RVS é suportado pelo investigador nova start-up fundos de Albert Einstein College of Medicine da Universidade de Yeshiva.

1. Perfusão Animal e Dissection Cerebelo <ol><li> Dependendo da proteína, a perfusão pode ser essencial para 1,2 coloração bem sucedida. Perfusão intracardíaca é um procedimento invasivo, o procedimento não-sobrevivência que exige o uso adequado de anestésicos. Treinamento correto, aprovação institucional, e aprovação IACUC são todos necessários antes de tentar o procedimento. É sempre uma boa idéia consultar veterinários da instituição para obter ajuda na identificação de requisitos experimentais e adquirindo o treinamento correto. Antes do procedimento, o animal deve ser profundamente anestesiados e não responsivos a estímulos tais como a febre ou pitada cauda. Usando uma tesoura faça um corte na pele abdominal e parede muscular e, em seguida, continuar a abrir a caixa torácica, cortando apenas ao lado do esterno em cada lado. Além disso, o experimentador pode criar um maior espaço de trabalho interno cortando a fáscia circundante do diafragma. Ao levantar a parede abdominal e torácica Superiorly, o coração irá agora ser exposta. Fazer um pequeno corte no átrio direito para permitir que o sangue flua para fora e imediatamente inserir a agulha de perfusão para o ventrículo esquerdo. Uma bomba de hidrostática de base é o preferido para produzir as soluções de perfusão (ver Tabela 1 para detalhes). Primeiro, lave o sangue para fora com fosfato 0,1 M tamponada salina (PBS, ver Tabela 3), até o fluido corre claro. Em seguida, desligar a bomba hidrostática, mudar rapidamente o tubo de entrega de solução a um recipiente de paraformaldeído a 4% (PFA, ver Tabela 3) diluído em PBS e depois ligar a bomba de volta para entregar o fixador. A utilização de uma bomba não é necessário: com a prática, duas seringas cheias com o PBS e 4% PFA pode ser usado para produzir as soluções lentamente. </li><li> É crítico para dissecar cuidadosamente o cérebro para fora do crânio sem a introdução de quaisquer lesões ao tecido. Mesmo pequenas lacerações no cérebro durante a dissecção irá expandir gradualmente em fendas visíveis queanticorpos armadilha e causar manchas artefactual durante o processamento do tecido (por exemplo, asteriscos vermelhas na Fig. 2). Para dissecações cerebelares, é típico para cortar a pele para baixo no meio da cabeça e depois suavemente provocar as abas à parte para expor o crânio. Cortar o crânio de anterior para posterior ao longo da linha média dorsal, e também lateralmente ao longo de ambos os lados do crânio. Não corte além do bregma como esta corre o risco de entalhar o cerebelo. Utilizando uma pinça suavemente levantar a parte frontal do crânio longe do cérebro com cuidado para não rasgar o tecido cerebral que está ligado para as meninges. Sever dos nervos cranianos, no lado ventral do cérebro. </li><li> Separação do cerebelo do resto do cérebro é importante por duas razões. Primeiro, ele permite a exploração de padrões de expressão nos lóbulos anteriores, que estão escondidos da visão pela colículos in situ. A segunda é que a separação do tecido em menores, regiões isoladas permite mminério de fixação completa, o que pode facilitar a coloração de algumas proteínas. Durante esta etapa dissecção final, cuidados devem ser tomados para não tocar no cerebelo, com as pontas dos fórceps. Inserir as pontas de um par de pinças para o meio das colículos superiores e inferiores. Com um segundo conjunto de pinça lentamente provocar afastado o colículo inferior a partir do cerebelo. Em seguida, coloque o cerebelo para que sua face anterior é voltada para baixo e do tronco cerebral está apontando para cima. Inserir a pinça para o quarto ventrículo entre o tronco encefálico e IX lóbulos / X do cerebelo. Cortar os pedúnculos apertando com a pinça de ambos os lados e então suavemente levantar o cerebelo de distância a partir do tronco cerebral. Uma vez que o cerebelo é isolado, pós-corrigi-lo por imersão em PFA a 4% a 4 ° C durante um mínimo de 24-48 horas. O cerebelo podem ser armazenados em PFA a 4% durante um período prolongado de tempo. As meninges deve ser removido antes ou depois da coloração para melhor visibilidade dos padrões de expressão.Se o experimentador escolhe para remover as meninges antes da coloração existe uma forte possibilidade de que o cerebelo será cortado durante o processo. Descascar as meninges no final do procedimento de coloração é muito mais simples, porque eles se tornam mais fáceis de localizar após adquirem a coloração de fundo fraco e tornar-se frágil pós-processamento. </li></ol> 2. O processamento do tecido para a coloração Wholemount Como a abordagem de coloração wholemount demora mais do que coloração imuno-histoquímica de secções de tecido, é útil para planear a linha de tempo para cada um dos experimentos como mostrado no calendário exemplo fornecido (Tabela 2). Antes de começar, há várias coisas fundamentais para se manter em mente. 1) Os microtubos contendo o tecido deve ser rodada em um nutator em todos os momentos, excepto durante o processo de congelamento / descongelamento. 2) Várias soluções deve ser feito fresco para cada experiência (Ver Tabela 3 para as receitas de solução). 3)Durante todo o protocolo, quando mudar soluções, gentilmente deitar fora a solução passou em vez de remover o cerebelo com uma pinça, para evitar tocar no cerebelo. Então, depois de misturar a solução de novo no outro recipiente, utilizar uma pipeta para suavemente adicionar a solução de fresco para o tubo. 2,1 Dia 1: <ol class="lalpha"><li> Fixar o cerebelo em 3 Dent correção à temperatura ambiente por 6-8 horas balançando suavemente na nutator. Se metanol é destrutivo para o seu antígeno, considere substituindo passos 2.1a através 2.3a com um método de recuperação antigênica. O calor e os amortecedores usados ​​para recuperação antigênica vai ajudar a preparar o tecido para a penetração de anticorpos. </li><li> Cerebelo Bleach o em Bleach Dent 3 durante a noite a 4 ° C. </li></ol> 2,2 Dia 2: <ol class="lalpha"><li> Desidratar o cerebelo em duas rondas de MeOH a 100% à temperatura ambiente durante 30 min cada. </li><li> Em seguida, para aumentar a penetração das soluções, sujeitoo tecido a uma série de congelamento / descongelamento ciclos. Cuidadosamente colocar o tubo num recipiente com gelo seco e congelamento durante 30 min. Em seguida, remover o tubo e deixá-la à temperatura ambiente na bancada durante 15 minutos. O passo de congelamento / descongelamento deve ser realizada quatro vezes (pelo menos). </li><li> Após a última descongelamento do tecido, colocar o tubo num congelador -80 ° C durante a noite. </li><li> O tecido pode ser armazenado por períodos prolongados de tempo a -80 ° C, quer imediatamente antes ou depois dos passos de congelação / descongelação. Caso contrário, o protocolo deve ser continuado. </li></ol> 2,3 Dia 3: <ol class="lalpha"><li> Re-hidratar o cerebelo, lavando-o em 50% MeOH/50% de PBS, 15% MeOH/85% de PBS, e 100% de PBS durante 60-90 minutos cada à temperatura ambiente. </li><li> Em seguida, para o adulto rato cerebelos, sujeita o tecido a digestão enzimática com 10μg/ml proteinase K em PBS durante 2-3 minutos. No processo de digestão é necessária para cerebelo de animais jovens (P5 ou menos, no mouse). Mais digestion é sugerido para cérebros maiores. Por exemplo, a digestão pode ser tão elevada quanto 5-6 minutos para cérebros de primatas 4. </li><li> Após a digestão, lave o cerebelo em PBS três vezes durante 10 minutos cada à temperatura ambiente para remover o K. Proteinase </li><li> Bloquear o tecido em PMT (ver Tabela 3) durante a noite a 4 ° C. Leite em pó é muitas vezes a primeira escolha quando se selecciona um agente de bloqueio para o trabalho de proteína porque é barato, reduz eficazmente a coloração de fundo, e tipicamente não interfere com a ligação do anticorpo ou o acesso ao antigénio. Soros de animais também podem ser usados, embora o experimentador deve estar ciente do custo adicional e deve primeiro testar a qualidade soro para com reactividade cruzada imunoglobulinas e capacidade para produzir um sinal ideal para relação de ruído. </li></ol> 2,4 Dia 4-5: <ol class="lalpha"><li> Incubar o tecido em anticorpos primários diluídos em DMSO PMT suplementadas com 5% durante 48 horas a 4 ° C (larger cerebelos exigirá tempos de incubação maiores). </li></ol> 2,5 Dia 6: <ol class="lalpha"><li> Lavar o cerebelo 2-3 vezes por 2-3 horas cada em PMT a 4 ° C para remover os anticorpos não ligados primários. </li><li> Em seguida, o tecido incubar em anticorpos secundários em uma solução contendo PMT com DMSO a 5% a 4 ° C durante a noite (maior cerebelos pode requerem tempos de incubação maiores). </li></ol> 2,6 Dia 7: <ol class="lalpha"><li> Lavar o cerebelo 2-3 vezes por 2-3 horas cada em PMT a 4 ° C. </li><li> Dar o tecido de uma lavagem final com PBT (ver Tabela 3) durante 1-2 horas. Este passo remove o excesso de leite e aumenta a clareza da coloração. </li><li> Finalmente, incubar o tecido em DAB (3,3 &#39;-diaminobenzidina) solução até que a intensidade da coloração óptimo é atingido. O produto da reacção castanho deve ser claramente visíveis dentro ~ 10 minutos. É melhor usar DAB no escuro como a luz faz com que o cromógeno a precipitaçãote, o que pode aumentar a coloração de fundo. </li></ol> 2,7 Quando a intensidade de coloração óptimo é atingido, parar a reacção colocando o cerebelo em PBS com azida de sódio 0,04%. O tecido pode ser armazenada a longo prazo nesta solução. A azida de sódio é um potente inibidor do crescimento bacteriano, mas deve ser evitado até este passo como também inibe a peroxidase de rábano. 2,8 procedimento de amplificação opcional: seguir o protocolo normal, mas estas etapas devem ser realizadas no local das etapas 2.5b-2.7 acima. <ol class="lalpha"><li> Incubar o tecido durante a noite a 4 ° C em biotina-anticorpos secundários conjugados em PBST (ver Tabela 3) com DMSO a 5%. </li><li> Lavar o tecido durante 2-3 horas cada em mudanças de 3-4 PBST à temperatura ambiente. </li><li> Incubar o cerebelo durante a noite a 4 ° C em solução de complexo ABC em PBST. </li><li> Lavar o tecido durante 2-3 horas cada emtemperatura ambiente em mudanças de PBS 3-4. </li><li> Incubar o tecido em recém-preparado solução DAB, como descrito acima. </li><li> Quando a coloração é óptima, parar a reacção por lavagem o cerebelo em PBS com azida de sódio 0,04%. </li></ol> 3. Imagem do tecido manchado <ol><li> Imagens Wholemount pode ser capturada utilizando, por exemplo, uma Leica DFC3000 câmara FX montado sobre um estereomicroscópio Leica FA MZ16 executando Leica Application Suite software FX. Se desejado, a microscopia de desconvolução pode ser usada para adquirir múltiplas imagens consecutivas em diferentes planos focais, com cada imagem tendo apenas um único lóbulo em foco crocante. Em seguida, as imagens podem ser comprimidos em uma única pilha e software processado para remover a distorção. A imagem composta final irá ilustrar os padrões de expressão de superfície do cerebelo com toda a padronização visível no foco claro. </li><li> Tecido manchado Wholemount deve ser trabalhada enquanto imersa em PBS (ou outro meio que dará umíndice de refração ótimo). A fim de posicionar facilmente o wholemount para imagiologia, fazer um gel de agar a 1% em uma placa de Petri de plástico. Cortar pequenos orifícios no gel. Os furos vai permitir que o cerebelo de ser preso na orientação desejada. </li><li> Os dados brutos são importados para o Adobe Photoshop CS4 e ajustado para os níveis de contraste e brilho. </li></ol> Animais Todos os estudos em animais foram realizadas ao abrigo de um protocolo animal aprovado IACUC acordo com as diretrizes institucionais no Albert Einstein College of Medicine. Macho e fêmea outbred suíça Webster (Taconic, Albany, NY) os ratinhos foram mantidos no nosso colónia e utilizado para todos os estudos. Ratos adultos submetidos a eutanásia foram gentilmente cedidas pelo Dr. Bryen Jordan (Albert Einstein College of Medicine). Todos os animais foram pelo menos um mês de idade. 4. Os resultados representativos O cerebelo é compartimentalizada pela expressão molecular em quatro zonas transversais:a zona anterior (AZ: ~ lóbulos IV), a zona central (CZ: ~ lóbulos VI-VII), a zona posterior (PZ: ~ lóbulos VIII-dorsal IX) e na zona de nodular (NZ: ~ lóbulos IX e X ventral ) 5. Cada zona contém um único conjunto de listras parasagital 1,2,5,6 (Fig. 1). ZebrinII expressão em células de Purkinje revela listras no AZ e PZ (Fig. 2) e de expressão uniforme no CZ e NZ (Fig. 2). A organização parassagital de células de Purkinje é espelhada pela topografia campo terminal de fibras aferentes. Transcrição cocaína-anfetamina e regulamentado (CART) peptídeo é expresso em subconjuntos de fibras de escalada (Fig. 3) que se projetam para faixas de dendritos das células de Purkinje na camada molecular do córtex cerebelar 7 (Fig. 3b). Com as modificações adequadas, tais como amplificação 7, o protocolo wholemount permite a visualização de padrões olivocerebellar sem a need para um laboriosos, tempo reconstruções consumir a partir de secções de tecido de coloração (Fig. 3b). <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/4042/4042fig1.jpg" /> Figura 1. A. ZebrinII / aldolaseC expressão revela bandas sagitais em seções transversais do cerebelo. Barra de escala = 500 uM. B. ZebrinII / aldolaseC é expresso exclusivamente em Purkinje somata celular e dendritos. Barra de escala = 150μm (gl = camada granular; pcl = camada de células Purkinje; ml = camada molecular). <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/4042/4042fig2.jpg" /> Figura 2. Um cerebelo wholemount coradas para ZebrinII / aldolaseC mostrando as listras de células de Purkinje em imagens do anterior (AZ), central (CZ), e posterior (PZ) zonas do cerebelo. Aqui também mostram um exemplo da consequência negativa da nicking o cerebelo. A coloração resultante artefactual é indicadocom asteriscos vermelhos. Barra de escala = 1 mm (LS = simplex lobulus; PML = paramediana lóbulo; COP = cópula Pyramidis). <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/4042/4042fig3.jpg" /> Figura 3. CART A. é expressa em escalar terminais de fibras na camada molecular. Barra de escala = 100 mm. (Ml = camada molecular; pcl = camada de células Purkinje; gl = camada granular) B. imunohistoquímica Wholemount de expressão CART na NZ. Barra de escala = 2 mm (COP = cópula Pyramidis; PML = paramediana lóbulo; PFL = paraflocculus; FL = flóculus).

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Não temos nada a divulgar.

Nós descrevemos os detalhes técnicos necessários para a coloração wholemount sucesso utilizando uma abordagem versátil imuno-histoquímica para expressão da proteína reveladora no cérebro em desenvolvimento e adultos. Usando esta abordagem, complexos moleculares padrões de expressão podem ser analisadas e topografia cérebro apreciado sem a necessidade de trabalhoso e demorado procedimentos de secção consumindo de tecidos. Este protocolo foi usado para revelar a expressão padro...

<table border="1"><tbody><tr><td> Materiais </td><td> Função no protocolo </td></tr><tr><td> Bomba de perfusão (Fisher Scientific/13-876-2) </td><td> Permite a perfusão consistente e lento. </td></tr><tr><td> Sharp-ponta Tesoura (FST/14081-08) </td><td> Uso geral na perfusão e dissecção. </td></tr><tr><td> Blunt-ponta Fórceps (FST/91100-12) </td><td> Para estabilizar o coração para inserção da agulha de perfusão. </td></tr><tr><td> Fórceps (FST por Dumont AA/11210-10) </td><td> Para utilização durante a dissecção do cérebro do crânio e para separar o cerebelo do resto do cérebro. Estes são essenciais porque eles têm uma ponta ligeiramente arredondada que ajuda a minimizar os danos ao cerebelo durante a dissecção. </td></tr><tr><td> Nutator (Fisher Scientific) </td><td> Utiliza-se para manter o tecido em movimento durante períodos de incubação. </td></tr><tr><td> 1,5 mL tubo (Sarstedt / Parafuso Micro Tube) </td><td> Todos os passos do seuhistoquímica protocolo ter lugar nestes microtubos. A parte inferior arredondada assegura que o cerebelo permanece em movimento. </td></tr><tr><td> Colher perfurada (FST/10370-17) </td><td> Usado para manter wholemounts nos microtubos enquanto suavemente decantação a solução passou. </td></tr><tr><td> Leica MZ16 FA microscópio </td><td> Usado para examinar coloração wholemount. </td></tr><tr><td> Leica DFC3000 FX câmera </td><td> Usado para capturar imagens wholemount. </td></tr></tbody></table> Tabela 1. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="9"> Exemplo de calendário para um experimento típico wholemount </td></tr><tr><td> Dia 1 </td><td colspan="4"> Correção Dent, temperatura ambiente, 8 horas </td><td colspan="4"> Lixívia Dent, 4 ° C, durante a noite </td></tr><tr><td> Dia 2 </td><td colspan="3"> 100% de MeOH, temperatura ambiente, 2x, 30 min cada </td><td colspan="3"> 100% MeOH, congelamento / descongelamento, 4x, 30 min/15 min </td><td colspa<html> n = &quot;2&quot;&gt; MeOH a 100%, -80 ° C, durante a noite </td></tr><tr><td> Dia 3 </td><td> 50% MeOH/50% PBS, temperatura ambiente, 60-90 min </td><td colspan="2"> 15% de MeOH / PBS a 85%, à temperatura ambiente, 60-90 min </td><td colspan="2"> 100% de PBS, à temperatura ambiente, 60-90 min </td><td> 10μg/mL proteinase K em PBS, à temperatura ambiente, 2-3 min </td><td> 100% de PBS, à temperatura ambiente, 3x, 10 min cada </td><td> PMT, 4 ° C, durante a noite </td></tr><tr><td> Dia 4-5 </td><td colspan="8"> PMT + 1 ° de anticorpos + 5% de DMSO, 4 ° C, 48 horas </td></tr><tr><td> Dia 6 </td><td colspan="3"> PMT, 4 ° C, 2-3x, 2-3 horas em cada </td><td colspan="5"> PMT + 2 ° anticorpo + 5% de DMSO, 4 ° C, 24 horas (ou iniciar a passos de amplificação com ABC complexo) </td></tr><tr><td> Dia 7 </td><td colspan="2"> PMT, 4 ° C, 2-3x, 2-3 horas em cada </td><td colspan="3"> PBT, temperatura ambiente, 2 horas </td><td colspan="3"> Incubar em DAB fresco em PBS até que a coloração ideal é visualizado </td></tr></tbody></table>_content &quot;&gt; Tabela 2. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Receitas (* = preparar uma nova a cada vez) </td></tr><tr><td> PBS (solução salina tamponada com fosfato) </td><td> 0,1 M de tampão fosfato salino em água desionizada. pH 7,2 (Sigma; comprimidos P4417) </td></tr><tr><td> PFA (paraformaldeído) </td><td> Feito e congelado armazenado como uma solução a 20% e, em seguida diluído para 4% em PBS para a solução de trabalho (Fisher Scientific; T353) </td></tr><tr><td> * Dent 3 de Fixação </td><td> 4 partes de metanol 1 parte dimetilsulfóxido (DMSO; Fisher Scientific, D159-4) </td></tr><tr><td> Bleach Dent 3 * </td><td> 4 partes de metanol 1 parte dimetilsulfóxido (DMSO; Fisher Scientific, D159-4) 1 parte de peróxido de hidrogênio a 30% </td></tr><tr><td> Digestão enzimática </td><td> 10 ug / ml de proteinase K (Roche Diagnostics; 03115828001) em PBS. </td></tr><tr><td> PBST </td><td> PBS contendo: 0,1% de Tween-20 (Fisher Scientific, BP337; Triton também pode ser utilizado em lugar de Tween-20 em todos os casos). </td></tr><tr><td> PMT 25 * </td><td> PBS contendo: 2% desnatado em pó de leite desnatado (Carnation preferido) 0,1% de Tween-20 (Fisher Scientific; BP337) </td></tr><tr><td> PBT 25 * </td><td> PBS contendo: Bovino a 0,2% (Sigma; B9001S) de albumina de soro 0,1% de Tween-20 (Fisher Scientific; BP337) </td></tr><tr><td> DAB * </td><td> Dissolve-se um comprimido de 10 mg de 3,3-diaminobenzidina (Sigma-Aldrich; D5905) em 40 ml de PBS. Adicionar 10 ul de peróxido de hidrogénio a 30% para iniciar a reacção). </td></tr><tr><td> ABC solução complexa </td><td> Vectastain kit (Vector Laboratories, Inc; PK-4000) </td></tr></tbody></table> Tabela 3.

wholemount immunohistochemistry for revealing complex brain topography

A arquitetura repetida e bem-entendido celular do cerebelo torná-lo um sistema modelo ideal para explorar a topografia do cérebro. Subjacente a sua citoarquitetura relativamente uniforme é um complexo conjunto de domínios parassagitais de expressão gênica e protéica. A compartimentação molecular do cerebelo é espelhada pela organização anatômica e funcional das fibras aferentes. Para apreciar plenamente a complexidade da organização do cerebelo que anteriormente uma abordagem refinada coloração wholemount para análise de defeitos de alto rendimento de padronização no cerebelo mouse. Este protocolo descreve em detalhes os reagentes, instrumentos e medidas práticas que são úteis para o sucesso revelar padrões de expressão de proteínas no cerebelo do rato adulto usando imunomarcação wholemount. Os passos em destaque aqui demonstrar a utilidade do presente método utilizando a expressão de zebrinII / aldolaseC como um exemplo de como a topografia fina do cérebro pode ser revelado na suaconformação tridimensional nativa. Também descritos são adaptações para o protocolo que permite a visualização de expressão da proteína em projeções aferentes e cerebelo grande para estudos comparativos de topografia molecular. Para ilustrar estas aplicações, os dados de coloração aferente do cerebelo de rato estão incluídos.

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Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography

Circuitos neurais são topograficamente organizados em compartimentos funcionais específicas com perfis moleculares. Aqui, apresentamos os passos práticos e técnicos para revelar topografia cérebro global usando uma abordagem de coloração imuno-histoquímica wholemount versátil. Nós demonstrar a utilidade do método utilizando o citoarquitetura bem compreendida e os circuitos de cerebelo.

Imuno-histoquímica para Topografia Wholemount cerebrais, Complexo

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its ...

wholemount-immunohistochemistry-for-revealing-complex-brain-topography

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.5K visualizações.  Albert Einstein College of Medicine, Yeshiva University. Circuitos neurais são topograficamente organizados em compartimentos funcionais específicas com perfis moleculares. Aqui, apresentamos os passos práticos e técnicos para revelar topografia cérebro global usando uma abordagem de coloração imuno-histoquímica wholemount versátil. Nós demonstrar a utilidade do método utilizando o citoarquitetura bem compreendida e os circuitos de cerebelo.

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The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an extensively studied model system for understanding the behavior of neural stem cells and the regulation of adult neurogenesis. Traditionally, these studies have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region. Compared to sections, wholemounts preserve the complete cytoarchitecture and cellular relationships within the SVZ. This approach has recently revealed that the adult neural stem cells, or type B1 cells, are part of a mixed neuroepithelium with differentiated ependymal cells lining the lateral ventricles. In addition, this approach has been used to study the planar polarization of ependymal cells and the cerebrospinal fluid flow they generate in the ventricle. With recent evidence that adult neural stem cells are a heterogeneous population that is regionally specified, the wholemount approach will likely be an essential tool for understanding the organization and parcellation of this stem cell niche.

The lateral ventricle walls contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. Traditionally, studies on neurogenesis in this region have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region.

A zona subventricular En face: Coloração Wholemount e Fluxo ependimárias

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an ...

Neurociência

Revealing Neural Circuit Topography in Multi-Color

Neural circuits are organized into functional topographic maps. In order to visualize complex circuit architecture we developed an approach to reliably label the global patterning of multiple topographic projections. The cerebellum is an ideal model to study the orderly arrangement of neural circuits. For example, the compartmental organization of spinocerebellar mossy fibers has proven to be an indispensable system for studying mossy fiber patterning. We recently showed that wheat germ agglutinin (WGA) conjugated to Alexa 555 and 488 can be used for tracing spinocerebellar mossy fiber projections in developing and adult mice (Reeber et al. 2011). We found three major properties that make the WGA-Alexa tracers desirable tools for labeling neural projections. First, Alexa fluorophores are intense and their brightness allows for wholemount imaging directly after tracing. Second, WGA-Alexa tracers label the entire trajectory of developing and adult neural projections. Third, WGA-Alexa tracers are rapidly transported in both retrograde and anterograde directions. Here, we describe in detail how to prepare the tracers and other required tools, how to perform the surgery for spinocerebellar tracing and how best to image traced projections in three dimensions. In summary, we provide a step-by-step tracing protocol that will be useful for deciphering the organization and connectivity of functional maps not only in the cerebellum but also in the cortex, brainstem, and spinal cord.

We provide a practical guide for delivering tracers in vivo and use the spinocerebellar pathway as a model system to demonstrate essential steps for successful neuronal circuit analysis in mice. We describe in detail our versatile tracing protocol that exploits wheat germ agglutinin (WGA) conjugated to Alexa fluorophores.

Revelando Topografia Circuito Neural em Multi-Color

Neural circuits are organized into functional topographic maps. In order to visualize complex circuit architecture we developed an approach to reliably ...

Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for immunohistochemistry and, 2) calcium imaging for the study of voltage gated calcium channel (VGCC) mediated calcium signaling in retinal ganglion cells. The calcium imaging method we describe circumvents issues concerning non-specific loading of displaced amacrine cells in the ganglion cell layer.

Immunohistochemistry protocols are used to study the localization of a specific protein in the retina. Calcium imaging techniques are employed to study calcium dynamics in retinal ganglion cells and their axons.

Os métodos de imagem de imuno-histoquímica e cálcio em Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

Spinal Cord Injury completo e Cérebro Dissection Protocolo para Wholemount Subsequente<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização em larval da lampreia de mar

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brain tissue, using markers for microglia and neuronal elements as an example. Specifically, this paper is a step-by-step protocol for fluorescent visualization of microglia and neurons via immunohistochemistry for Iba1 and Pan-neuronal, respectively. Fluorescence double-labeling is particularly useful for the localization of multiple proteins within the same sample, providing the opportunity to accurately observe interactions between cell types, receptors, ligands, and/or the extracellular matrix in relation to one another as well as protein co-localization within a single cell. Unlike other visualization techniques, fluorescence immunohistochemistry staining intensity may decrease in the weeks to months following staining, unless appropriate precautions are taken. Despite this limitation, in many applications fluorescence double-labeling is preferred over alternatives such as 3,3&#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) or alkaline phosphatase (AP), as fluorescence is more time efficient and allows for more precise differentiation between two or more markers. The discussion includes troubleshooting tips and advice to promote success.

This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example.

Primer para imunohistoquímica em tecido criosseccionada cérebro de um rato: Exemplo de coloração para Microglia e Neurônios

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

Preparação do Tecido Cerebral primata não humano para Pré-incorporação de imuno-histoquímica e Microscopia Electrónica

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent development of thin, flexible ECoG electrodes has enabled conduction of stable recordings of large-scale cortical activity. We have developed a whole-cortical ECoG array for the common marmoset. The array continuously covers almost the entire lateral surface of cortical hemisphere, from the occipital pole to the temporal and frontal poles, and it captures whole-cortical neural activity in one shot. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain. Marmosets have two advantages regarding ECoG recordings, one being the homologous organization of anatomical structures in humans and macaques, including frontal, parietal, and temporal complexes. The other advantage is that the marmoset brain is lissencephalic and contains a large number of complexes, which are more difficult to access in macaques with ECoG, that are exposed to the brain surface.These features allow direct access to most cortical areas beneath the surface of the brain. This system provides an opportunity to investigate global cortical information processing with high resolutions at a sub-millisecond order in time and millimeter order in space.

We have developed a whole-cortical electrocorticographic array for the common marmoset that continuously covers almost the entire lateral surface of cortex, from the occipital pole to the temporal and frontal poles. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain.

Crônica implantação de matriz Electrocorticographic todo-cortical no sagui comum

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for determining the mechanisms underlying retinal diseases. Maintaining structural integrity throughout the tissue preparation is vital for obtaining reproducible retinal IHC data but can be challenging due to the fragility and complexity of retinal cytoarchitecture. Strong fixatives like 10% formalin or Bouin's solution optimally preserve the retinal structure, they often impede IHC analysis by enhancing the background fluorescence and/or diminishing antibody-epitope interactions, a process known as epitope masking. Milder fixatives, on the other hand, like 4% paraformaldehyde, reduces background fluorescence and epitope-masking, meticulous dissection techniques must be utilized to preserve the retinal structure. In this article, we present a comprehensive method to prepare mouse ocular posterior cups for IHC that is sufficient to preserve most antibody-epitope interactions without loss of retinal structural integrity. We include representative IHC with antibodies to various retinal cell type markers to illustrate tissue preservation and orientation under optimal and sub-optimal conditions. Our goal is to optimize IHC studies of the retina by providing a complete protocol from ocular posterior cup dissection to IHC.

This report describes comprehensive methods for preparing frozen mouse retina sections for immunohistochemistry (IHC). Methods described include dissection of the ocular posterior cup, paraformaldehyde fixation, embedding in Optimal Cutting Temperature (OCT) media and tissue orientation, sectioning and immunostaining.

Preparação de Cryo-seções retinal do rato para immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

Avaliação da indução de depressão em longo prazo em fatias Cerebelares adultas

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within cells. Neurochemical phenotyping of functionally identified neurons usually requires concurrent labelling with multiple antibodies (targeting protein) using immunohistochemistry (IHC) and optimization of in situ hybridization (targeting RNA), in tandem. A &#34;neurochemical signature&#34; to characterize particular neurons may be achieved however complicating factors include the need to verify FISH and IHC targets before combining the methods, and the limited number of RNAs and proteins that may be targeted simultaneously within the same tissue section.
Here we describe a protocol, using both fresh frozen and fixed mouse brain preparations, which detects multiple mRNAs and proteins in the same brain section using RNAscope FISH followed by fluorescence immunostaining, respectively. We use the combined method to describe the expression pattern of low abundance mRNAs (e.g., galanin receptor 1) and high abundance mRNAs (e.g., glycine transporter 2), in immunohistochemically identified brainstem nuclei.
Key considerations for protein labelling downstream of the FISH assay extend beyond tissue preparation and optimization of FISH probe labelling. For example, we found that antibody binding and labelling specificity can be detrimentally affected by the protease step within the FISH probe assay. Proteases catalyze hydrolytic cleavage of peptide bonds, facilitating FISH probe entry into cells, however they may also digest the protein targeted by the subsequent IHC assay, producing off target binding. The subcellular location of the targeted protein is another factor contributing to IHC success following FISH probe assay. We observed IHC specificity to be retained when the targeted protein is membrane bound, whereas IHC targeting cytoplasmic protein required extensive troubleshooting. Finally, we found handling of slide-mounted fixed frozen tissue more challenging than fresh frozen tissue, however IHC quality was overall better with fixed frozen tissue, when combined with RNAscope.

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

This protocol describes a method for combining fluorescence in situ hybridization (FISH) and fluorescence immunohistochemistry (IHC) in both fresh frozen and fixed mouse brain sections, with the goal of achieving multilabel FISH and fluorescence IHC signal. IHC targeted cytoplasmic and membrane attached proteins.

Combinando Hibridização In Situ por Fluorescência Multiplex com Imunohistoquímica Fluorescente em Seções Cerebrais de Camundongos Frescos Congelados ou Fixos

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within ...