Este trabalho foi financiado pela Wellcome Trust 088419 concessão para MDB e patrocínio da Smith &amp; Nephew UK Ltd.

1. As superfícies de revestimento com o ligando Matrix <ol><li> O ultra-som será aplicado a células em 3,5 cm de poços, quer como pratos individuais ou como uma placa de 6 poços. Para ensaios bioquímicos ligando revestimento, directamente sobre o plástico. Para imunofluorescência, vidro fervura lamelas três vezes em água e MilliQ lugar 4 lamelas para o fundo de cada poço. </li><li> As superfícies de vidro deve ser derivatizados para assegurar revestimento ligante eficiente. Dissolver sulfo-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide éster em PBS a 1 mM. Adicionar 2 ml a cada poço e incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Lave as superfícies derivatizados 3 vezes com PBS. </li><li> Casaco, quer de vidro ou de plástico não tratada derivatizado com o ligando de integrina. Aplicar 2 ml de 10 ug / ml integrina ligand9, dissolvido em PBS contendo Ca 2 + e Mg 2 + a cada poço e incubar durante a noite a 4 ° C. </li><li> Preparar monoparticulate BSA por aquecimento BSA a 1%, dissolvido em PBS, a 85 ° C durante 13 minutos. Permitirarrefecer e então passar através de um filtro de 0,45 mícrons. </li><li> Lavar-ligando superfícies revestidas com 3 vezes com PBS e bloqueio com BSA a monoparticulate durante 30 minutos. </li></ol> 2. Preparação de Células <ol><li> Para controlar o ambiente da matriz ao longo da experiência, a síntese de proteína deve ser bloqueada por adição de 25 cicloheximida ug / ml a 80% confluentes de fibroblastos durante 2 horas. </li><li> Lavar cicloheximida células tratadas com PBS e destacar do frasco de cultura utilizando 0,5 mg / ml de tripsina / EDTA. </li><li> As células destacadas de colheita por centrifugação a 500 xg durante 5 minutos. </li><li> Ressuspender as células em DMEM/25 mM de HEPES, 25 ug / ml cicloheximida. </li><li> Contar densidade celular da suspensão usando um hemocitómetro e diluir até 105 ml-1. </li><li> Incubar as células a 37 ° C durante 20 minutos para recuperar a integrina de superfície. </li><li> Enxaguar o ligando-revestido, BSA-bloqueados poços 3 vezes com PBS. </li><li> Ml de sementes 2 da suspensão de células em cada poço. </li><li> Allocélulas w para espalhar durante 2 horas a 37 ° C, 5% de CO 2. </li></ol> 3. Estimulação ultra-som <ol><li> Aqueceu-se a matriz emissor de ultra-som e gel de acoplamento para 37 ° C. </li><li> Aplique uma gota do tamanho de ervilha de acoplamento gel para cada emissor. </li><li> Teste que cada emissor é funcional usando um detector de ultra-som diodo indicador. </li><li> Colocar os poços na matriz emissor. Retornar matriz para 37 ° C, 5% de CO 2 a temperatura e deixa-se equilibrar durante 10 minutos. </li><li> Ligue o sinal de ultra-som. </li><li> O sinal de ultra-som desactivará após 20 minutos, imitando o regime terapêutico. Se os tempos mais curtos de estimulação são necessárias, as chapas devem ser removidos da matriz no momento apropriado de pontos. Em todos os casos usar não estimulada placas, como controlo negativo. </li></ol> 4. Análise de Adesão Focal por imunofluorescência <ol><li> Para a análise de formação de adesão focal, aplicar o sinal de ultra-som 20 minutose então permitir que as estruturas para desenvolver durante mais 40 minutos, mantendo as células a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Aspirar meios de comunicação e fixar as células mediante a aplicação de 2 ml de paraformaldeído a 4% em PBS. Incubar durante 14 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Aspirar paraformaldeído e lavar três vezes com PBS, aplicando o PBS suavemente para baixo da borda do poço para evitar a geração de forças de cisalhamento. </li><li> Transfira cada lamela a partir dos 3,5 cm bem a uma placa de 24 cavidades para a coloração de imunofluorescência subsequente. </li><li> Têmpera paraformaldeído residual mediante a aplicação de 0,5 ml 0,1 M glicina em PBS a cada um dos 24 poços. Incubar durante 20 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Aspirado glicina e enxaguar três vezes com PBS. </li><li> Permeabilise células mediante a aplicação de 0,5 ml de Triton 0,5% X-100 (w / v) em PBS. Incubar durante 4 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Aspirado Triton X-100 e enxaguar três vezes com PBS. </li><li> Bloquear mediante a aplicação de 0,5 ml de 3% (w / v) de BSA em PBS. Incubar durante uma noite a 4 &amp; dpor exemplo; C. </li><li> Stain vinculina contendo adesão focal com hVIN-1 anticorpo diluído 1:400 em bloco de BSA. Incubar durante uma hora à temperatura ambiente. </li><li> Lavar três vezes com PBS. </li><li> Aplicar fluoróforo (DyLight 488) anticorpo secundário conjugado (diluído 1:200) e actina mancha com TRITC-faloidin conjugado (diluído 1:200) no bloco de BSA. Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Lavar três vezes com PBS, e uma vez com água. </li><li> Montar em uma lâmina de vidro em uma posição invertida usando Prolongar montagem Gold. </li></ol> 5. Quantificação de Rac1 Ativação por Pull-down Ensaio <ol><li> Para a análise de Rac1 activação, aplicar o sinal de ultra-som de 20 minutos para as células a 37 ° C, 5% de CO 2. Ao avaliar os tempos de resposta mais longos do que 20 minutos, aplicar o sinal de ultra-som durante 20 minutos e manter as células a 37 ° C, 5% de CO2 durante o tempo restante para permitir que a resposta para se desenvolver. </li><li> Aspirar e mídia local bems em gelo. Lavar os poços com 2 ml de PBS frio e aspirado. Garantir qualquer PBS residual é removido, deixando poços inclinado para 1 minuto, seguido por aspiração completa. </li><li> Lisar as células em gelo com 35 uL de tampão de lise (10% de glicerol, 20 mM de Hepes pH 7,4, 140 mM de NaCl, 1% de NP40, 0,5% desoxicolato de sódio, 4 mM de EGTA, 4 mM de EDTA, 1 × inibidor da protease completa) por poço. Neste exemplo, 6 poços são utilizados por ponto de tempo para gerar uL 210 de lisado de células. Mais poços ou menos podem ser utilizados, mas o volume total deve lisado total de ~ 200 uL. </li><li> Células Scrape cuidadosamente com raspador de células a fim de assegurar a lise das células completas e deixar poços inclinado durante 1 minuto para permitir lisado para a piscina. </li><li> Transferir para um lisado gelada tubo de microcentrífuga de 1,5 ml (pooling lisados ​​a partir de regime de tratamento mesma) e centrifugação a 21.000 xg durante 2 minutos a 4 ° C para sedimentar os restos celulares. </li><li> Transferir 180 uL de lisado de gelada tubos de microcentrífuga de 1,5 ml contendo 130 ul de tampão de lise e 25 uL PAK-glutpérolas de agarose athione 10. Manter restante lisado bruto a -20 ° C para a separação de gel subsequente. </li><li> Capturar Rac1 activo sobre os grânulos de agarose de glutationa-PAK pela rotação tubos durante 40 minutos a 4 ° C. </li><li> Colheita de agarose grânulo conjugados por centrifugação a 2000 × g durante 1 minuto a 4 ° C. </li><li> Lavagem grânulo conjuga três vezes com 500 uL de tampão de lise, a colheita grânulos por centrifugação a 2000x g sobrenadante e descartando depois de cada lavagem. Cuidadosamente remover qualquer tampão de lavagem restante lise com uma pipeta de 200 uL. </li><li> Eluir cada amostra por adição de 35 uL de tampão de carregamento de SDS-PAGE e incubar a 85 ° C em um bloco de aquecimento com agitação durante 5 minutos. Remover grânulos por centrifugação a 21.000 xg durante 1 minuto. </li><li> Resolver eluato grânulo por SDS-PAGE, transferência para nitrocelulose e sonda para a Rac1. </li></ol> 6. Os resultados representativos Neste protocolo, descrevemos a indução de vinculina-manchaed adesões focais e Rac1 atividade por ultra-som. Para a experiência de adesão focal, a posição de linha de base é que os fibroblastos, distribuídos sobre um ligando de α β 5 1-integrina não formam vinculina contendo aderências (Fig. 3A), a menos que um receptor de fibronectina em segundo lugar, sindecam-4, está envolvida por adição de ligando solúvel (Fig. 3B) 3,4. No entanto, a estimulação com ultra-som induz a formação de adesão focal para a mesma extensão como acoplamento de sindecam-4 (Fig. 3C), indicando que a estimulação de ultra-som pode substituir determinados componentes da via de sinalização de fibronectina-dependente 5. O principal obstáculo com este protocolo está eliminando a formação de adesão focal na ausência de estimulantes. Inibição da síntese de proteínas incompleta por cicloheximida irá permitir a deposição de matriz que é suficiente para que as células auto-estimular. Superlotação de células pode também conduzir a baixo nível de adesão focal formation e uma má resposta ao ultra-som como crosstalk entre célula-célula e célula-matriz de contatos vai complicar um experimento que foi projetado para isolar um único estímulo. Como um desenvolvimento do ensaio básico que mostram a mesma experiência, repetiu com fibroblastos que faltam sindecam-4 (Fig. 4). Estes fibroblastos ainda respondem aos ultra-sons (Fig. 4C), mas não respondem ao sindecam-4 ligando (Fig. 4B). O experimento utilizando Sdc4 - / - fibroblastos demonstra que o ultrassom pode realmente ignorar a necessidade de receptores de fibronectina certas, e ilustra como o protocolo simples podem ser desenvolvidos para obter informações adicionais sobre a via de sinalização. Para a experiência bioquímica demonstramos que ultra-som pode induzir activação de Rac1, utilizando um ensaio de pull-down que é uma adaptação do método descrito por Del Pozo et al. 10. Precipitação do activo Rac1 0, 10, 30 e 60 minutos após iniciação de estimulação de ultra-som revela que Rac1 picos de actividade em 10-30 minutos, antes de retornar à linha de base (Fig. 5). Blotting lisados ​​bruto para vinculina garante carregamento equivalente entre os pontos de tempo. O resultado assemelha-se a ativação de Rac1 pelo engajamento de sindecam-4 3, mas é um pouco mais prolongada do que a ativação pela fibronectina. Portanto 8-10 repete são normalmente necessários para a obtenção de dados significativos. Ativação de Rac1 é responsável por compromisso de células para a formação de adesão focal e nascentes adesões focais começam a se formar em 10-30 minutos, coincidindo com Rac1 ativação. Uma vez iniciado, essas aderências continuará a amadurecer em placas de adesão das grandes mostradas nas Figuras 3 e 4. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig1.jpg" /> Figura 1. A forma de onda de ultra-som. O ultra-som é composto por um sinal intermitente 1,5 MHz que, devido à baixa amplitude (30 mW / cm &lt;sup&gt; 2, média espacial, a média temporal) não tem efeito de aquecimento. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig2.jpg" /> Figura 2. Representação esquemática do fluxo de trabalho para preparação e estimulação de células com ultra-som. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig3.jpg" /> Figura 3. Indução ultra-som de formação de adesão focal em fibroblastos. Os fibroblastos foram espalhados sobre o fragmento de integrina de ligação da fibronectina (A) antes da estimulação com o fragmento de sindecam-4-a ligação da fibronectina (B) ou de ultra-som (C). Após 60 minutos de estimulação, as células foram fixadas, coradas para vinculina e actina, e fotografada pela epifluorescência. Barra = 10 uM. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig4.jpg" /> Figura 4. Indução ultra-som de formação de adesão focal em fibroblastos falta sindecam-4. <em&gt; Sdc4 - / - fibroblastos foram espalhados sobre o fragmento de integrina de ligação da fibronectina (A) antes da estimulação com o fragmento de sindecam-4-a ligação da fibronectina (B) ou de ultra-som (C). Após 60 minutos de estimulação, as células foram fixadas, coradas para vinculina e actina, e fotografada pela epifluorescência. Embora Sdc4 - / - fibroblastos foram fibronectina insensível, ultra-som ainda induziram a formação da adesão focal, indicando que o ultrassom ignora engajamento receptor matriz. Barra = 10 uM. <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig5.jpg" /> Figura 5. Ativação de Rac1 por ultra-som. As células foram estimuladas durante 0, 10, 30 e 60 minutos, com 6 poços utilizados por ponto de tempo. A quantidade de GTP-Rac1 presentes em amostras de um curso de tempo Rac1 pull-down ensaio foi visualizada por incubação com anticorpo anti-Rac1 sobre uma western blot (imagem de cima). Quantificação da intensidade da banda (média de 8-10 repetições) revela aumento Rac1 umctividades resultante a partir do sinal de ultra-som com 10 e 30 minutos, antes de retornar para níveis basais de 60 minutos (gráfico). As barras de erro representam SEM

<ol>
	<li>Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+syndecan-4+hair+trigger+initiates+wound+healing+through+caveolin-+and+RhoG-regulated+integrin+endocytosis.">A syndecan-4 hair trigger initiates wound healing through caveolin- and RhoG-regulated integrin endocytosis.</a> Dev. Cell. 21, 681-693 (2011).</li><li>Echtermeyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+wound+repair+and+impaired+angiogenesis+in+mice+lacking+syndecan-4.">Delayed wound repair and impaired angiogenesis in mice lacking syndecan-4.</a> J. Clin. Invest. 107, R9-R14 (2001).</li><li>Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syndecan-4-dependent+Rac1+regulation+determines+directional+migration+in+response+to+the+extracellular+matrix.">Syndecan-4-dependent Rac1 regulation determines directional migration in response to the extracellular matrix.</a> J. Cell Biol. 177, 527-538 (2007).</li><li>Woods, A., Couchman, J. R., Johansson, S., Hook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+and+cytoskeletal+organisation+of+fibroblasts+in+response+to+fibronectin+fragments.">Adhesion and cytoskeletal organisation of fibroblasts in response to fibronectin fragments.</a> Embo. J. 5, 665-670 (1986).</li><li>Mahoney, C. M., Morgan, M. R., Harrison, A., Humphries, M. J., Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+ultrasound+bypasses+canonical+syndecan-4+signaling+to+activate+rac1.">Therapeutic ultrasound bypasses canonical syndecan-4 signaling to activate rac1.</a> J. Biol. Chem. 284, 8898-8909 (2009).</li><li>Claes, L., Willie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enhancement+of+bone+regeneration+by+ultrasound.">The enhancement of bone regeneration by ultrasound.</a> Prog. Biophys. Mol. Biol. 93, 384-398 (2007).</li><li>Heckman, J. D., Ryaby, J. P., McCabe, J., Frey, J. J., Kilcoyne, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+tibial+fracture-healing+by+non-invasive,+low-intensity+pulsed+ultrasound.">Acceleration of tibial fracture-healing by non-invasive, low-intensity pulsed ultrasound.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 76, 26-34 (1994).</li><li>Kristiansen, T. K., Ryaby, J. P., McCabe, J., Frey, J. J., Roe, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+healing+of+distal+radial+fractures+with+the+use+of+specific,+low-intensity+ultrasound.+A+multicenter,+prospective,+randomized,+double-blind,+placebo-controlled+study.">Accelerated healing of distal radial fractures with the use of specific, low-intensity ultrasound. A multicenter, prospective, randomized, double-blind, placebo-controlled study.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 79, 961-973 (1997).</li><li>Danen, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+the+synergy+site+for+cell+adhesion+to+fibronectin+depends+on+the+activation+state+of+integrin+alpha+5+beta+1.">Requirement for the synergy site for cell adhesion to fibronectin depends on the activation state of integrin alpha 5 beta 1.</a> J. Biol. Chem. 270, 21612-21618 (1995).</li><li>Del Pozo, M. A., Price, L. S., Alderson, N. B., Ren, X. D., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+to+the+extracellular+matrix+regulates+the+coupling+of+the+small+GTPase+Rac+to+its+effector+PAK.">Adhesion to the extracellular matrix regulates the coupling of the small GTPase Rac to its effector PAK.</a> Embo. J. 19, 2008-2014 (2000).</li><li>Makarem, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competitive+binding+of+vascular+cell+adhesion+molecule-1+and+the+HepII/IIICS+domain+of+fibronectin+to+the+integrin+alpha+4+beta+1.">Competitive binding of vascular cell adhesion molecule-1 and the HepII/IIICS domain of fibronectin to the integrin alpha 4 beta 1.</a> J. Biol. Chem. 269, 4005-4011 (1994).</li></ol>

Andrew Harrison é um funcionário da Smith &amp; Nephew UK Limited.

Neste protocolo que descrevem o método pelo qual um tratamento que é normalmente aplicado a pacientes humanos pode ser utilizado em baseados em células experimentos. O objetivo final é entender o mecanismo molecular de ação ultra-som para que a terapia pode ser refinado. Neste protocolo, usamos fibroblastos embrionários (MEFs) como um sistema de célula de modelo, mas ultra-som tem sido também foi encontrado para ser eficaz em primárias fibroblastos de prepúcio humano 5, as células estaminais mesenquimais, osteoblastos e condrócitos 6. Usamos Rac1 activação como um ensaio bioquímico exemplo, mas o método pode ser utilizado igualmente para testar regulação da fosforilação da proteína ou a formação de complexos de proteína por imunoprecipitação. Para o exemplo de imunofluorescência que demonstram um efeito sobre a formação de ultra-som de adesão focal, mas redistribuição de qualquer molécula poderia ser examinado. Por exemplo, pode-se testar o recrutamento de factores citosólicos para a membrana plasmática, colocalisation de proteins em vesículas de tráfico ou examinar o efeito do ultra-som sobre a organização do fuso mitótico. Até agora, confinado-nos a testar fibronectina dependentes de vias, por efeito de ultra-som em células em colagénio, ou na presença de factores de crescimento podem ser testados para construir uma imagem de ultra-som como afecta o comportamento das células em um meio complexo que mais assemelha uma situação in vivo. Um desafio maior será o de testar o efeito de ultra-som usando lapso de tempo de imagem, onde a presença do emissor bloqueando o caminho da luz e vibrações ultra-sons a partir dos presentes adicionais obstáculos técnicos. No entanto, o facto de a aplicação terapêutica requer apenas 20 minutos de estimulação por dia sugere que a análise do comportamento celular após uma explosão de estimulação pode muito bem ser produtivo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> sulfo-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide éster </td><td> FisherPerbio </td><td> PN22312 </td><td> 25 estoques mM dissolvidos em água pode ser armazenada a -20 ° C </td></tr><tr><td> 6-bem placa de cultura de tecido </td><td> Corning </td><td> 3516 </td><td> Plástico de outras empresas pode revestir mal </td></tr><tr><td> 13 mm de lamela de vidro </td><td> Suprimentos Ltd.SLS laboratório científicos </td><td> MIC3336 </td><td> Vidro de outras empresas pode revestir mal </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Sigma </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, Ca 2 + 2 + Mg </td><td> Sigma </td><td> D8662 </td><td></td></tr><tr><td> 50K integrina ligando (fragmento de fibronectina) </td><td> Construir descrição e préparação em 9, 11 </td><td></td><td> Ligandos alternativos de matriz pode ser usada para interrogar outras vias </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A3059 </td><td></td></tr><tr><td> Cicloheximida </td><td> Sigma </td><td> C7698 </td><td> Podem ser armazenados como estoque 10mg/ml em água </td></tr><tr><td> DMEM/25 mM de HEPES </td><td> Sigma </td><td> D6171 </td><td></td></tr><tr><td> Exógena 4000 + </td><td> Smith &amp; Nephew Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gel de acoplamento de ultra-som </td><td> Smith &amp; Nephew Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SAFHS indicador </td><td> Smith &amp; Nephew Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> hVIN-1 </td><td> Sigma </td><td> V9264 </td><td></td></tr><tr><td> DyLight 488-conjugado anti-rato </td><td> Stratech Científico </td><td> 715-485-150 </td><td></td></tr><tr><td> TRITC-faloidin marcado &lt;/ Td&gt; <td> Sigma </td><td> P1951 </td><td></td></tr><tr><td> Prolongar reagente Antifade Ouro </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td><td></td></tr><tr><td> inibidor de protease completo (EDTA livre) </td><td> Roche </td><td> 056 489 001 </td><td> 100 × estoque feita a partir de comprimido armazenado a -20 ° C </td></tr><tr><td> PAK-esferas de agarose de glutationa </td><td> Construir descrição e preparação em 10 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Pescador </td><td> G/0650/17 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Apollo Científico </td><td> BI8181 </td><td> Faça estoque 1M e pH para 7,4 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Pescador </td><td> S/0160/65 </td><td></td></tr><tr><td> NP40 </td><td> Sigma </td><td> I3021 </td><td></td></tr><tr><td> Desoxicolato de sódio </td><td> Sigma </td><td> D6750 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> E4378 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td><td></td></tr></tbody></table>

induction of adhesion-dependent signals using low-intensity ultrasound

Em organismos multicelulares, o comportamento das células é ditada por interacções com a matriz extracelular. Consequências da matriz engajamento alcance da regulação da migração e proliferação celular, a secreção e até mesmo a diferenciação. Os sinais subjacentes cada um destes processos complexos surgem a partir das interacções moleculares dos receptores da matriz extracelular sobre a superfície da célula. As integrinas são os receptores prototípicos e fornecer uma ligação mecânica entre a matriz extracelular e do citoesqueleto, bem como o início de alguns dos cascatas de adesão dependente de sinalização. No entanto, está se tornando cada vez mais evidente que os receptores transmembrana adicionais funcionar juntamente com as integrinas para regular tanto a integrina a si mesmo e sinais a jusante. O mais elegante destes exemplos é o proteoglicano transmembranar, sindecam-4, que coopera com α β 5 1-integrina durante a adesão a fibronectina. Modelos in vivo demonstrcomeu a importância da sindecam-4 de sinalização, como sindecam-4 mata-mata-ratos apresentam retardo de cicatrização devido à migração de fibroblastos 1,2 ineficiente. Em animais de tipo selvagem, a migração de fibroblastos em relação uma ferida é desencadeada pelo aparecimento de fibronectina que fugas a partir de capilares danificado e é depositado por macrófagos em tecido lesionado. Portanto, há grande interesse em descobrir estratégias que aumentam a fibronectina dependentes de sinalização e poderia acelerar processos de reparação. Os componentes integrina mediadas e sindecam-4-mediada de fibronectina dependentes de sinalização podem ser separados por células estimulantes com fragmentos fibronectina recombinantes. Embora acoplamento integrina é essencial para a adesão celular, certos fibronectina dependentes de sinais são regulados por sindecam-4. Sindecam-4 activa o sinal Rac1 protrusiva 3, faz com que a integrina redistribuição 1, os gatilhos recrutamento de moléculas do citoesqueleto, tais como vinculina, para focaladerências 4, induzindo assim a migração direcional 3. Nós olhamos para estratégias alternativas para a ativação de tais sinais e descobriu que de baixa intensidade ultra-som pulsado (LIPUS) podem imitar os efeitos da sindecam-4 engajamento 5. Neste protocolo, descrevemos o método através do qual 30 mW / cm 2, 1,5 ultra-som MHz, pulsado a 1 kHz (Fig. 1) pode ser aplicado a fibroblastos em cultura (Fig. 2) para induzir activação Rac1 e formação de adesão focal. A estimulação de ultra-som é aplicada a um máximo de 20 minutos, como esta combinação de parâmetros, foi encontrada a ser mais eficaz para a aceleração da reparação de fracturas clínica 6. O método utiliza fragmentos recombinantes de fibronectina para envolver α β 5 1-integrina, sem envolvimento do sindecam-4, e requer a inibição da síntese de proteínas por cicloheximida para bloquear deposição de matriz adicional pelos fibroblastos., O efeito positivo of ultra-som sobre os mecanismos de reparo é bem documentada 7,8, e compreendendo o efeito molecular do ultra-som na cultura que deve ser capaz de refinar a técnica terapêutica para melhorar os resultados clínicos.

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Induction of Adhesion-dependent Signals Using Low-intensity Ultrasound

Este protocolo descreve a estimulação da cultura de fibroblastos de baixa intensidade, com ultra-sons pulsada, que impulsiona a formação de adesão focal e Rac1 activação imitando acoplamento do receptor de matriz transmembranar, sindecam-4. Esta abordagem permite a investigação de uma técnica de sucesso clínico no nível celular, proporcionando assim as oportunidades de refinamento da terapia.

Indução de Sinais de adesão dependentes Usando ultra-som de baixa intensidade

In multicellular organisms, cell behavior is dictated by interactions with the extracellular matrix. Consequences of matrix-engagement range from ...

induction-of-adhesion-dependent-signals-using-low-intensity-ultrasound

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.4K visualizações.  University of Bristol. Este protocolo descreve a estimulação da cultura de fibroblastos de baixa intensidade, com ultra-sons pulsada, que impulsiona a formação de adesão focal e Rac1 activação imitando acoplamento do receptor de matriz transmembranar, sindecam-4. Esta abordagem permite a investigação de uma técnica de sucesso clínico no nível celular, proporcionando assim as oportunidades de refinamento da terapia.

Vídeo: Induction of Adhesion-dependent Signals Using Low-intensity Ultrasound

Contrast Ultrasound Targeted Treatment of Gliomas in Mice via Drug-Bearing Nanoparticle Delivery and Microvascular Ablation

We are developing minimally-invasive contrast agent microbubble based therapeutic approaches in which the permeabilization and/or ablation of the microvasculature are controlled by varying ultrasound pulsing parameters.  Specifically, we are testing whether such approaches may be used to treat malignant brain tumors through drug delivery and microvascular ablation.  Preliminary studies have been performed to determine whether targeted drug-bearing nanoparticle delivery can be facilitated by the ultrasound mediated destruction of "composite" delivery agents comprised of 100nm poly(lactide-co-glycolide) (PLAGA) nanoparticles that are adhered to albumin shelled microbubbles. We denote these agents as microbubble-nanoparticle composite agents (MNCAs). When targeted to subcutaneous C6 gliomas with ultrasound, we observed an immediate 4.6-fold increase in nanoparticle delivery in MNCA treated tumors over tumors treated with microbubbles co-administered with nanoparticles and a 8.5 fold increase over non-treated tumors. Furthermore, in many cancer applications, we believe it may be desirable to perform targeted drug delivery in conjunction with ablation of the tumor microcirculation, which will lead to tumor hypoxia and apoptosis. To this end, we have tested the efficacy of non-theramal cavitation-induced microvascular ablation, showing that this approach elicits tumor perfusion reduction, apoptosis, significant growth inhibition, and necrosis. Taken together, these results indicate that our ultrasound-targeted approach has the potential to increase therapeutic efficiency by creating tumor necrosis through microvascular ablation and/or simultaneously enhancing the drug payload in gliomas.

Insonation of microbubbles is a promising strategy for tumor ablation at reduced time-averaged acoustic powers, as well as for the targeted delivery of therapeutics. The purpose of the present study is to develop low duty cycle ultrasound pulsing strategies and nanocarriers to maximize non-thermal microvascular ablation and payload delivery to subcutaneous C6 gliomas.

O ultra-som contraste Targeted Tratamento de Gliomas em camundongos através de Drogas Levando-entrega de nanopartículas e Ablação Microvascular

We are developing minimally-invasive contrast agent microbubble based therapeutic approaches in which the permeabilization and/or ablation of the ...

Bioengenharia

Introduction to the Ultrasound Targeted Microbubble Destruction Technique

In UTMD, bioactive molecules, such as negatively charged plasmid DNA vectors encoding a gene of interest, are added to the cationic shells of lipid microbubble contrast agents7-9. In mice these vector-carrying microbubbles can be administered intravenously or directly to the left ventricle of the heart. In larger animals they can also be infused through an intracoronary catheter. The subsequent delivery from the circulation to a target organ occurs by acoustic cavitation at a resonant frequency of the microbubbles. It seems likely that the mechanical energy generated by the microbubble destruction results in transient pore formation in or between the endothelial cells of the microvasculature of the targeted region10. As a result of this sonoporation effect, the transfection efficiency into and across the endothelial cells is enhanced, and transgene-encoding vectors are deposited into the surrounding tissue. Plasmid DNA remaining in the circulation is rapidly degraded by nucleases in the blood, which further reduces the likelihood of delivery to non-sonicated tissues and leads to highly specific target-organ transfection.

Ultrasound Targeted Microbubble Destruction (UTMD) can be used to direct site-specific delivery of bioactive molecules, including therapeutic genes, to target organs accessible to ultrasound, such as the heart and liver1-6.

Introdução à Técnica Destruição Ultrasound Targeted microbolhas

In UTMD, bioactive molecules, such as negatively charged plasmid DNA vectors encoding a gene of interest, are added to the cationic shells of lipid ...

Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic imaging. In medical applications, one of the major limitations of optical sensing technology is its susceptibility to environmental conditions, e.g. changes in pressure and temperature, which may saturate the detection. Additionally, the clinical environment often imposes stringent limits on the size and robustness of the sensor. In this work, the combination of pulse interferometry and fiber-based optical sensing is demonstrated for ultrasound detection. Pulse interferometry enables robust performance of the readout system in the presence of rapid variations in the environmental conditions, whereas the use of all-fiber technology leads to a mechanically flexible sensing element compatible with highly demanding medical applications such as intravascular imaging. In order to achieve a short sensor length, a pi-phase-shifted fiber Bragg grating is used, which acts as a resonator trapping light over an effective length of 350 &#181;m. To enable high bandwidth, the sensor is used for sideway detection of ultrasound, which is highly beneficial in circumferential imaging geometries such as intravascular imaging. An optoacoustic imaging setup is used to determine the response of the sensor for acoustic point sources at different positions.

Optical detection of ultrasound is impractical in many imaging scenarios because it often requires stable environmental conditions. We demonstrate an optical technique for ultrasound sensing in volatile environments with miniaturization and sensitivity levels appropriate for optoacoustic imaging in restrictive scenarios, e.g. intravascular applications.

Wideband Detector óptico de ultra-som para aplicações Medical Imaging

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An oscillatory motion is generated at the focus of a 93-element and 4.5 MHz center frequency HIFU transducer by applying a 25 Hz amplitude-modulated signal using a function generator. A 64-element and 2.5 MHz imaging transducer with 68kPa peak pressure is confocally placed at the center of the HIFU transducer to acquire the radio-frequency (RF) channel data. In this protocol, real-time monitoring of thermal ablation using HIFU with an acoustic power of 7 W on canine livers in vitro is described. HIFU treatment is applied on the tissue during 2 min and the ablated region is imaged in real-time using diverging or plane wave imaging up to 1,000 frames/second. The matrix of RF channel data is multiplied by a sparse matrix for image reconstruction. The reconstructed field of view is of 90&#176; for diverging wave and 20 mm for plane wave imaging and the data are sampled at 80 MHz. The reconstruction is performed on a Graphical Processing Unit (GPU) in order to image in real-time at a 4.5 display frame rate. 1-D normalized cross-correlation of the reconstructed RF data is used to estimate axial displacements in the focal region. The magnitude of the peak-to-peak displacement at the focal depth decreases during the thermal ablation which denotes stiffening of the tissue due to the formation of a lesion. The displacement signal-to-noise ratio (SNRd) at the focal area for plane wave was 1.4 times higher than for diverging wave showing that plane wave imaging appears to produce better displacement maps quality for HMIFU than diverging wave imaging.

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound HIFU Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound HMIFU

This article describes real-time monitoring of HIFU ablation in canine liver with high frame rate ultrasound imaging using diverging and plane wave imaging. Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound is used to image the decrease of acoustic radiation force induced displacement in the ablated region.

Monitoramento em tempo real de High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) Ablação de<em&gt; In Vitro</em&gt; Canine Fígados Usando Movimento Harmônico Imaging para ultra-som focalizado (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An ...

Transmission of Multiple Signals through an Optical Fiber Using Wavefront Shaping

The transmission of multiple independent optical signals through a multimode fiber is accomplished using wavefront shaping in order to compensate for the light distortion during the propagation within the fiber. Our methodology is based on digital optical phase conjugation employing only a single spatial light modulator, where the optical wavefront is individually modulated at different regions of the modulator, one region per light signal. Digital optical phase conjugation approaches are considered to be faster than other wavefront shaping approaches, where (for example) a complete determination of the wave propagation behavior of the fiber is performed. In contrast, the presented approach is time-efficient since it only requires one calibration per light signal. The proposed method is potentially appropriate for spatial division multiplexing in communications engineering. Further application fields are endoscopic light delivery in biophotonics, especially in optogenetics, where single cells in biological tissue have to be selectively illuminated with high spatial and temporal resolution.

We demonstrate the transmission of multiple independent signals through a multimode fiber using wavefront shaping employing a single spatial light modulator. By modulating the wavefront for each signal individually, spatially separated foci are transmitted. Potential applications are multiplexed data transfer in communications engineering and endoscopic light delivery in biophotonics.

Transmissão de múltiplos sinais através de uma fibra óptica Usando Wavefront Shaping

The transmission of multiple independent optical signals through a multimode fiber is accomplished using wavefront shaping in order to compensate for the ...

Manufacturing Abdominal Aorta Hydrogel Tissue-Mimicking Phantoms for Ultrasound Elastography Validation

Ultrasound (US) elastography, or elasticity imaging, is an adjunct imaging technique that utilizes sequential US images of soft tissues to measure the tissue motion and infer or quantify the underlying biomechanical characteristics. For abdominal aortic aneurysms (AAA), biomechanical properties such as changes in the tissue's elastic modulus and estimates of the tissue stress may be essential for assessing the need for the surgical intervention. Abdominal aortic aneurysms US elastography could be a useful tool to monitor AAA progression and identify changes in biomechanical properties characteristic of high-risk patients.
A preliminary goal in the development of an AAA US elastography technique is the validation of the method using a physically relevant model with known material properties. Here we present a process for the production of AAA tissue-mimicking phantoms with physically relevant geometries and spatially modulated material properties. These tissue phantoms aim to mimic the US properties, material modulus, and geometry of the abdominal aortic aneurysms. Tissue phantoms are made using a polyvinyl alcohol cryogel (PVA-c) and molded using 3D printed parts created using computer aided design (CAD) software. The modulus of the phantoms is controlled by altering the concentration of PVA-c and by changing the number of freeze-thaw cycles used to polymerize the cryogel. The AAA phantoms are connected to a hemodynamic pump, designed to deform the phantoms with the physiologic cyclic pressure and flows. Ultra sound image sequences of the deforming phantoms allowed for the spatial calculation of the pressure normalized strain and the identification of mechanical properties of the vessel wall. Representative results of the pressure normalized strain are presented.

Here we describe a method to manufacture aneurysmal, aortic tissue-mimicking phantoms for the use in testing ultrasound elastography. The combined use of computer-aided design (CAD) and 3-dimensional (3D) printing techniques produce aortic phantoms with predictable, complex geometries to validate the elastographic imaging algorithms with controlled experiments.

Fabricação de Aorta Abdominal hidrogel tecido-imitando Phantoms por ultra-som Elastography validação

Ultrasound (US) elastography, or elasticity imaging, is an adjunct imaging technique that utilizes sequential US images of soft tissues to measure the ...

Functional Transcranial Doppler Ultrasound for Monitoring Cerebral Blood Flow

Functional transcranial Doppler ultrasound (fTCD) is the use of transcranial Doppler ultrasound (TCD) to study neural activation occurring during stimuli such as physical movement, activation of tactile sensors in the skin, and viewing images. Neural activation is inferred from an increase in the cerebral blood flow velocity (CBFV) supplying the region of the brain involved in processing sensory input. For example, viewing bright light causes increased neural activity in the occipital lobe of the cerebral cortex, leading to increased blood flow in the posterior cerebral artery, which supplies the occipital lobe. In fTCD, changes in CBFV are used to estimate changes in cerebral blood flow (CBF).
With its high temporal resolution measurement of blood flow velocities in the major cerebral arteries, fTCD complements other established functional imaging techniques. The goal of this Methods paper is to give step-by-step instructions for using fTCD to perform a functional imaging experiment. First, the basic steps for identifying the middle cerebral artery (MCA) and optimizing the signal will be described. Next, placement of a fixation device for holding the TCD probe in place during the experiment will be described. Finally, the breath-holding experiment, which is a specific example of a functional imaging experiment using fTCD, will be demonstrated.

Functional transcranial Doppler ultrasound complements other functional imaging modalities, with its high temporal resolution measurement of stimulus-induced changes in cerebral blood flow within the basal cerebral arteries. This Methods paper gives step-by-step instructions for using functional transcranial Doppler ultrasound to perform a functional imaging experiment.&#160;

Ultrassom doppler transcranial funcional para monitoramento do fluxo sanguíneo cerebral

Functional transcranial Doppler ultrasound (fTCD) is the use of transcranial Doppler ultrasound (TCD) to study neural activation occurring during stimuli ...

Contrast-Enhanced Subharmonic Aided Pressure Estimation (SHAPE) Using Ultrasound Imaging with a Focus on Identifying Portal Hypertension

Noninvasive, accurate measurement of pressures within the human body has long been an important but elusive clinical goal. Contrast agents for ultrasound imaging are gas-filled, encapsulated microbubbles (diameter &#60; 10 &#956;m) that traverse the entire vasculature and enhance signals by up to 30 dB. These microbubbles also produce nonlinear oscillations at frequencies ranging from the subharmonic (half of the transmit frequency) to higher harmonics. The subharmonic amplitude has an inverse linear relationship with the ambient hydrostatic pressure. Here an ultrasound system capable of performing real-time, subharmonic aided pressure estimation (SHAPE) is presented. During ultrasound contrast agent infusion, an algorithm for optimizing acoustic outputs is activated. Following this calibration, subharmonic microbubble signals (i.e., SHAPE) have the highest sensitivity to pressure changes and can be used to noninvasively quantify pressure. The utility of the SHAPE procedure for identifying portal hypertension in the liver is the emphasis here, but the technique has applicability across many clinical scenarios.

Contrast-Enhanced Subharmonic Aided Pressure Estimation SHAPE Using Ultrasound Imaging with a Focus on Identifying Portal Hypertension

A protocol for noninvasively estimating ambient pressures utilizing subharmonic ultrasound imaging of infused contrast microbubbles (following appropriate calibration) is described with examples from human patients with chronic liver disease.

Estimativa de Pressão Auxiliada Subharmônica com Contraste (SHAPE) Usando Imagem Ultrassonográfica com Foco na Identificação de Hipertensão Portal

Noninvasive, accurate measurement of pressures within the human body has long been an important but elusive clinical goal. Contrast agents for ultrasound ...

Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release

Microbubble contrast agents hold great promise for drug delivery applications with ultrasound. Encapsulating drugs in nanoparticles reduces systemic toxicity and increases circulation time of the drugs. In a novel approach to microbubble-assisted drug delivery, nanoparticles are incorporated in or on microbubble shells, enabling local and triggered release of the nanoparticle payload with ultrasound. A thorough understanding of the release mechanisms within the vast ultrasound parameter space is crucial for efficient and controlled release. This set of presented protocols is applicable to microbubbles with a shell containing a fluorescent label. Here, the focus is on microbubbles loaded with poly(2-ethyl-butyl cyanoacrylate) polymeric nanoparticles, doped with a modified Nile Red dye. The particles are fixed within a denatured casein shell. The microbubbles are produced by vigorous stirring, forming a dispersion of perfluoropropane gas in the liquid phase containing casein and nanoparticles, after which the microbubble shell self-assembles. A variety of microscopy techniques are needed to characterize the nanoparticle-stabilized microbubbles at all relevant timescales of the nanoparticle release process. Fluorescence of the nanoparticles enables confocal imaging of single microbubbles, revealing the particle distribution within the shell. In vitro ultra-high-speed imaging using bright-field microscopy at 10 million frames per second provides insight into the bubble dynamics in response to ultrasound insonation. Finally, nanoparticle release from the bubble shell is best visualized by means of fluorescence microscopy, performed at 500,000 frames per second. To characterize drug delivery in vivo, the triggered release of nanoparticles within the vasculature and their extravasation beyond the endothelial layer is studied using intravital microscopy in tumors implanted in dorsal skinfold window chambers, over a timescale of several minutes. The combination of these complementary characterization techniques provides unique insight into the behavior of microbubbles and their payload release at a range of time and length scales, both in vitro and in vivo.

The presented protocols can be used to characterize the response of fluorescently-labeled microbubbles designed for ultrasound-triggered drug delivery applications, including their activation mechanisms as well as their bioeffects. This paper covers a range of in vitro and in vivo microscopy techniques performed to capture the relevant length and timescales.

Métodos de microscopia em escala de tempo para a caracterização de microbolhas fluorescentes para liberação de medicamentos acionados por ultrassom

Microbubble contrast agents hold great promise for drug delivery applications with ultrasound. Encapsulating drugs in nanoparticles reduces systemic ...

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. These include the limited number of cadaveric pancreas donors and the long-term use of immunosuppressants. Mesenchymal stem cells (MSCs) have been considered to be a potential candidate as an alternative source of islet-like cell generation. Our previous reports have successfully illustrated the establishment of induction protocols for differentiating human dental pulp stem cells (hDPSCs) to insulin-producing cells (IPCs). However, the induction efficiency varied greatly. In this paper, we demonstrate the comparison of hDPSCs pancreatic induction efficiency via integrative (microenvironmental and genetic manipulation) and non-integrative (microenvironmental manipulation) induction protocols for delivering hDPSC-derived IPCs (hDPSC-IPCs). The results suggest distinct induction efficiency for both the induction approaches in terms of 3-dimensional colony structure, yield, pancreatic mRNA markers, and functional property upon multi-dosage glucose challenge. These findings will support the future establishment of a clinically applicable IPCs and pancreatic lineage production platform.

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

This protocol presents a comparison between two different induction protocols for differentiating human dental pulp stem cells (hDPSCs) toward pancreatic lineages in vitro: the integrative protocol and the non-integrative protocol. The integrative protocol generates more insulin producing cells (IPCs).

In vitro Indução de células-tronco de polpa dentária humanas em direção a linhagens pancreáticas

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. ...