic arterial delivery of oncolytic viruses results in safe and efficient transduction efficiency of multifocal HCC lesions, resulting in significant prolongation of survival in immune competent rats. This procedure closely mimics the application of transarterial embolization in patients, which is the standard palliative care provided to many HCC patients. The ability to administer tumor therapies through the hepatic artery in rats allows for a highly sophisticated preclinical model for evaluating novel viral vectors under development. Here we describe the detailed protocol for microdissection of the hepatic artery for infusion of oncolytic virus vectors to treat orthotopic HCC.

Oncolytic virotherapies are under development as novel therapeutics for the treatment of hepatocellular carcinoma (HCC). Here we describe a method for locoregional therapy of HCC via hepatic arterial administration of oncolytic virus.

إدارة Transarterial من حال الورم فيروسات للعلاج العلاج الموضعي من مثلي HCC في الجرذان

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a disease with limited treatment options and poor prognosis.  In recent years, oncolytic virotherapies have proven ...

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to establish human enteroid ex vivo culture systems are important to model intestinal pathophysiology and to study the particular cellular responses involved. In recent years, enteroids from mice and humans are being cultured, passaged, and banked away for future use in several laboratories across the world. This enteroid platform can be used to test the effects of various treatments and drugs and what effects are exerted on different cell types in the intestine. Here, a protocol for establishing primary stem cell-derived small intestinal enteroids derived from neonatal mice and premature human intestine is provided. Moreover, this enteroid culture system was utilized to test the effects of species-specific breast milk. Mouse breast milk can be obtained efficiently using a modified human breast pump and expressed mouse milk can then be used for further research experiments. We now demonstrate the effects of expressed mouse, human, and donor breast milk on the growth and proliferation of enteroids derived from neonatal mice or premature human small intestine.

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

This protocol describes how to establish an enteroid culture system from neonatal mouse or premature human intestine as well as an efficient method to collect milk from mice.

حليب الثدي يعزز نمو انتيرويدس: نموذج فيفو السابقين من تكاثر الخلايا

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to ...

Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

The assessment of modern sub-unit vaccines reveals that the generation of neutralizing antibodies is important but not sufficient for adjuvant selection. Therefore, adjuvants with both humoral and cellular immuno-stimulatory capabilities that are able to promote cytotoxic T lymphocytes (CTL) responses are urgently needed. Thus, faithful monitoring of adjuvant candidates that induce cross-priming and subsequently enhance CTL generation represents a crucial step in vaccine development. In here we present an application for a method that uses SIINFEKL-specific (OT-I) T cells to monitor the cross-presentation of the model antigen ovalbumin (OVA) in vivo in the presence of different adjuvant candidates. This method represents a rapid test to select adjuvants with the best cross-priming capabilities. The proliferation of CD8+ T cells is the most valuable indication of cross-priming and it is also regarded as a correlate of adjuvant-induced cross-presentation. This feature can be evaluated in different immune organs like lymph nodes and spleen. The extent of the CTL generation can also be monitored, thereby giving insights on the nature of a local (draining lymph node mainly) or a systemic response (distant lymph nodes and/or spleen). This technique further allows multiple modifications for testing drugs that can inhibit specific cross-presentation pathways and also offers the possibility to be used in different strains of conventional and genetically modified mice. In summary, the application that we present here will be useful for vaccine laboratories in industry or academia that develop or modify chemical adjuvants for vaccine research and development.

Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant&#039;s Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

We present here an application for a standard immunological technique (CFSE stained OT-I proliferation) intended to rapidly monitor adjuvant-mediated cytotoxic T lymphocyte (CTL) generation in vivo. This fast estimation of CTL capacities is useful for the development of prophylactic vaccines against intracellular pathogens as well as therapeutic cancer vaccines.

السريع في فيفو تقييم لقدرات توليد الخلايا اللمفية T السامة للخلايا Adjuvant في لتطوير اللقاحات

The assessment of modern sub-unit vaccines reveals that the generation of neutralizing antibodies is important but not sufficient for adjuvant selection. ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been introduced as a method to evaluate and modify organ function. NEVLP has many advantages in comparison to hypothermic and subnormothermic perfusion including reduced preservation injury, restoration of normal organ function under physiologic conditions, assessment of organ performance, and as a platform for organ repair, remodeling, and modification. Both murine and porcine NEVLP models have been described. We demonstrate a rat model of NEVLP and use this model to show one of its important applications &#8212; the use of a therapeutic molecule added to liver perfusate. Catalase is an endogenous reactive oxygen species (ROS) scavenger and has been demonstrated to decrease ischemia-reperfusion in the eye, brain, and lung. Pegylation has been shown to target catalase to the endothelium. Here, we added pegylated-catalase (PEG-CAT) to the base perfusate and demonstrated its ability to mitigate liver preservation injury. An advantage of our rodent NEVLP model is that it is inexpensive in comparison to larger animal models. A limitation of this study is that it does not currently include post-perfusion liver transplantation. Therefore, prediction of the function of the organ post-transplantation cannot be made with certainty. However, the rat liver transplant model is well established and certainly could be used in conjunction with this model. In conclusion, we have demonstrated an inexpensive, simple, easily replicable NEVLP model using rats. Applications of this model can include testing novel perfusates and perfusate additives, testing software designed for organ evaluation, and experiments designed to repair organs.

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant liver donor shortage, and criteria for liver donors have been expanded. Normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been developed to evaluate and modify organ function. This study demonstrates a rat model of NEVLP and tests the ability of pegylated-catalase, to mitigate liver preservation injury.

نموذج حيوانات صغيرة من نضح الكبد نورموثيرميك السابقين فيفو

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No current animal models of diabetes and oxygen-induced retinopathy develop the full-range progressive changes manifested in human proliferative diabetic retinopathy (PDR). Therefore, understanding of the disease pathogenesis and pathophysiology has relied largely on the use of histological sections and vitreous samples in approaches that only provide steady-state information on the involved pathogenic factors. Increasing evidence indicates that dynamic cell-cell and cell-extracellular matrix (ECM) interactions in the context of three-dimensional (3D) microenvironments are essential for the mechanistic and functional studies towards the development of new treatment strategies. Therefore, we hypothesized that the pathological fibrovascular tissue surgically excised from eyes with PDR could be utilized to reliably unravel the cellular and molecular mechanisms of this devastating disease and to test the potential for novel clinical interventions. Towards this end, we developed a novel method for 3D ex vivo culture of surgically-excised patient-derived fibrovascular tissue (FT), which will serve as a relevant model of human PDR pathophysiology. The FTs are dissected into explants and embedded in fibrin matrix for ex vivo culture and 3D characterization. Whole-mount immunofluorescence of the native FTs and end-point cultures allows thorough investigation of tissue composition and multicellular processes, highlighting the importance of 3D tissue-level characterization for uncovering relevant features of PDR pathophysiology. This model will allow the simultaneous assessment of molecular mechanisms, cellular/tissue processes and treatment responses in the complex context of dynamic biochemical and physical interactions within the PDR tissue architecture and microenvironment. Since this model recapitulates PDR pathophysiology, it will also be amenable for testing or developing new treatments.

Here, we present a protocol to study the pathophysiology of proliferative diabetic retinopathy by using patient-derived, surgically-excised, fibrovascular tissues for three-dimensional native tissue characterization and ex vivo culture. This ex vivo culture model is also amenable for testing or developing new treatments.

نموذج زراعة الأنسجة فيفو السابقين لمضاعفات فيبروفاسكولار في اعتلال الشبكية السكري التكاثري

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They mature in the bone marrow and are released into the peripheral blood, where they circulate for about 6&#8722;8 h; however, in tissue, they can survive for days. By diapedesis through the endothelium, they leave the blood stream, enter tissues, and migrate towards the site of an infection following chemotactic gradients.&#160;Neutrophils can combat invading microorganisms by phagocytosis,&#160;degranulation, and generation of neutrophil extracellular traps (NETs). This protocol will help to detect NETs in paraffin-embedded tissue. NETs are the result of a process called NETosis, which leads to the release of nuclear, granular, and cytoplasmic components either from living (vital NETosis) or dying (suicidal NETosis) neutrophils. In vitro, NETs form cloud-like structures, which occupy a space several times larger than that of the cells from which they descended. The backbone of NETs is chromatin, to which a selection of proteins and peptides originating from granules and cytoplasm are bound. Thereby, a high local concentration of toxic compounds is maintained so that NETs can capture and inactivate a variety of pathogens including bacteria, fungi, viruses, and parasites, while diffusion of the highly active NET components leading to damage in neighboring tissue is limited. Nevertheless, in recent years it has become apparent that NETs, if generated in abundance or cleared insufficiently, do have pathological potential ranging from autoimmune diseases to cancer. Thus, detection of NETs in tissue samples may have diagnostic significance, and the detection of NETs in diseased tissue can influence the treatment of patients. Since paraffin-embedded tissue samples are the standard specimen used for pathological analysis, it was sought to establish a protocol for fluorescent staining of NET components in paraffin-embedded tissue using commercially available antibodies.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are three-dimensional structures generated by stimulated neutrophil granulocytes. It has become clear in recent years that NETs are involved in a wide variety of diseases. Detection of NETs in tissue may have diagnostic relevance, so standardized protocols for labelling NET components are required.

وضع العلامات المناعية للفخاخ خارج الخلية البشرية ومورين العدلات في الأنسجة البارافين جزءا لا يتجزأ

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to larger animals. Yet, larger mammals are better suited for translational research questions related to normal cardiac physiology, pathophysiology, and preclinical testing of therapeutic agents. To overcome the technical barriers associated with employing a larger animal model in cardiac research, we describe an approach to measure physiological parameters in an isolated, Langendorff-perfused piglet heart. This approach combines two powerful experimental tools to evaluate the state of the heart: electrophysiology (EP) study and simultaneous optical mapping of transmembrane voltage and intracellular calcium using parameter sensitive dyes (RH237, Rhod2-AM). The described methodologies are well suited for translational studies investigating the cardiac conduction system, alterations in action potential morphology, calcium handling, excitation-contraction coupling and the incidence of cardiac alternans or arrhythmias.

The objective of this study was to establish a method for investigating cardiac dynamics using a translational animal model. The described experimental approach incorporates dual-emission optocardiography in conjunction with an electrophysiological study to assess electrical activity in an isolated, intact porcine heart model.

دراسات الفيزيولوجيا الكهربية والدراسات الكهربائية السابقة لل فيفو لانغرندوف

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...