이 작품은 부분적으로 JM - M에 NIH 부여 K99EB009096 - 01A1에 의해 지원되었다.

1. 준비 <ol><li> EGM - 2 미디어 (500 ML)를 확인 <ul><li> 내피 기초 매체의 395 ML (EBM - 2) 태아 소 혈청 100 ML (FBS)을 추가합니다. </li><li> 100x 글루타민 - 페니실린 - 스트렙토 마이신 솔루션 (GPS)의 5 ML을 추가합니다. </li><li> 하이드로코티손 (즉, VEGF, hFGF - B, R - IGF - 1, hEGF, 헤파린, 아스코르비 산, 그리고 GA - 1000)를 제외한 모든 EGM - 2 SingleQuots 보조를 추가합니다. </li><li> 0.2 - μm의 기공 크기 진공 필터 살균 필터. </li></ul></li><li> MSCGM 매체 (500 ML)를 확인 <ul><li> Mesenchymal 줄기 세포 기저 매체 (MSCBM)의 440 ML에 100x GPS의 5 ML을 추가합니다. </li><li> MSCGM SingleQuots 키트의 모든 내용을 추가합니다. </li><li> EGM - 2 SingleQuots 보조에서 hFGF - B의 나누어지는를 추가합니다. </li><li> 0.2 - μm의 기공 크기 진공 필터 살균 필터. </li></ul></li><li> DMEM 매체 (500 ML)를 확인 <ul><li> 1X 높은 포도당 Dulbecco의 수정 이글 중간 (DMEM)의 440 ML에 태아 소 혈청 50 ML (FBS)을 추가합니다. </li><li> 100x의 GPS의 5 ML을 추가합니다. </li><li> 불필요한 아미노산 솔루션의 5 ML을 추가합니다. </li><li> 0.2 - μm의 기공 크기 진공 필터 살균 필터. </li></ul></li><li> 콜라겐 / fibronectin 솔루션 (; 사출로 만든 당일 3.6 ML)를 확인 <ul><li> 소주 H 2 O. 150 μL에 10X DMEM의 0.4 ML 추가 </li><li> 1M HEPES 100 μL (최종 25 MM)를 추가합니다. </li><li> 신중하게, 보빈 콜라겐의 2.4 ML (5 MG / ML 주식, 3 MG / ML 최종)을 추가하고 얼음에 부드럽게 섞는다. </li><li> (약 30 μL) 1N NaOH 용액을 추가하여 중립으로 산도를 조정합니다. </li><li> 중성 산도를 평가하기 위해 페놀 빨간색 표시등을 사용하여, 대안, 산도을 모니터 산도 테스트 용지를 사용합니다. </li><li> (; 30 μg / ML 최종 1 MG / ML 주식) 인간 fibronectin 120 μL 추가 </li><li> FBS의 0.4 ML (10 % 최종)를 추가 </li><li> 사용 전까지 얼음 솔루션을 유지. </li></ul></li><li> 피브리노겐 용액 (; 사출로 만든 당일 1 ML)을 확인 <ul><li> 0.9N NaCl 1 ML (산도 7.4) 솔루션 (30 MG / ML 최종)에 분말 섬유소의 30 밀리그램을 추가합니다. </li><li> 전에 사용, 37에서 피브리노겐 솔루션을 품어 ° C를 30 분. </li><li> 이전 콜라겐 / fibronectin 겔하기 위해뿐만 아니라, vortexing없이 부드럽게 섞는다. </li></ul></li><li> 트롬빈 용액 (200 ML)를 확인 <ul><li> 0.9 % NaCl 정상적인 생리 (50 U / ML) 200 ML에 가루 트롬빈의 1 구를 추가합니다. </li><li> 사용하기 전까지 -20 ° C에서 0.2 - μm의 기공 크기 주사기 필터 및 매장과 소독 필터. </li><li> 이전 10 U / ML의 최종 농도 0.9 % NaCl 정상 식염수에 희석 사용합니다. </li></ul></li><li> 1퍼센트 젤라틴 용액 (500 ML)를 확인 <ul><li> Dulbecco의 인산염 500 ML에 가루 젤라틴 5g을 추가 호수 (PBS)를 버퍼. </li><li> 121 ° C에서 30 분 Autoclaved. </li><li> 0.2 - μm의 기공 크기 진공 필터 살균 필터. </li></ul></li><li> 1퍼센트 젤라틴 코팅 솔루션 코트 100 mm 조직 문화 플레이트 <ul><li> 각 100 mm 조직 문화 판에 1% 젤라틴 용액 10 ML을 추가합니다. </li><li> 37 접시를 품어 ° C를 60 분. </li><li> 사용하기 전에, 젤라틴 용액을 제거하고 PBS로 한 접시를 씻으십시오. </li></ul></li></ol> 2. 휴먼 코드의 문화 내피 콜로니 - 성형 전지 (ECFCs)를 피를 유래 이 프로토콜은 ECFC의 냉동 유리병이 실험 전에 실험실에서 사용할 수 있습니다 가정합니다. ECFC는 탯줄 혈액이나 이전에 7 설명된대로 성인 말초 혈액 중의 mononuclear 세포 분획으로부터 격리 수 있습니다. <ol><li> ECFCs의 해동 한 유리병 (일반적으로 동결 미디어 1 ML 0.5 - 1x10 6 전지)는 액체 질소 저장 탱크에서 가져온 즉시 DMEM 매체 10 ML을 포함하는 15 ML 원뿔 튜브의 내용을 희석. 5 분 1,200 rpm으로 회전. 뜨는 제거하고 따뜻한 EGM - 2 중간 10 ML에있는 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 젤라틴 - 코팅 100 - mm 조직 배양 플레이트 하나 1퍼센트에 ECFC 정지 10 ML을 추가합니다. 37 ° C와 5% CO 2에서 humidified 인큐베이터에서 접시를 놓습니다. 다음날, 부드럽게 언바운드 세포와 매체를 대기음, 신선한 EGM - 2 중간 10 ML로 묶인 세포를 공급. </li><li> EGM - 2 미디어와 모든 2~3일 접시를 공급. 세포 접시가 합류 세포 monolayer로 덮여있다 이러한 확장하도록 허용합니다. 코플루엔스에서 다음과 같이 전지를 subculture : </li><li> 문화 매체를 기음과 PBS의 10 ML로 세포를 씻어. </li><li> PBS를 제거하고 각 100 mm 판에 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션 2 ML를 추가합니다. 부드럽게 골고루 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션을 배포하는 번호판을 바위. 37 품어 ° C와 5% 3~5분에 대한 CO 2. 부드럽게 거꾸로 현미경으로 정지에서 분리 세포를 볼 수있는 접시를 누릅니다. </li><li> 세포가 완전히 분리하면, EGM - 2 배지 8 ML을 추가하고 셀 solu를 수집15 ML 원뿔 관에 기. 혈구계에 세포를 세고 수확한 세포의 총 수를 해결 10 μL를 가져가라. </li><li> 플레이트 EGM - 2 배지를 사용하여 5,000 세포 / cm의 시딩 밀도에 1퍼센트 젤라틴 코팅 조직 문화 접시에있는 세포 2. 인큐베이터에있는 접시를 놓고 EGM - 2 미디어와 모든 2-3일 그들을 먹여 살리지. </li></ol> 이후 구절에 대해이 절차를 반복합니다. 세포 인구가 확장으로 통과 번호를 추적할. ECFCs는 구절 4-8 사이에 사용됩니다. 3. 인간 뼈의 문화 골수 - 유래 Mesenchymal 줄기 세포 (MSCS) 이 프로토콜은 인간 MSC의 냉동 유리병이 실험 전에 실험실에서 사용할 수 있습니다 가정합니다. 골수가로 이전 11 설명한 aspirates에서 MSC는 격리 될 수 있습니다. <ol><li> MSCS의 해동 한 유리병 (일반적으로 1 ML 냉동 미디어에 0.50 - 1x10 6 전지)는 액체 질소 저장 탱크에서 가져온 즉시 DMEM 매체 10 ML을 포함하는 15 ML 원뿔 튜브의 내용을 희석. 5 분 1,200 rpm으로 회전. 뜨는 제거하고 따뜻한 MSCGM 매체 10 ML에있는 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 한 uncoated 100 mm 조직 배양 플레이트에 MSC 서스펜션의 10 ML을 추가합니다. 37 ° C와 5% CO 2에서 humidified 인큐베이터에서 접시를 놓습니다. 다음날, 부드럽게 언바운드 세포와 매체를 대기음, 신선한 MSCGM 매체의 10 ML로 묶인 세포를 공급. </li><li> MSCGM 매체와 모든 2~3일 접시를 공급. 세포 접시 합류 세포 monolayer의 80 %에 도달 이러한 확장하도록 허용합니다. 80 % 코플루엔스에서 다음과 같이 전지를 subculture : </li><li> 문화 매체를 기음과 PBS의 10 ML로 세포를 씻어. </li><li> PBS를 제거하고 각 100 mm 판에 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션 2 ML를 추가합니다. 부드럽게 골고루 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션을 배포하는 번호판을 바위. 37 품어 ° C와 5% 3~5분을위한 CO2. 부드럽게 거꾸로 현미경으로 정지에서 분리 세포를 볼 수있는 접시를 누릅니다. </li><li> 세포가 완전히 분리하면, MSCGM 매체 8 ML을 추가하고 15 ML 원뿔 튜브에 세포 솔루션을 수집합니다. 혈구계에 세포를 세고 수확한 세포의 총 수를 해결 10 μL를 가져가라. </li><li> 플레이트 10,000 세포 / cm 2 MSCGM 매체를 사용 시딩 밀도에 uncoated 조직 문화 접시에있는 세포. 인큐베이터에있는 접시를 놓고 MSCGM 매체와 모든 2-3일 그들을 먹여 살리지. </li></ol> 이후 구절에 대해이 절차를 반복합니다. 세포 인구가 확장으로 통과 번호를 추적할. MSCS는 구절 4-8 사이에 사용됩니다. 4. 콜라겐 / Fibronectin / 피브리노겐 용액에 셀의 Resuspension (주 0) 0.8x10 6 ECFCs 및 1.2x10 6 MSCS 각 이식 및 마우스 필요합니다, 전에 실험, 문화에 충분한 ECFCs 및 MSCS가 있는지 확인하십시오. <ol><li> 각각의 문화 판의 매체를 기음과 PBS의 10 ML으로 세포를 씻으십시오. PBS를 제거하고 각 100 mm 판에 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션 2 ML를 추가합니다. 부드럽게 골고루 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션을 배포하는 번호판을 바위. 3~5분을위한 부화. 부드럽게 거꾸로 현미경으로 정지에서 분리 세포를 볼 수있는 접시를 누릅니다. </li><li> 세포가 완전히 분리하면, DMEM 매체 8 ML을 추가하고 15 ML 원뿔 튜브에 세포 솔루션을 수집합니다. 혈구계에서 세포를 계산하고 ECFCs 및 MSCS 수확한의 총 수를 해결 10 μL를 가져가라. </li><li> 전송 4x10 6 ECFCs (5 배 0.8x10 6 셀)과 하나의 50 ML 원뿔 관에 함께 6x10 6 MPCs (5 배 1.2x10 6 셀). 이 다섯 개인 이식과 생쥐에 필요한 세포의 총 금액입니다. 1,200 rpm으로 원심 분리기 및 뜨는을 제거하십시오. </li><li> 부드럽게, 콜라겐 / fibronectin 솔루션 (3 MG / ML 최종 피브리노겐 농도)의 0.9 ML로 피브리노겐 용액 100 UL을 추가, 얼음의 혼합물을 유지. </li><li> 얼음 차가운 콜라겐 / fibronectin / 피브리노겐 용액 1 ML에있는 세포 펠렛을 Resuspend, 거품을 피하기 위해 매우 부드럽게 세포를 섞는다. 1 - ML 멸균 주사기에 혼합로드하고, 주사기의 끝에 그 모자와 26 게이지 바늘을 놓으십시오. 사출까지 얼음에 로드된 주사기 보관하십시오. </li></ol> 5. Immunodeficient 누드 마우스에 주입 (주 0) 모든 동물 실험은 6 주 오래된 athymic 누드 (뉴 / 뉴) 생쥐와 함께 진행됩니다. <ol><li> 전에 주사로, isoflurane 제공 가스실에 그들을 배치하여 immunodeficient 생쥐를 마취. 그들은 (검사하여 심장 박동을 모니터) anesthetized과 발가락 핀치에 응답하기 전까지는 생쥐가 약 2 분 동안 isoflurane을 흡입하도록 허용합니다. </li><li> 각 마우스, subcutaneously 26 게이지 바늘을 사용하여 상부 등의 영역으로 트롬빈 용액 50 μL (10 U / ML)를 주입. </li><li&gt; 같은 장소에 트롬빈을 주입 어디에, 26 게이지 바늘을 사용하여 세포 혼합물 200 μL를 주입. 콜라겐은 겔 37 ° C와 섬유소 트롬빈의 존재에 섬유소 젤을 형성 것이다. 그 결과, 임플란트는 작지만 감지할 수있을 정도의 형성해야 피부 아래에 범프. </li><li> 주사 후, 편안함과 따뜻함에 대한 거즈의 레이어에 마우스를 배치하고 그들이 외래 될 때까지 그들을 관찰합니다. 그런 후, 첫 번째 사흘 동안 매일 생쥐를 관찰합니다. </li></ol> 6. 수확 (주 7) <ol><li> 한 주 주사 후, 압축 CO 2 가스를 제공 가스실에 그들을 배치하여 쥐를 안락사. </li><li> 일단 euthanized, 사출 영역 근처에 피부를 열고 잘라 수술 겔 플러그를 제거합니다. 규모로 검색 겔 플러그의 디지털 사진을하시기 바랍니다. </li><li> histological 카세트에 수확 겔 플러그를 삽입하고 깊이 10%로가 중립은 실온에서 하룻밤 포르말린을 버퍼. </li><li> 고정 후, 중립은 소주 H 2 O와 함께 거리에 포르말린 버퍼 10 % 씻고 4 histological 카세트를 삽입 ° PBS에서 C까지 histological 평가합니다. </li></ol> 7. 평가 : 조직학 (H &amp; E)와 Immunohistochemistry (hCD31) <ol><li> histological 평가를위한, 임플란트는 파라핀 및 표준 histological 절차를 사용하여 (7 μm의 두께 부분) sectioned에 포함됩니다. </li><li> 임플란트의 중간 부분에서 가져온 Hematoxilin과 Eosin (H &amp; E) 스테인드 섹션의 평가에 의해 microvessel 밀도를 계량. H &amp; E의 얼룩 표준 프로토콜이 다른 곳으로 찾을 수 있습니다. Microvessels은 적혈구를 포함 lumenal 구조로 확인할 수 있습니다. 적혈구의 평균 수를 셀 가득한 선박 / mm 2로 분석 및 표현 분야에서 microvessels로 microvessels 밀도보고합니다. </li><li> microvascular 선박, 검색된 보형물의 섹션의 인간의 본성을 설명하는 immunohistochemically 인간 특정 CD31 (hCD31) 표준 얼룩 프로토콜을 사용하여 항체 물들일해야합니다. 1:100 희석에, 우리는 DakoCytomation (CAT # M0823. 클론 JC70A)에서 단클론 마우스 안티 - 인간 CD31 항체를 사용하는 것이 좋습니다. 이 항체의 인간의 특이성은 병렬 7,11의 스테인드되었습니다 마우스 조직 섹션의 다양성과 함께 얻은 부정적인 반응에 의해 확인되었습니다. 지폐, 마우스 혈관이 자주 (특히 국경 주변) 임플란트 안에 볼 수 있지만, 마우스 선박이 항체와 긍정적인 얼룩이되지 않습니다. 또한, 인간 MSC의 존재는 CD90 또는 α - 평활근의 굴지 (α - SMA)에 대한 인간의 특정 항체와 immunohistochemical 얼룩에 의해 감지하실 수 있습니다. 인간 MSC는 새로 형성된 혈관의 혈관 주위의 지역에서 interstitially 보형물 11 전역에 모두 볼 수 있습니다. </li></ol> 8. 대표 결과 <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig1.jpg" /> 그림 1. ECFC 및 MSC 문화의 전형적인 모습. 위상 콘트라스트 micrographs는 ECFCs과 문화에 MSCS의 전형적인 모양을 표시. 내피 세포의 특성 코블 - 스톤 형태를 표시하는 코드 혈액 파생 ECFCs의 (A) 콘플루앙 monolayer. (B) 인간 뼈 MSCS는 스핀들 모양의 형태를 표시하는 골수 - 유래. 스케일러 바 200 음. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig2.jpg" /> 그림 2. 일 7 explanted 플러그의 모양. 인간의 코드 혈액 골수 파생된 파생 MSCS ECFCs과 뼈가 콜라겐 / fibronectin / 섬유소 겔에 포함된하고 텍스트에서 설명한대로 누드 생쥐에 subcutaneously 이식되었다. (A) 7 일 후에 마우스가 euthanized되면​​ 사출 영역 근처에 피부를 열고 잘라 피부를 틀지하여 셀 / 젤 플러그를 노출. (B) 플러그의 모양은 수술 마우스와 포르말린 고정하기 전에에서 삭제되었습니다. 보형물의 붉은 색은 vascularization의 표시입니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig3.jpg" /> 그림 3. explanted 플러그의 혈관 네트워크의 Histological 식별. Hematoxilin과 Eosin (H &amp; E) 스테인드 섹션 explanted 플러그의 중간 부분에서 가져온. (A) 주변 호스트 조직의 컨텍스트 (즉, 지방 조직과 골격근)의 이식 (노란 점선으로 표시) 표시 낮은 배율 (10X) 현미경. (B) 높은 배율 (40x) 플러그인 내부 현미경 표시 여러 microvessels (노란색 애로 그들 중 일부를 겨누고); microvessels은 적혈구를 포함 lumenal 구조로 확인할 수 있습니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig4.jpg" /> 그림 4. 인간 Immunohistochemical 식별루멘. Immunohistochemically 스테인드 섹션 explanted 플러그의 중간 부분에서 가져온. 1:100 희석에, 얼룩이 DakoCytomation (CAT # M0823. 클론 JC70A)에서 단클론 마우스 안티 - 인간 CD31 (hCD31) 항체를 사용하여 실시되었다 세포 핵은 hematoxilin와 counterstained되었습니다. (A) 호스트 조직을 둘러싼 상황에서 이식 (검은 점선으로 delineated) 표시 낮은 배율 (10X) 현미경. 인간의 특정, CD31 양성 microvessels은 갈색 (퍼옥시데이즈의 얼룩)에 물들어 있습니다. (B) 높은 배율 (40x) 현미경은 플러그 내부에 여러 인간 microvessels (블랙 애로 일부 hCD31 - 긍정적인 루멘 겨누고)를 표시.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이것은 생체 공학 인간의 혈관 네트워크의 실험 모델입니다. 이 모델의 주요 특징은 다음과 같습니다 1) microvessels는 이후 나탈 조직 (즉, 혈액 및 골수)에서 분리된 인간의 세포에서 형성되며 2) microvessels가 성인 동물로 형성하며, 3) microvessels 사전에서 발생하지 - 기존의 적당한 젤에 정지 단일 세포에서 드 노보 (호스트) 혈관 대신 그들은 형성,. murine vasculature에 연결 적혈구 세포 가득한 선박이 분석에서 읽을 아웃 기능 중 하나를 달성하는 데 필요한 때문에 Angiogenesis이 분석에서 중요한 역할을합니다. 또한, 호스트 골수양 세포는 초기 게시물 이식에서 이식을 모집하고, 그들은 새로운 혈관 침대 12의 형성에 필요한 있습니다. 이 실험 모델은 생체내 인간의 혈관 네트워크의 사후 나탈 형성을 연구하는 다용도, 같지는하고, 비교적 간단한 모델 시스템을 제공합니다. 또한이 분석은 수행하는 간단하고 그것은 절개하거나 수술을 필요로하지 않습니다. 모델은 인간의 내피와 혈관 주위 세포의 서로 다른 소스의 vasculogenic 가능성을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 모델은 방지 및 / 또는 프로 vasculogenic 화합물에 대한 화면으로 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 모델은 인간의 내피로 구성된 혈관 네트워크의 형성과 기능에서 특정 유전자의 역할 (들)을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> 내피 기초 중간, EBM - 2 </td><td> Lonza </td><td> CC - 3156 </td><td></td></tr><tr><td> EGM - 2 SingleQuot 보조 </td><td> Lonza </td><td> CC - 3162 </td><td></td></tr><tr><td> 글루타민 - 페니실린 - 스트렙토 마이신 솔루션, 100x GPS </td><td> Mediatech, 주식 회사 </td><td> 30-009 - CI </td><td></td></tr><tr><td> Mesenchymal 줄기 세포 성장 매체 BulletKit, MSCBM / MSCGM </td><td> Lonza </td><td> PT - 3001 </td><td></td></tr><tr><td> 높은 포도당 Dulbecco의 수정된 이글 매체, 1X DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995-073 </td><td></td></tr><tr><td> 멤 비 필수 아미노산 솔루션 100x NEAA </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> 높은 포도당 Dulbecco의 수정된 이글, 가루 DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12100-046 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES 버퍼 솔루션 </td><td> Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> Cultrex 보빈의 콜라겐 I 솔루션 </td><td> Trevigen </td><td> 3442-050-01 </td><td></td></tr><tr><td> Cultrex 인간 Fibronectin </td><td> Trevigen </td><td> 3420-001-01 </td><td></td></tr><tr><td> 보빈 플라즈마에서 피브리노겐 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> F8630 - 1G </td><td></td></tr><tr><td> 젤라틴 </td><td> 어부 </td><td> DF0143 - 17-9 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco의 인산염은 호수, PBS를 버퍼 </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션, 1X </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> 흡입에 대한 Isoflurane, 액체 </td><td> Buxter 헬스케어 주식 회사 </td><td> NDC 10019-360-40 </td><td></td></tr><tr><td> 보빈 플라즈마에서 트롬빈 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> T4648 - 1KU </td><td></td></tr><tr><td> 포르말린 솔루션, 중립은 버퍼 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> HT501128 </td><td></td></tr><tr><td> 단클론 마우스 안티 - 인간 CD31 항체 </td><td> DakoCytomation </td><td> M0823 </td><td> 클론 JC70A </td></tr></tbody></table>

bioengineering human microvascular networks in immunodeficient mice

조직 공학 및 조직 재생을위한 세포 기반 치료법​​의 미래는 가능성이 생체내 혈관의 기능적 네트워크를 생성하는 능력에 의존합니다. 이 점에서, 생체내의 혈관 네트워크를 구축하기 위해 실험 모델에 대한 검색 가장 중요 하나입니다. 생체내에서 생체 공학의 microvascular 네트워크의 가능성은 최초의 인간 조직 파생 성숙 내피 세포 (내장 컴퓨터 시스템) 2-4 사용하여 표시되었다; 광범위한 임상 사용을위한 그러나, autologous 내피 세포는 현재의 문제가, 그들은 충분한 수량의 취득 및 요구하기가 어렵습니다 때문에 기존 vasculature에서 수확. 이러한 제한은 내장 컴퓨터 시스템의 다른 자원에 대한 검색 왔습니다 있습니다. 혈액의 내피 식민지 - 형성 세포 (ECFCs)의 신분이 아닌 invasively 얻을 수있는 기회를 제공하는 것은 5-7 항법. 우리와 다른 저자는 성인과 코드 혈액 파생 ECFCs은 생체내 7-11의 기능 혈관 네트워크를 형성하는 능력을 가지고 것으로 나타났습니다. 중요한 것은 이러한 연구는 또한 안정적이고 내구성이 혈관 네트워크를 얻는 것으로 나타났습니다, ECFCs는 혈관 주위 세포와 공동 주입을 필요로합니다. 우리가 여기서 설명하는 분석이 개념을 보여줍니다 : 우리는 기능적인 인간을 형성하는 콜라겐 / fibronectin / 피브리노겐 젤의 단일 세포 현탁액으로 골수 파생 mesenchymal 줄기 세포 (MSCS)와 함께 할 수있는 방법을 인간이 코드 혈액 파생 ECFCs보기 immunodeficient 마우스에 주입 후 7 일 이내에 혈관 네트워크. 호스트 적혈구를 포함하는 인간 ECFC 늘어선 루멘의 존재는뿐만 아니라 혈관 네트워크의 형성 (드 노보)뿐만 아니라 호스트 순환 시스템 기능 anastomoses의 발전을 나타내는 이식을 통해 볼 수 있습니다. 새로 개발 했나 인간의 혈관 네트워크의 murine 모델은 이상적으로 인간의 혈관 네트워크 형성 세포와 분자 메커니즘에 대한 연구 및 엔지니어링 조직을 vascularize 전략의 개발에 적합합니다.

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Bioengineering Human Microvascular Networks in Immunodeficient Mice

여기서 우리는 인간의 코드 혈액 유래 내피 식민지 - 형성 세포 (ECFCs) 및 골수 - 유래 subcutaneously immunodeficient 마우스로 콜라겐 / fibronectin 겔에 포함된 mesenchymal 줄기 세포 (MSCS)를,.을 제공하는 방법을 설명 이 셀 / 젤 조합은 마우스 vasculature와 연결하는 인간의 혈관 네트워크를 생성합니다.

Immunodeficient 마우스의 생체 공학 인간 Microvascular 네트워크

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks ...

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Research

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12.2K 조회수.  Harvard Medical School. 여기서 우리는 인간의 코드 혈액 유래 내피 식민지 - 형성 세포 (ECFCs) 및 골수 - 유래 subcutaneously immunodeficient 마우스로 콜라겐 / fibronectin 겔에 포함된 mesenchymal 줄기 세포 (MSCS)를,.을 제공하는 방법을 설명 이 셀 / 젤 조합은 마우스 vasculature와 연결하는 인간의 혈관 네트워크를 생성합니다.

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Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

진단 도구를 개발하기 위해 마이크로 전자 기계 시스템 (MEMS)를 사용

연구

생물학

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + HIV에 대한 일회용 Microfluidic 칩을 사용하여 T - 림프구 캡처

Title Cell Encapsulation by Droplets

흩뿌려진의 제목 셀 캡슐화

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development of constructs for tissue engineering. This environment better mimics what cells observe in vivo, compared to standard tissue culture, due to the tissue-like properties and 3D environment. Synthetic polymeric hydrogels are water-swollen networks that can be designed to be stable or to degrade through hydrolysis or proteolysis as new tissue is deposited by encapsulated cells. A wide variety of polymers have been explored for these applications, such as poly(ethylene glycol) and hyaluronic acid. Most commonly, the polymer is functionalized with reactive groups such as methacrylates or acrylates capable of undergoing crosslinking through various mechanisms. In the past decade, much progress has been made in engineering these microenvironments - e.g., via the physical or pendant covalent incorporation of biochemical cues - to improve viability and direct cellular phenotype, including the differentiation of encapsulated stem cells (Burdick et al.).
The following methods for the 3D encapsulation of cells have been optimized in our and other laboratories to maximize cytocompatibility and minimize the number of hydrogel processing steps. In the following protocols (see Figure 1 for an illustration of the procedure), it is assumed that functionalized polymers capable of undergoing crosslinking are already in hand; excellent reviews of polymer chemistry as applied to the field of tissue engineering may be found elsewhere (Burdick et al.) and these methods are compatible with a range of polymer types. Further, the Michael-type addition (see Lutolf et al.) and light-initiated free radical (see Elisseeff et al.) mechanisms focused on here constitute only a small portion of the reported crosslinking techniques. Mixed mode crosslinking, in which a portion of reactive groups is first consumed by addition crosslinking and followed by a radical mechanism, is another commonly used and powerful paradigm for directing the phenotype of encapsulated cells (Khetan et al., Salinas et al.).

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering

We present protocols for the 3-dimensional (3D) encapsulation of cells within synthetic hydrogels. The encapsulation procedure is outlined for two commonly used methods of crosslinking (michael-type addition and light-initiated free radical mechanisms), as well as a number of techniques for assessing encapsulated cell behavior.

조직 공학을위한 3D Hydrogels에서 셀룰러 봉지

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development ...

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves required for peristalsis and mediate neuronal input from the enteric nervous system1. Different subtypes of ICC form distinct networks in the muscularis of the GI tract 2,3. Loss or injury to these networks is associated with a number of motility disorders4. ICC cells express the KIT receptor tyrosine kinase on the plasma membrane and KIT immunostaining has been used for the past 15 years to label the ICC network5,6. Importantly, normal KIT activity is required for ICC development5,6. Neoplastic transformation of ICC cells results in gastrointestinal stromal tumor (GIST), that frequently harbor gain-of-function KIT mutations7,8. We recently showed that ETV1 is a lineage-specific survival factor expressed in the ICC/GIST lineage and is a master transcriptional regulator required for both normal ICC network formation and for of GIST tumorigenesis9. We further demonstrate that it cooperates with activating KIT mutations in tumorigenesis. Here, we describe methods for visualization of ICC networks in mice, largely based on previously published protocols10,11. More recently, the chloride channel anoctamin 1 (ANO1) has also been characterized as a specific membrane marker of ICC11,12. Because of their plasma membrane localization, immunofluorescence of both proteins can be used to visualize the ICC networks. Here, we describe visualization of the ICC networks by fixed-frozen cyrosections and whole mount preparations.

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are the pacemaker cells of the gastrointestinal (GI) tract. They form complex networks between smooth muscle cells and post-ganglionic neuronal fibers to regulate GI contractility. Here, we present immunofluorescence methods cross-sectional and whole-mount visualization of murine ICC networks.

마우스의 Cajal (ICC) 네트워크의 중간 세포의 시각화

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Endothelial Cell Co-culture Mediates Maturation of Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Insulin Producing Cells in a Directed Differentiation Approach

Embryonic stem cells (ESC) have two main characteristics: they can be indefinitely propagated in vitro in an undifferentiated state and they are pluripotent, thus having the potential to differentiate into multiple lineages. Such properties make ESCs extremely attractive for cell based therapy and regenerative treatment applications 1. However for its full potential to be realized the cells have to be differentiated into mature and functional phenotypes, which is a daunting task. A promising approach in inducing cellular differentiation is to closely mimic the path of organogenesis in the in vitro setting. Pancreatic development is known to occur in specific stages 2, starting with endoderm, which can develop into several organs, including liver and pancreas. Endoderm induction can be achieved by modulation of the nodal pathway through addition of Activin A 3 in combination with several growth factors 4-7. Definitive endoderm cells then undergo pancreatic commitment by inhibition of sonic hedgehog inhibition, which can be achieved in vitro by addition of cyclopamine 8. Pancreatic maturation is mediated by several parallel events including inhibition of notch signaling; aggregation of pancreatic progenitors into 3-dimentional clusters; induction of vascularization; to name a few. By far the most successful in vitro maturation of ESC derived pancreatic progenitor cells have been achieved through inhibition of notch signaling by DAPT supplementation 9. Although successful, this results in low yield of the mature phenotype with reduced functionality. A less studied area is the effect of endothelial cell signaling in pancreatic maturation, which is increasingly being appreciated as an important contributing factor in in-vivo pancreatic islet maturation 10,11.
The current study explores such effect of endothelial cell signaling in maturation of human ESC derived pancreatic progenitor cells into insulin producing islet-like cells. We report a multi-stage directed differentiation protocol where the human ESCs are first induced towards endoderm by Activin A along with inhibition of PI3K pathway. Pancreatic specification of endoderm cells is achieved by inhibition of sonic hedgehog signaling by Cyclopamine along with retinoid induction by addition of Retinoic Acid. The final stage of maturation is induced by endothelial cell signaling achieved by a co-culture configuration. While several endothelial cells have been tested in the co-culture, herein we present our data with rat heart microvascular endothelial Cells (RHMVEC), primarily for the ease of analysis.

The current study describes a directed differentiation approach in inducing pancreatic differentiation of human embryonic stem cells. Of great significance is the finding that endothelial cell co-culture mediates maturation of human embryonic stem cell derived pancreatic progenitors into insulin expressing cells.

인간 배아의 내피 세포 공동 배양 Mediates의 성숙은 감독 차별화 접근법에서 췌장 인슐린 생산 세포로 세포를 줄기

Embryonic stem cells (ESC) have two main characteristics: they can be indefinitely propagated in vitro in an undifferentiated state and they are ...

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the cell is affected by external signals (e.g. drug treatment), or how cells differ between a healthy state and a diseased state. With the advent and continuous refinement of next-generation DNA sequencing technology, RNA-sequencing (RNA-seq) has become an increasingly popular method of transcriptome analysis to catalog all species of transcripts, to determine the transcriptional structure of all expressed genes and to quantify the changing expression levels of the total set of transcripts in a given cell, tissue or organism1,2 . RNA-seq is gradually replacing DNA microarrays as a preferred method for transcriptome analysis because it has the advantages of profiling a complete transcriptome, providing a digital type datum (copy number of any transcript) and not relying on any known genomic sequence3.
Here, we present a complete and detailed protocol to apply RNA-seq to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is based on our recent published study entitled "RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin,"4 in which we successfully performed the first complete transcriptome analysis of human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin using RNA-seq. It yielded unprecedented resources for further experimentation to gain insights into molecular mechanisms underlying thrombin-mediated endothelial dysfunction in the pathogenesis of inflammatory conditions, cancer, diabetes, and coronary heart disease, and provides potential new leads for therapeutic targets to those diseases.
The descriptive text of this protocol is divided into four parts. The first part describes the treatment of human pulmonary microvascular endothelial cells with thrombin and RNA isolation, quality analysis and quantification. The second part describes library construction and sequencing. The third part describes the data analysis. The fourth part describes an RT-PCR validation assay. Representative results of several key steps are displayed. Useful tips or precautions to boost success in key steps are provided in the Discussion section. Although this protocol uses human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin, it can be generalized to profile transcriptomes in both mammalian and non-mammalian cells and in tissues treated with different stimuli or inhibitors, or to compare transcriptomes in cells or tissues between a healthy state and a disease state.

This protocol presents a complete and detailed procedure to apply RNA-seq, a powerful next-generation DNA sequencing technology, to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is generalizable to various cells or tissues affected by different reagents or disease states.

RNA-seq의 트롬빈 - 처리의 Transcriptomes 분석 및 제어 인간 폐 Microvascular 내피 세포

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

센다이 바이러스와 인간의 체세포의 효율적인 생성 인간 유도 만능 줄기 세포

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

CMAH (cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) is responsible for the oxidation of cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acids in mammals. However, humans cannot oxidize cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid to cytidine monophosphate-N-glycolylneuraminic acid due to a primary exon deletion of the CMAH gene. To understand the effects and implications of the lack of CMAH activity in more detail, a Cmah knock-out model in mice is of keen interest in basic and applied research. The analysis method to determine the phenotype of this mouse model is herein described in detail, and is based on the detection of both N-acetylneuraminic acid and N-glycolylenuraminic acid in the liver and milk of wild-type and Cmah knock-out mice. Endogenous sialic acids are released and derivatized with o-phenylenediamine to generate fluorogenic derivatives, which can be subsequently analyzed by HPLC. The presented protocol can be also applied for the analysis of milk and tissue samples from various other origins, and may be of use to investigate the nutritional and health effects of N-glycolylneuraminic acid.

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

We describe a HPLC-based method for the determination of N-acetylneuraminic acid and N-glycolylenuraminic acid in mouse liver and milk.

야생형과 간암의 시알 산의 결정<em&gt; CMAH</em&gt; 넉 아웃 마우스.

CMAH (cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) is responsible for the oxidation of cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acids in ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related disorders continue to be a major contributor of deaths around the world, necessitating the need for even greater understanding of their pathobiology. Traditional antibody-based techniques like western blotting or immunohistochemistry suffer from being low-throughput besides being labor-intensive and qualitative or semi-quantitative. Even conventional mass spectrometry-based shotgun approaches fail to provide conclusive evidence to support a certain hypothesis. Targeted proteomics approaches are largely hypothesis driven and differ from the conventional shotgun proteomics approaches that have been long in use. Multiple reaction monitoring is one such targeted approach that requires the use of a special mass spectrometer called the tandem quadrupole mass spectrometer or triple quadrupole mass spectrometer. In the current study, we have systematically highlighted the major steps involved in performing a successful tandem quadrupole mass spectrometry-based proteomics workflow using human brain tissue with an aim to introduce this workflow to a broader research community.

The protocol aims to introduce the use of a triple quadrupole mass spectrometer for Multiple Reaction Monitoring (MRM) of proteins from clinical samples. We have provided a systematic workflow starting from sample preparation to data analysis for clinical samples with all the necessary precautions to be taken.