Ce travail a été soutenu par le Wellcome Trust 088419 subvention pour MDB et le parrainage par Smith &amp; Nephew UK Ltd

1. Surfaces de revêtement avec un ligand Matrice <ol><li> L&#39;échographie sera appliquée à des cellules dans 3,5 cm de puits, soit que des plats individuels ou en tant que plaque à 6 puits. Pour les dosages biochimiques, manteau ligand directement sur le plastique. Pour immunofluorescence, le verre ébullition Lamelles trois fois dans de l&#39;eau MilliQ et le lieu 4 lamelles dans le fond de chaque puits. </li><li> Les surfaces vitrées doivent être transformés en dérivés pour assurer revêtement ligand efficace. Dissoudre sulfo-m-maléimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester dans du PBS à 1 mM. Ajouter 2 ml à chaque puits et incuber pendant 30 minutes à température ambiante. </li><li> Laver les surfaces dérivés 3 fois avec du PBS. </li><li> Manteau soit verre ou en plastique non traité dérivé avec un ligand d&#39;intégrine. Appliquer 2 ml de 10 ug / ml intégrine ligand9, dissous dans du PBS contenant du Ca 2 + et Mg 2 + dans chaque puits et incuber une nuit à 4 ° C. </li><li> Préparer monoparticulate BSA par chauffage BSA 1%, dissous dans du PBS, à 85 ° C pendant 13 minutes. Permettrepour refroidir, puis passer à travers un filtre de 0,45 um. </li><li> Laver ligand surfaces revêtues de 3 fois avec du PBS et le bloc avec le BSA monoparticulate pendant 30 minutes. </li></ol> 2. Préparation des cellules <ol><li> Pour contrôler l&#39;environnement matriciel tout au long de l&#39;expérience, la synthèse des protéines doit être bloquée par addition de 25 pg / ml de cycloheximide à 80% des fibroblastes confluentes pendant 2 heures. </li><li> Rincer cycloheximide cellules traitées avec du PBS et se détacher de la fiole de culture en utilisant 0,5 mg / ml de trypsine / EDTA. </li><li> Cellules individuelles de récolte par centrifugation à 500 xg pendant 5 minutes. </li><li> Resuspendre les cellules dans DMEM/25 HEPES, 25 pg / ml de cycloheximide. </li><li> Compter densité de cellules de la suspension en utilisant un hémocytomètre et diluer à 105 ml-1. </li><li> Incuber les cellules à 37 ° C pendant 20 minutes pour récupérer l&#39;intégrine surface. </li><li> Rincer les ligand-couché, BSA-bloqués puits 3 fois avec du PBS. </li><li> Graine 2 ml de la suspension cellulaire dans chaque puits. </li><li> Allow cellules de se propager pendant 2 heures à 37 ° C, 5% de CO 2. </li></ol> 3. Stimulation ultrasons <ol><li> Réchauffez le tableau émetteur d&#39;ultrasons et de gel de couplage à 37 ° C. </li><li> Appliquer une goutte taille d&#39;un pois de gel de couplage à chaque émetteur. </li><li> Tester ce que chaque émetteur est fonctionnel en utilisant un détecteur à diode ultrasons indicateur. </li><li> Placez les puits sur le réseau d&#39;émetteurs. Retourne un tableau à 37 ° C, température de 5% de CO 2 et laisser s&#39;équilibrer pendant 10 minutes. </li><li> Allumez le signal ultrasonore. </li><li> Le signal ultrasonore se désactive après 20 minutes, imitant le régime thérapeutique. Si les temps de stimulation plus courts sont nécessaires, les plaques doivent être supprimés du tableau à l&#39;endroit approprié en temps des points. Dans tous les cas utiliser des plaques non stimulées comme contrôle négatif. </li></ol> 4. Analyse Focal Adhesion par immunofluorescence <ol><li> Pour une analyse de la formation d&#39;adhésion focale, appliquer le signal ultrasonore de 20 minuteset puis permettre aux structures de développer pendant 40 minutes supplémentaires par le maintien des cellules à 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Aspirer des médias et réparer les cellules en appliquant 2 ml de paraformaldéhyde 4% dans du PBS. Incuber pendant 14 minutes à température ambiante. </li><li> Aspirer le paraformaldéhyde et rincer trois fois avec du PBS, l&#39;application de la PBS doucement vers le bas le bord du puits pour éviter la production de forces de cisaillement. </li><li> Transférer chaque lamelle de 3,5 cm des puits dans une plaque à 24 puits pour immunofluorescence ultérieure. </li><li> Étancher paraformaldéhyde résiduelle par application de 0,5 ml à 0,1 M de glycine dans du PBS à chacun des 24 puits. Incuber pendant 20 minutes à température ambiante. </li><li> Aspirer la glycine et rincer trois fois avec du PBS. </li><li> Perméabiliser les cellules par application de 0,5 ml à 0,5% de Triton X-100 (p / v) dans du PBS. Incuber pendant 4 minutes à température ambiante. </li><li> Aspirer Triton X-100 et rincer trois fois avec du PBS. </li><li> Bloquer par application de 0,5 ml 3% (p / v) de BSA dans du PBS. Incuber une nuit à 4 &amp; dpar exemple; C. </li><li> Colorer vinculine contenant adhésion focale avec hVIN-1 anticorps dilué 1:400 dans le bloc de BSA. Incuber pendant une heure à température ambiante. </li><li> Rincer trois fois avec du PBS. </li><li> Appliquer fluorophore (DyLight 488) conjugué anticorps secondaire (dilué 1:200) et l&#39;actine tache avec TRITC-conjugué phalloïdine (dilué 1:200) dans le bloc de BSA. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante. </li><li> Rincer trois fois avec du PBS, et une fois avec de l&#39;eau. </li><li> Monter sur une lame de verre dans une position inversée à l&#39;aide Prolongez milieu de montage d&#39;or. </li></ol> 5. Quantification de Rac1 Activation par pull-down test <ol><li> Pour l&#39;analyse de Rac1 activation, appliquez le signal ultrasonore de 20 minutes pour les cellules à 37 ° C, 5% de CO 2. Lors de l&#39;évaluation des temps de réponse de plus de 20 minutes, appliquer le signal à ultrasons pour 20 minutes et maintenir les cellules à 37 ° C, 5% de CO 2 pour le temps restant pour permettre à la réponse à se développer. </li><li> Aspirer les médias et le lieu ainsis sur la glace. Rincer les puits avec 2 ml de PBS froid et d&#39;aspiration. Assurez-vous tout résidu PBS est éliminé en laissant les puits inclinés pendant 1 minute puis par aspiration approfondie. </li><li> Lyse des cellules sur la glace avec 35 ul de tampon de lyse (10% de glycérol, 20 mM HEPES pH 7,4, 140 mM NaCl, 1% NP40, désoxycholate de sodium 0,5%, 4 mM EGTA, 4 mM EDTA, 1 × inhibiteur de la protéase complète) par puits. Dans cet exemple, 6 puits sont utilisés par point de temps pour générer ul 210 du lysat cellulaire. Puits plus ou moins peut être utilisé mais le volume total de lysat devraient totaliser ~ 200 pi. </li><li> Gratter les cellules à fond avec grattoir à cellules pour assurer la lyse cellulaire complète et laisser les puits incliné pendant 1 minute pour permettre lysat à la piscine. </li><li> Transfert à un lysat glacée de 1,5 ml microtube (mise en commun de lysats régime de traitement même) et de spin au 21000 × g pendant 2 minutes à 4 ° C pour obtenir un culot cellulaire de débris. </li><li> Transfert 180 ul de lysat pour glacée de 1,5 ml microtubes contenant 130 ul de tampon de lyse et 25 pi PAK-glutathione billes d&#39;agarose 10. Gardez en restant lysat brut à -20 ° C pour la séparation de gel ultérieur. </li><li> Capturez Rac1 actif sur les billes d&#39;agarose PAK-glutathion par la rotation des tubes pendant 40 minutes à 4 ° C. </li><li> Récolte d&#39;agarose cordon conjugue par centrifugation à 2000 xg pendant 1 minute à 4 ° C. </li><li> Lavage bourrelet conjugués trois fois avec un tampon de lyse 500 pi, la récolte des perles par centrifugation à 2000 x g et rejeter le surnageant, après chaque lavage. Retirez soigneusement le tampon de lyse restante de lavage avec une pipette 200 pi. </li><li> Éluer chaque échantillon en ajoutant 35 pi de tampon de chargement SDS-PAGE et incuber à 85 ° C sur un bloc de chauffage sous agitation pendant 5 minutes. Retirer billes par centrifugation à 21000 xg pendant 1 minute. </li><li> Résoudre éluat talon par SDS-PAGE, transfert à la nitrocellulose et de la sonde pour Rac1. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Dans ce protocole, nous décrivons l&#39;induction de la vinculine-tacheed adhésions focales et Rac1 activité par l&#39;échographie. Pour l&#39;expérience d&#39;adhésion focale, la position de référence est que les fibroblastes, réparties sur un ligand de α 5 β 1-intégrine ne forment pas vinculine contenant adhérences (fig. 3A) à moins qu&#39;une seconde récepteur de fibronectine, syndécane-4, est engagé par addition d&#39; ligand soluble (Fig. 3B) 3,4. Toutefois, la stimulation avec des ultrasons induit la formation d&#39;adhésion focale dans la même mesure que l&#39;engagement de syndécane-4 (Fig. 3C), indiquant que la stimulation par ultrasons peut se substituer à certains composants de la voie de signalisation dépendante de la fibronectine 5. Le principal obstacle à ce protocole est d&#39;éliminer la formation d&#39;adhésion focale, en l&#39;absence de stimulant. L&#39;inhibition incomplète de la synthèse protéique par la cycloheximide permettra dépôt de matrice qui est suffisant pour les cellules à l&#39;auto-stimulation. Le surpeuplement des cellules peut aussi conduire à de bas niveau d&#39;adhésion focale formation et une mauvaise réponse à l&#39;échographie que la diaphonie entre la cellule-cellule et cellule-matrice contacts va compliquer une expérience qui est conçu pour isoler un seul stimulus. En tant que développement de l&#39;analyse de base, nous montrons la même expérience, répétée avec des fibroblastes dépourvus de syndécane-4 (Fig. 4). Ces fibroblastes continuent de répondre aux ultrasons (figure 4C), mais ne parviennent pas à répondre à syndécane-4 ligand (Fig. 4B). L&#39;expérience à l&#39;aide SDC4 - / - fibroblastes montre que les ultrasons peuvent en effet contourner la nécessité pour les récepteurs de fibronectine certains, et illustre comment le protocole simple peut être mis au point pour obtenir des informations supplémentaires sur la voie de signalisation. Pour l&#39;expérience biochimique, nous démontrons que les ultrasons peuvent induire l&#39;activation de Rac1, en ​​utilisant un dosage déroulant qui est une adaptation de la méthode décrite par Del Pozo et al. 10. La précipitation des actifs Rac1 0, 10, 30 et 60 minutes après iniciation de la stimulation par ultrasons révèle que les pics d&#39;activité à Rac1 10-30 minutes, avant de revenir à la ligne de base (Fig. 5). Buvard lysats pour vinculine assure un chargement équivalent temps entre les points. Le résultat ressemble à l&#39;activation de Rac1 par l&#39;engagement de syndécane-4 3, mais est légèrement plus longue que l&#39;activation par la fibronectine. Par conséquent 8-10 répétitions sont généralement nécessaires pour obtenir des données significatives. L&#39;activation de Rac1 est responsable de l&#39;engagement des cellules à la formation d&#39;adhésion focale, et naissantes adhésions focales commencent à se former à 10-30 minutes, coïncidant avec Rac1 activation. Une fois lancé, ces adhérences qui continuent à mûrir dans les plaques d&#39;adhérence grandes figures 3 et 4. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig1.jpg" /> Figure 1. La forme d&#39;onde ultrasonore. Ultrasons comprend une intermittente 1,5 MHz signal de qu&#39;en raison de faible amplitude (30 mW / cm &lt;sup&gt; 2, la moyenne spatiale, temporelle moyenne) n&#39;a pas d&#39;effet de chauffage. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig2.jpg" /> Figure 2. Représentation schématique du flux de travail pour la préparation et la stimulation des cellules avec des ultrasons. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig3.jpg" /> Figure 3. Induction échographie de la formation d&#39;adhésion focale dans les fibroblastes. Fibroblastes sont réparties sur le fragment d&#39;intégrine de liaison de la fibronectine (A) avant la stimulation par le fragment syndécane-4-liaison de la fibronectine (B) ou d&#39;ultrasons (C). Après 60 minutes de stimulation, les cellules ont été fixées, colorées pour vinculine et de l&#39;actine, et imagées par épifluorescence. Bar = 10 um. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig4.jpg" /> Figure 4. Induction échographie de la formation d&#39;adhésion focale dans les fibroblastes dépourvus de syndécane-4. <em&gt; SDC4 - / - fibroblastes sont réparties sur le fragment d&#39;intégrine de liaison de la fibronectine (A) avant la stimulation par le fragment syndécane-4-liaison de la fibronectine (B) ou d&#39;ultrasons (C). Après 60 minutes de stimulation, les cellules ont été fixées, colorées pour vinculine et de l&#39;actine, et imagées par épifluorescence. Bien que SDC4 - / - fibroblastes étaient fibronectine insensible à la casse, l&#39;échographie reste induit la formation d&#39;adhésion focale, ce qui indique que l&#39;échographie contourne l&#39;engagement du récepteur de la matrice. Bar = 10 um. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig5.jpg" /> Figure 5. L&#39;activation de Rac1 par ultrasons. Les cellules ont été stimulées pendant quelques minutes de 0, 10, 30 et 60 avec 6 puits utilisés par point dans le temps. Le montant de GTP-Rac1 présents dans les échantillons à partir d&#39;un Rac1 déroulant bien sûr le temps de dosage a été visualisée par incubation avec des anticorps anti-Rac1 anticorps sur un western blot (image du haut). La quantification de l&#39;intensité de la bande (moyenne de 8-10 répétitions) révèle une augmentation de Rac1ctivité résultant de signal ultrasonore à 10 et 30 minutes, avant de revenir aux niveaux de référence à 60 minutes (graphique). Les barres d&#39;erreur représentent sem

<ol>
	<li>Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+syndecan-4+hair+trigger+initiates+wound+healing+through+caveolin-+and+RhoG-regulated+integrin+endocytosis.">A syndecan-4 hair trigger initiates wound healing through caveolin- and RhoG-regulated integrin endocytosis.</a> Dev. Cell. 21, 681-693 (2011).</li><li>Echtermeyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+wound+repair+and+impaired+angiogenesis+in+mice+lacking+syndecan-4.">Delayed wound repair and impaired angiogenesis in mice lacking syndecan-4.</a> J. Clin. Invest. 107, R9-R14 (2001).</li><li>Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syndecan-4-dependent+Rac1+regulation+determines+directional+migration+in+response+to+the+extracellular+matrix.">Syndecan-4-dependent Rac1 regulation determines directional migration in response to the extracellular matrix.</a> J. Cell Biol. 177, 527-538 (2007).</li><li>Woods, A., Couchman, J. R., Johansson, S., Hook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+and+cytoskeletal+organisation+of+fibroblasts+in+response+to+fibronectin+fragments.">Adhesion and cytoskeletal organisation of fibroblasts in response to fibronectin fragments.</a> Embo. J. 5, 665-670 (1986).</li><li>Mahoney, C. M., Morgan, M. R., Harrison, A., Humphries, M. J., Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+ultrasound+bypasses+canonical+syndecan-4+signaling+to+activate+rac1.">Therapeutic ultrasound bypasses canonical syndecan-4 signaling to activate rac1.</a> J. Biol. Chem. 284, 8898-8909 (2009).</li><li>Claes, L., Willie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enhancement+of+bone+regeneration+by+ultrasound.">The enhancement of bone regeneration by ultrasound.</a> Prog. Biophys. Mol. Biol. 93, 384-398 (2007).</li><li>Heckman, J. D., Ryaby, J. P., McCabe, J., Frey, J. J., Kilcoyne, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+tibial+fracture-healing+by+non-invasive,+low-intensity+pulsed+ultrasound.">Acceleration of tibial fracture-healing by non-invasive, low-intensity pulsed ultrasound.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 76, 26-34 (1994).</li><li>Kristiansen, T. K., Ryaby, J. P., McCabe, J., Frey, J. J., Roe, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+healing+of+distal+radial+fractures+with+the+use+of+specific,+low-intensity+ultrasound.+A+multicenter,+prospective,+randomized,+double-blind,+placebo-controlled+study.">Accelerated healing of distal radial fractures with the use of specific, low-intensity ultrasound. A multicenter, prospective, randomized, double-blind, placebo-controlled study.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 79, 961-973 (1997).</li><li>Danen, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+the+synergy+site+for+cell+adhesion+to+fibronectin+depends+on+the+activation+state+of+integrin+alpha+5+beta+1.">Requirement for the synergy site for cell adhesion to fibronectin depends on the activation state of integrin alpha 5 beta 1.</a> J. Biol. Chem. 270, 21612-21618 (1995).</li><li>Del Pozo, M. A., Price, L. S., Alderson, N. B., Ren, X. D., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+to+the+extracellular+matrix+regulates+the+coupling+of+the+small+GTPase+Rac+to+its+effector+PAK.">Adhesion to the extracellular matrix regulates the coupling of the small GTPase Rac to its effector PAK.</a> Embo. J. 19, 2008-2014 (2000).</li><li>Makarem, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competitive+binding+of+vascular+cell+adhesion+molecule-1+and+the+HepII/IIICS+domain+of+fibronectin+to+the+integrin+alpha+4+beta+1.">Competitive binding of vascular cell adhesion molecule-1 and the HepII/IIICS domain of fibronectin to the integrin alpha 4 beta 1.</a> J. Biol. Chem. 269, 4005-4011 (1994).</li></ol>

Andrew Harrison est un employé de Smith &amp; Nephew UK Limited.

Dans ce protocole, nous décrivons la méthode par laquelle un traitement qui est normalement appliqué à des patients humains peut être utilisé dans la cellule à base d&#39;expériences. Le but ultime est de comprendre le mécanisme moléculaire d&#39;action des ultrasons afin que la thérapie peut être affinée. Dans ce protocole, nous utilisons fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) comme un système cellulaire modèle, mais l&#39;échographie a été également été trouvé pour être efficace dans des fibroblastes primaires de prépuce humain 5, les cellules souches mésenchymateuses, les ostéoblastes et les chondrocytes 6. Nous utilisons Rac1 activation comme un test biochimique par exemple, mais la méthode pourrait être utilisée aussi pour tester la réglementation de la phosphorylation de protéines ou la formation de complexes protéiques par immunoprécipitation. Pour l&#39;exemple par immunofluorescence, nous démontrons une échographie effet sur la formation d&#39;adhésion focale, mais la redistribution de toute molécule pourrait être examinée. Par exemple, on peut tester le recrutement de facteurs cytosoliques à la membrane plasmique, colocalisation de proteins dans des vésicules de trafic ou d&#39;examiner l&#39;effet des ultrasons sur l&#39;organisation du fuseau mitotique. Jusqu&#39;à présent, nous avons limité nous de tester la fibronectine voies dépendantes, par l&#39;effet des ultrasons sur les cellules de collagène, ou en présence de facteurs de croissance pourrait être testé afin de dresser un tableau de la façon dont l&#39;échographie affecte le comportement des cellules dans un environnement complexe que plus ressemble à une situation in vivo. Un plus grand défi consistera à tester l&#39;effet des ultrasons à l&#39;aide imagerie time-lapse, où la présence de l&#39;émetteur qui bloque le chemin de lumière et les vibrations des ultrasons supplémentaires présents obstacles techniques. Cependant, le fait que l&#39;application thérapeutique nécessite seulement 20 minutes de stimulation par jour suggère que l&#39;analyse du comportement des cellules après une salve de stimulation pourrait bien être productif.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> sulfo-m-maléimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester </td><td> FisherPerbio </td><td> PN22312 </td><td> 25 titres mM dissous dans l&#39;eau peuvent être stockés à -20 ° C </td></tr><tr><td> 6-même plaque de culture tissulaire </td><td> Corning </td><td> 3516 </td><td> Plastique à partir d&#39;autres sociétés peuvent recouvrir mal </td></tr><tr><td> Lamelle de verre de 13 mm </td><td> Distributeur de fournitures scientifiques de laboratoire Ltd.SLS </td><td> MIC3336 </td><td> En verre à partir d&#39;autres sociétés peuvent recouvrir mal </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Sigma </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, Ca 2 + Mg 2 + </td><td> Sigma </td><td> D8662 </td><td></td></tr><tr><td> 50K intégrine ligand (fragment de fibronectine) </td><td> Construire la description et préparation en 9, 11 </td><td></td><td> Alternative ligands de la matrice peut être utilisé pour interroger d&#39;autres voies </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A3059 </td><td></td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> Sigma </td><td> C7698 </td><td> Peut être stockées sous forme de stock de 10mg/ml dans l&#39;eau </td></tr><tr><td> DMEM/25 HEPES </td><td> Sigma </td><td> D6171 </td><td></td></tr><tr><td> Exogen 4000 + </td><td> Smith &amp; Nephew Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gel de couplage échographie </td><td> Smith &amp; Nephew Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SAFHS indicateur </td><td> Smith &amp; Nephew Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> hVIN-1 </td><td> Sigma </td><td> V9264 </td><td></td></tr><tr><td> DyLight 488-conjugué anti-souris </td><td> Stratech scientifique </td><td> 715-485-150 </td><td></td></tr><tr><td> TRITC marqué phalloïdine &lt;/ Td&gt; <td> Sigma </td><td> P1951 </td><td></td></tr><tr><td> Prolongez réactif antifading Or </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td><td></td></tr><tr><td> inhibiteur de protéase intégral (EDTA) </td><td> Roche </td><td> 056 489 001 </td><td> 100 × boursier composé de comprimé stocké à -20 ° C </td></tr><tr><td> PAK-glutathion billes d&#39;agarose </td><td> Construire la description et la préparation en 10 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glycérol </td><td> Pêcheur </td><td> G/0650/17 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Apollo scientifique </td><td> BI8181 </td><td> Faire de stock 1M et le pH à 7,4 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Pêcheur </td><td> S/0160/65 </td><td></td></tr><tr><td> NP40 </td><td> Sigma </td><td> I3021 </td><td></td></tr><tr><td> Désoxycholate de sodium </td><td> Sigma </td><td> D6750 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> E4378 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td><td></td></tr></tbody></table>

induction of adhesion-dependent signals using low-intensity ultrasound

Dans les organismes multicellulaires, le comportement des cellules est dictée par des interactions avec la matrice extracellulaire. Conséquences de la matrice de l&#39;engagement du large de la réglementation de la migration et la prolifération cellulaire, la sécrétion d&#39;une différenciation et même. Les signaux sous-tendant chacun de ces processus complexes proviennent des interactions moléculaires de la matrice extracellulaire des récepteurs sur la surface de la cellule. Les intégrines sont des récepteurs prototypes et de fournir un lien mécanique entre la matrice extracellulaire et le cytosquelette, ainsi que de lancer certaines de les cascades de signalisation dépendantes de l&#39;adhérence. Cependant, il est de plus en plus évident que d&#39;autres récepteurs transmembranaires fonctionner en parallèle avec les intégrines de réglementer tant l&#39;intégrine elle-même et des signaux en aval. Le plus élégant de ces exemples est le protéoglycane transmembranaire, le syndécane-4, qui coopère avec α β 1-5 au cours de l&#39;intégrine adhérence à la fibronectine. Dans les modèles in vivo demonstrmangé l&#39;importance de syndécan-4 de signalisation, comme syndécane-4-souris déficientes en protéine présentent un retard de guérison due à la migration des fibroblastes 1,2 inefficace. En animaux de type sauvage, la migration des fibroblastes vers une plaie est déclenchée par l&#39;apparition de la fibronectine que les fuites de capillaires endommagés et est déposé par les macrophages dans le tissu lésé. Par conséquent, il ya un grand intérêt à découvrir des stratégies qui améliorent la fibronectine-dépendantes de signalisation et pourrait accélérer le processus de réparation. Les composants de l&#39;intégrine-médiées et syndécane-4-médiée de fibronectine-dépendantes de signalisation peuvent être séparés par des cellules de stimulation avec des fragments de fibronectine recombinant. Bien que l&#39;engagement de l&#39;intégrine est essentielle pour l&#39;adhésion cellulaire, la fibronectine certains signaux dépendants sont réglementés par le syndécane-4. Syndecan-4 active le signal de Rac1 propulsion 3, provoque une redistribution des intégrines 1, déclencheurs de recrutement de molécules du cytosquelette, tels que la vinculine, à focaleadhérences 4, et induit de ce fait 3 la migration directionnelle. Nous avons examiné des stratégies alternatives pour l&#39;activation de ces signaux et a constaté que de faible intensité ultrasons pulsés (LIPUS) peuvent mimer les effets de syndécane-4 l&#39;engagement 5. Dans ce protocole, nous décrivons la méthode par laquelle 30 mW / cm 2, 1,5 échographie MHz, pulsé à 1 kHz (Fig. 1) peut être appliquée à des fibroblastes en culture (Fig. 2) pour induire l&#39;activation de Rac1 et la formation d&#39;adhésion focale. La stimulation ultrasons est appliquée pour une durée maximale de 20 minutes, comme cette combinaison de paramètres a été jugée la plus efficace pour l&#39;accélération de la réparation d&#39;une fracture clinique 6. La méthode utilise des fragments de fibronectine recombinantes à s&#39;engager α 5 β 1-intégrine, sans engagement de syndécane-4, et requiert l&#39;inhibition de la synthèse protéique par la cycloheximide à bloquer le dépôt de matrice supplémentaire par les fibroblastes., L&#39;effet positif oéchographie f sur les mécanismes de réparation est bien documenté 7,8, et par la compréhension de l&#39;effet moléculaire de l&#39;échographie dans la culture que nous devrions être en mesure d&#39;affiner la technique thérapeutique pour améliorer les résultats cliniques.

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Induction of Adhesion-dependent Signals Using Low-intensity Ultrasound

Ce protocole décrit la stimulation des fibroblastes cultivés avec de faible intensité ultrasons pulsés, qui entraîne la formation d&#39;adhésion focale et Rac1 activation en imitant l&#39;engagement du récepteur transmembranaire matrice, le syndécane-4. Cette approche permet d&#39;étudier une technique clinique réussie au niveau cellulaire, offrant ainsi des possibilités de raffinement de la thérapie.

L&#39;induction de signaux d&#39;adhésion dépendant de l&#39;aide ultrasons à faible intensité

In multicellular organisms, cell behavior is dictated by interactions with the extracellular matrix. Consequences of matrix-engagement range from ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.4K vues.  University of Bristol. Ce protocole décrit la stimulation des fibroblastes cultivés avec de faible intensité ultrasons pulsés, qui entraîne la formation d'adhésion focale et Rac1 activation en imitant l'engagement du récepteur transmembranaire matrice, le syndécane-4. Cette approche permet d'étudier une technique clinique réussie au niveau cellulaire, offrant ainsi des possibilités de raffinement de la thérapie.

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Contrast Ultrasound Targeted Treatment of Gliomas in Mice via Drug-Bearing Nanoparticle Delivery and Microvascular Ablation

We are developing minimally-invasive contrast agent microbubble based therapeutic approaches in which the permeabilization and/or ablation of the microvasculature are controlled by varying ultrasound pulsing parameters.  Specifically, we are testing whether such approaches may be used to treat malignant brain tumors through drug delivery and microvascular ablation.  Preliminary studies have been performed to determine whether targeted drug-bearing nanoparticle delivery can be facilitated by the ultrasound mediated destruction of "composite" delivery agents comprised of 100nm poly(lactide-co-glycolide) (PLAGA) nanoparticles that are adhered to albumin shelled microbubbles. We denote these agents as microbubble-nanoparticle composite agents (MNCAs). When targeted to subcutaneous C6 gliomas with ultrasound, we observed an immediate 4.6-fold increase in nanoparticle delivery in MNCA treated tumors over tumors treated with microbubbles co-administered with nanoparticles and a 8.5 fold increase over non-treated tumors. Furthermore, in many cancer applications, we believe it may be desirable to perform targeted drug delivery in conjunction with ablation of the tumor microcirculation, which will lead to tumor hypoxia and apoptosis. To this end, we have tested the efficacy of non-theramal cavitation-induced microvascular ablation, showing that this approach elicits tumor perfusion reduction, apoptosis, significant growth inhibition, and necrosis. Taken together, these results indicate that our ultrasound-targeted approach has the potential to increase therapeutic efficiency by creating tumor necrosis through microvascular ablation and/or simultaneously enhancing the drug payload in gliomas.

Insonation of microbubbles is a promising strategy for tumor ablation at reduced time-averaged acoustic powers, as well as for the targeted delivery of therapeutics. The purpose of the present study is to develop low duty cycle ultrasound pulsing strategies and nanocarriers to maximize non-thermal microvascular ablation and payload delivery to subcutaneous C6 gliomas.

L&#39;échographie de contraste ciblées traitement des gliomes chez la souris via la livraison de drogue nanoparticules-Bearing et l&#39;ablation microvasculaire

We are developing minimally-invasive contrast agent microbubble based therapeutic approaches in which the permeabilization and/or ablation of the ...

Recherche

Bio-ingénierie

Introduction to the Ultrasound Targeted Microbubble Destruction Technique

In UTMD, bioactive molecules, such as negatively charged plasmid DNA vectors encoding a gene of interest, are added to the cationic shells of lipid microbubble contrast agents7-9. In mice these vector-carrying microbubbles can be administered intravenously or directly to the left ventricle of the heart. In larger animals they can also be infused through an intracoronary catheter. The subsequent delivery from the circulation to a target organ occurs by acoustic cavitation at a resonant frequency of the microbubbles. It seems likely that the mechanical energy generated by the microbubble destruction results in transient pore formation in or between the endothelial cells of the microvasculature of the targeted region10. As a result of this sonoporation effect, the transfection efficiency into and across the endothelial cells is enhanced, and transgene-encoding vectors are deposited into the surrounding tissue. Plasmid DNA remaining in the circulation is rapidly degraded by nucleases in the blood, which further reduces the likelihood of delivery to non-sonicated tissues and leads to highly specific target-organ transfection.

Ultrasound Targeted Microbubble Destruction (UTMD) can be used to direct site-specific delivery of bioactive molecules, including therapeutic genes, to target organs accessible to ultrasound, such as the heart and liver1-6.

Introduction à l&#39;échographie destruction des microbulles ciblées Technique

In UTMD, bioactive molecules, such as negatively charged plasmid DNA vectors encoding a gene of interest, are added to the cationic shells of lipid ...

Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic imaging. In medical applications, one of the major limitations of optical sensing technology is its susceptibility to environmental conditions, e.g. changes in pressure and temperature, which may saturate the detection. Additionally, the clinical environment often imposes stringent limits on the size and robustness of the sensor. In this work, the combination of pulse interferometry and fiber-based optical sensing is demonstrated for ultrasound detection. Pulse interferometry enables robust performance of the readout system in the presence of rapid variations in the environmental conditions, whereas the use of all-fiber technology leads to a mechanically flexible sensing element compatible with highly demanding medical applications such as intravascular imaging. In order to achieve a short sensor length, a pi-phase-shifted fiber Bragg grating is used, which acts as a resonator trapping light over an effective length of 350 &#181;m. To enable high bandwidth, the sensor is used for sideway detection of ultrasound, which is highly beneficial in circumferential imaging geometries such as intravascular imaging. An optoacoustic imaging setup is used to determine the response of the sensor for acoustic point sources at different positions.

Optical detection of ultrasound is impractical in many imaging scenarios because it often requires stable environmental conditions. We demonstrate an optical technique for ultrasound sensing in volatile environments with miniaturization and sensitivity levels appropriate for optoacoustic imaging in restrictive scenarios, e.g. intravascular applications.

Wideband détecteur optique des ultrasons pour les applications d&#39;imagerie médicale

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An oscillatory motion is generated at the focus of a 93-element and 4.5 MHz center frequency HIFU transducer by applying a 25 Hz amplitude-modulated signal using a function generator. A 64-element and 2.5 MHz imaging transducer with 68kPa peak pressure is confocally placed at the center of the HIFU transducer to acquire the radio-frequency (RF) channel data. In this protocol, real-time monitoring of thermal ablation using HIFU with an acoustic power of 7 W on canine livers in vitro is described. HIFU treatment is applied on the tissue during 2 min and the ablated region is imaged in real-time using diverging or plane wave imaging up to 1,000 frames/second. The matrix of RF channel data is multiplied by a sparse matrix for image reconstruction. The reconstructed field of view is of 90&#176; for diverging wave and 20 mm for plane wave imaging and the data are sampled at 80 MHz. The reconstruction is performed on a Graphical Processing Unit (GPU) in order to image in real-time at a 4.5 display frame rate. 1-D normalized cross-correlation of the reconstructed RF data is used to estimate axial displacements in the focal region. The magnitude of the peak-to-peak displacement at the focal depth decreases during the thermal ablation which denotes stiffening of the tissue due to the formation of a lesion. The displacement signal-to-noise ratio (SNRd) at the focal area for plane wave was 1.4 times higher than for diverging wave showing that plane wave imaging appears to produce better displacement maps quality for HMIFU than diverging wave imaging.

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound HIFU Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound HMIFU

This article describes real-time monitoring of HIFU ablation in canine liver with high frame rate ultrasound imaging using diverging and plane wave imaging. Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound is used to image the decrease of acoustic radiation force induced displacement in the ablated region.

Suivi en temps réel de haute intensité ultrasons focalisés (HIFU) Ablation de<em&gt; In Vitro</em&gt; Canine Livers Utilisation mouvement harmonique Imaging pour ultrasons focalisés (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An ...

Transmission of Multiple Signals through an Optical Fiber Using Wavefront Shaping

The transmission of multiple independent optical signals through a multimode fiber is accomplished using wavefront shaping in order to compensate for the light distortion during the propagation within the fiber. Our methodology is based on digital optical phase conjugation employing only a single spatial light modulator, where the optical wavefront is individually modulated at different regions of the modulator, one region per light signal. Digital optical phase conjugation approaches are considered to be faster than other wavefront shaping approaches, where (for example) a complete determination of the wave propagation behavior of the fiber is performed. In contrast, the presented approach is time-efficient since it only requires one calibration per light signal. The proposed method is potentially appropriate for spatial division multiplexing in communications engineering. Further application fields are endoscopic light delivery in biophotonics, especially in optogenetics, where single cells in biological tissue have to be selectively illuminated with high spatial and temporal resolution.

We demonstrate the transmission of multiple independent signals through a multimode fiber using wavefront shaping employing a single spatial light modulator. By modulating the wavefront for each signal individually, spatially separated foci are transmitted. Potential applications are multiplexed data transfer in communications engineering and endoscopic light delivery in biophotonics.

Transmission des signaux multiples à travers une fibre optique utilisant Wavefront Shaping

The transmission of multiple independent optical signals through a multimode fiber is accomplished using wavefront shaping in order to compensate for the ...

Manufacturing Abdominal Aorta Hydrogel Tissue-Mimicking Phantoms for Ultrasound Elastography Validation

Ultrasound (US) elastography, or elasticity imaging, is an adjunct imaging technique that utilizes sequential US images of soft tissues to measure the tissue motion and infer or quantify the underlying biomechanical characteristics. For abdominal aortic aneurysms (AAA), biomechanical properties such as changes in the tissue's elastic modulus and estimates of the tissue stress may be essential for assessing the need for the surgical intervention. Abdominal aortic aneurysms US elastography could be a useful tool to monitor AAA progression and identify changes in biomechanical properties characteristic of high-risk patients.
A preliminary goal in the development of an AAA US elastography technique is the validation of the method using a physically relevant model with known material properties. Here we present a process for the production of AAA tissue-mimicking phantoms with physically relevant geometries and spatially modulated material properties. These tissue phantoms aim to mimic the US properties, material modulus, and geometry of the abdominal aortic aneurysms. Tissue phantoms are made using a polyvinyl alcohol cryogel (PVA-c) and molded using 3D printed parts created using computer aided design (CAD) software. The modulus of the phantoms is controlled by altering the concentration of PVA-c and by changing the number of freeze-thaw cycles used to polymerize the cryogel. The AAA phantoms are connected to a hemodynamic pump, designed to deform the phantoms with the physiologic cyclic pressure and flows. Ultra sound image sequences of the deforming phantoms allowed for the spatial calculation of the pressure normalized strain and the identification of mechanical properties of the vessel wall. Representative results of the pressure normalized strain are presented.

Here we describe a method to manufacture aneurysmal, aortic tissue-mimicking phantoms for the use in testing ultrasound elastography. The combined use of computer-aided design (CAD) and 3-dimensional (3D) printing techniques produce aortic phantoms with predictable, complex geometries to validate the elastographic imaging algorithms with controlled experiments.

Aorte abdominale Hydrogel imitant le tissu de fabrication fantômes pour Validation élastographie par ultrasons

Ultrasound (US) elastography, or elasticity imaging, is an adjunct imaging technique that utilizes sequential US images of soft tissues to measure the ...

Functional Transcranial Doppler Ultrasound for Monitoring Cerebral Blood Flow

Functional transcranial Doppler ultrasound (fTCD) is the use of transcranial Doppler ultrasound (TCD) to study neural activation occurring during stimuli such as physical movement, activation of tactile sensors in the skin, and viewing images. Neural activation is inferred from an increase in the cerebral blood flow velocity (CBFV) supplying the region of the brain involved in processing sensory input. For example, viewing bright light causes increased neural activity in the occipital lobe of the cerebral cortex, leading to increased blood flow in the posterior cerebral artery, which supplies the occipital lobe. In fTCD, changes in CBFV are used to estimate changes in cerebral blood flow (CBF).
With its high temporal resolution measurement of blood flow velocities in the major cerebral arteries, fTCD complements other established functional imaging techniques. The goal of this Methods paper is to give step-by-step instructions for using fTCD to perform a functional imaging experiment. First, the basic steps for identifying the middle cerebral artery (MCA) and optimizing the signal will be described. Next, placement of a fixation device for holding the TCD probe in place during the experiment will be described. Finally, the breath-holding experiment, which is a specific example of a functional imaging experiment using fTCD, will be demonstrated.

Functional transcranial Doppler ultrasound complements other functional imaging modalities, with its high temporal resolution measurement of stimulus-induced changes in cerebral blood flow within the basal cerebral arteries. This Methods paper gives step-by-step instructions for using functional transcranial Doppler ultrasound to perform a functional imaging experiment.&#160;

Échographie Doppler transcrânienne fonctionnelle pour la surveillance du flux sanguin cérébral

Functional transcranial Doppler ultrasound (fTCD) is the use of transcranial Doppler ultrasound (TCD) to study neural activation occurring during stimuli ...

Contrast-Enhanced Subharmonic Aided Pressure Estimation (SHAPE) Using Ultrasound Imaging with a Focus on Identifying Portal Hypertension

Noninvasive, accurate measurement of pressures within the human body has long been an important but elusive clinical goal. Contrast agents for ultrasound imaging are gas-filled, encapsulated microbubbles (diameter &#60; 10 &#956;m) that traverse the entire vasculature and enhance signals by up to 30 dB. These microbubbles also produce nonlinear oscillations at frequencies ranging from the subharmonic (half of the transmit frequency) to higher harmonics. The subharmonic amplitude has an inverse linear relationship with the ambient hydrostatic pressure. Here an ultrasound system capable of performing real-time, subharmonic aided pressure estimation (SHAPE) is presented. During ultrasound contrast agent infusion, an algorithm for optimizing acoustic outputs is activated. Following this calibration, subharmonic microbubble signals (i.e., SHAPE) have the highest sensitivity to pressure changes and can be used to noninvasively quantify pressure. The utility of the SHAPE procedure for identifying portal hypertension in the liver is the emphasis here, but the technique has applicability across many clinical scenarios.

Contrast-Enhanced Subharmonic Aided Pressure Estimation SHAPE Using Ultrasound Imaging with a Focus on Identifying Portal Hypertension

A protocol for noninvasively estimating ambient pressures utilizing subharmonic ultrasound imaging of infused contrast microbubbles (following appropriate calibration) is described with examples from human patients with chronic liver disease.

Estimation de la pression assistée par sous-harmonique améliorée par contraste (SHAPE) à l’aide de l’imagerie par ultrasons en mettant l’accent sur l’identification de l’hypertension portale

Noninvasive, accurate measurement of pressures within the human body has long been an important but elusive clinical goal. Contrast agents for ultrasound ...

Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release

Microbubble contrast agents hold great promise for drug delivery applications with ultrasound. Encapsulating drugs in nanoparticles reduces systemic toxicity and increases circulation time of the drugs. In a novel approach to microbubble-assisted drug delivery, nanoparticles are incorporated in or on microbubble shells, enabling local and triggered release of the nanoparticle payload with ultrasound. A thorough understanding of the release mechanisms within the vast ultrasound parameter space is crucial for efficient and controlled release. This set of presented protocols is applicable to microbubbles with a shell containing a fluorescent label. Here, the focus is on microbubbles loaded with poly(2-ethyl-butyl cyanoacrylate) polymeric nanoparticles, doped with a modified Nile Red dye. The particles are fixed within a denatured casein shell. The microbubbles are produced by vigorous stirring, forming a dispersion of perfluoropropane gas in the liquid phase containing casein and nanoparticles, after which the microbubble shell self-assembles. A variety of microscopy techniques are needed to characterize the nanoparticle-stabilized microbubbles at all relevant timescales of the nanoparticle release process. Fluorescence of the nanoparticles enables confocal imaging of single microbubbles, revealing the particle distribution within the shell. In vitro ultra-high-speed imaging using bright-field microscopy at 10 million frames per second provides insight into the bubble dynamics in response to ultrasound insonation. Finally, nanoparticle release from the bubble shell is best visualized by means of fluorescence microscopy, performed at 500,000 frames per second. To characterize drug delivery in vivo, the triggered release of nanoparticles within the vasculature and their extravasation beyond the endothelial layer is studied using intravital microscopy in tumors implanted in dorsal skinfold window chambers, over a timescale of several minutes. The combination of these complementary characterization techniques provides unique insight into the behavior of microbubbles and their payload release at a range of time and length scales, both in vitro and in vivo.

The presented protocols can be used to characterize the response of fluorescently-labeled microbubbles designed for ultrasound-triggered drug delivery applications, including their activation mechanisms as well as their bioeffects. This paper covers a range of in vitro and in vivo microscopy techniques performed to capture the relevant length and timescales.

Méthodes de microscopie multi-temps pour la caractérisation de microbulles marquées par fluorescence pour la libération de médicaments déclenchée par ultrasons

Microbubble contrast agents hold great promise for drug delivery applications with ultrasound. Encapsulating drugs in nanoparticles reduces systemic ...

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. These include the limited number of cadaveric pancreas donors and the long-term use of immunosuppressants. Mesenchymal stem cells (MSCs) have been considered to be a potential candidate as an alternative source of islet-like cell generation. Our previous reports have successfully illustrated the establishment of induction protocols for differentiating human dental pulp stem cells (hDPSCs) to insulin-producing cells (IPCs). However, the induction efficiency varied greatly. In this paper, we demonstrate the comparison of hDPSCs pancreatic induction efficiency via integrative (microenvironmental and genetic manipulation) and non-integrative (microenvironmental manipulation) induction protocols for delivering hDPSC-derived IPCs (hDPSC-IPCs). The results suggest distinct induction efficiency for both the induction approaches in terms of 3-dimensional colony structure, yield, pancreatic mRNA markers, and functional property upon multi-dosage glucose challenge. These findings will support the future establishment of a clinically applicable IPCs and pancreatic lineage production platform.

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

This protocol presents a comparison between two different induction protocols for differentiating human dental pulp stem cells (hDPSCs) toward pancreatic lineages in vitro: the integrative protocol and the non-integrative protocol. The integrative protocol generates more insulin producing cells (IPCs).

In vitro Induction de cellules souches de pulpe dentaire humaine vers des lignées pancréatiques

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. ...