RVS는 예시바 대학 의과 알버트 아인슈타인 대학에서 창업 자금을 새로운 조사에 의해 지원됩니다.

1. 동물 재관류와 소뇌의 해부 <ol><li> 단백질에 따라 관류는 성공적인 염색법의 1,2에 필수적인 것입니다. Transcardiac 재관류는 anesthetics의 적절한 사용을 필요로 침입이 아닌 생존 절차입니다. 올바른 교육 기관 승인 및 IACUC 승인 모든 절차를 시도하기 전에 필요합니다. 항상 실험적인 요구 사항을 식별하고 올바른 교육을 습득에 도움을받을 기관의 수의사와 상담하는 것이 좋습니다. 절차 전에 동물 깊이 anesthetized 등 도보 또는 꼬리 핀치와 같은 자극에 반응하지 있어야합니다. 이용 가위는 복부 피부와 근육 벽에 상처를 만들고 다음 각 측면에 흉골에 단지 인접 절단하여 흉곽을 열 것을 계속한다. 또한, 실험자들은 다이어프램을 둘러싼 근막을 절단하여 큰 내부 작업 공간을 만들 수 있습니다. 복부 및 흉부 벽 superio 운동으로rly, 심장이 지금 노출됩니다. 밖으로 흘러 즉시 좌심실로 관류 바늘을 삽입하기 위해 혈액을 허용하도록 오른쪽 중앙홀에 작은 절개를합니다. 기본 정압 펌프는 (자세한 내용은 표 1 참조) 재관류 솔루션을 제공하는 것을 추천한다. 첫째, 0.1M 인산과 혈액을 끌어낼 유체 분명히 실행까지 (PBS, 표 3 참조) 염분 버퍼. 그런 다음, 정압 펌프를 끌 신속 PBS에 희석 4 % paraformaldehyde의 용기 (PFA, 표 3 참조) 솔루션 납품 관을 전환할 후 정착액을 전달하기 위해 다시 펌프를 켜십시오. 펌프의 사용은 필요하지 않습니다 : 연습을 가진 두 개의 주사기는 PBS로 가득한 및 4퍼센트 PFA는 천천히 솔루션을 제공하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> 그것은 신중하게 조직에 어떠한 병변을 소개하지 않고 두개골의 두뇌를 해부하는 데 매우 중요합니다. 해부 동안 뇌로 비록 작은 상처가 서서히 눈에 띄는 구석으로 확대할 것이다트랩 항체가 및 조직 (그림 2의 예를 들어 빨간색 별표)을 처리하는 동안 artifactual 염색법의 원인이됩니다. 소뇌 절개의 경우는 머리의 중간에서 내려 피부를 자르고 나서 부드럽게 두개골을 노출 펄럭를 분리 괴롭혀 일반적입니다. 지느러미 중간선을 따라 사후 위해 앞부분에서 두개골을 잘라, 또한 laterally 두개골의 양쪽을 따라. 이 소뇌를 nicking의 위​​험을 실행으로 bregma 넘어 끄지 마. 집게를 사용하면 부드럽게 meninges에 첨부되어 뇌 조직을 떠날하지 않도록 조심하는 두뇌에서 떨어져 두개골 전면 리프트. 두뇌의 복부 측면에 두개골 신경을 끊다. </li><li> 두뇌의 나머지 부분에서 소뇌의 분리는 두 가지 이유로 중요하다. 첫째, 그것은 원래의 장소에 colliculi으로보기에서 숨겨진 앞쪽에 lobules에 표현 패턴의 탐험을 허용합니다. 두 번째는 작고 고립된 지역에 조직을 분리하는 것은 m을 허용한다는일부 단백질 염색법을 용이하게 수 광석 완전 고정. 이 최종 해부 단계 동안주의가 포셉의 조언과 소뇌를 만지지로 연결됩니다. 우수와 열등 colliculi의 중간에 포셉 한 켤레의 끝을를 삽입합니다. 집게의 두 번째 집합이 천천히 소뇌에서 열등 colliculi 멀리 애타게 함께. 그 앞쪽에 면이 아래로 향하게되고 brainstem가 위쪽으로 가리키는 있도록 다음, 소뇌 서봐. brainstem 및 lobules IX / 소뇌의 X 사이에 네 번째 뇌실로 포셉를 넣습니다. 양쪽에 집게로 곤란하여 peduncles 잘라 후 부드럽게 brainstem에서 떨어져 소뇌 리프트. 소뇌가 격리되면 24-48시간의 최소 ° C ~ 4에 4퍼센트 PFA에 침수하여 게시 - 수리. 소뇌는 오랜 기간 동안 4퍼센트 PFA에 저장할 수 있습니다. meninges는 앞이나 표현 패턴 나은 가시성을 위해 더럽히는 것 전이나 후에 제거해야합니다.실험자들은 소뇌는 과정에서 다친 것이라고 강한 가능성이있다 염색법 전에 meninges를 제​​거하도록 선택하면. 그들이 약한 배경 염색법을 습득하고 후처리 연약한을 받고 나면 위치를 쉽게되기 때문에 염색법 절차의 끝에 meninges 멀리 필링 것이 훨씬 쉽습니다. </li></ol> 2. Wholemount 염색법을위한 조직 처리 wholemount 염색법 접근 방식은 더 이상 조직 섹션의 immunohistochemical 염색법 이상 소요되기 때문에 그것은 (표 2) 제공된 예제 달력 그림과 같이 실험을 각각의 타임 라인을 계획하는 데 도움이됩니다. 시작하기 전에 염두에 두어야 할 몇 가지 중요한 것들이 있습니다. 1) 조직을 포함하는 microtubes은 동결 / 해동 과정을 제외하고 항상 nutator에서 회전한다. 2) 여러 솔루션 (솔루션 조리법에 대한 표 3 참조) 각 실험에 대한 신선한하셔야합니다. 3)프로토콜을 통해 솔루션을 변경할 때, 부드럽게 소뇌에 닿지 않도록, 오히려 포셉와 소뇌를 제거하는 것보다 지출 솔루션을 쏟다. 그런 다음 다른 용기에 새로운 솔루션을 혼합 후, 부드럽게 튜브에 새로운 솔루션을 추가하는 피펫을 사용합니다. 2.1 일 1 : <ol class="lalpha"><li> 6~8시간가 nutator에 부드럽게 출렁 이는 동안 실온에서 덴트의 픽스 3 소뇌를 고정한다. 메탄올 당신의 항원에 대한 파괴적인 경우 항원 검색 방식을 통해 2.3a 2.1a 단계를 교체하는 것을 고려하십시오. 항원 검색에 사용되는 열 및 버퍼는 항체 침투를 위해 조직을 준비하는 데 도움이됩니다. </li><li> 4에 하룻밤 덴트의 블리치 3 블리치 소뇌 ° C. </li></ol> 2.2 일 2 : <ol class="lalpha"><li> 30 분 각각 실온에서 100 % MeOH의 두 라운드에서 소뇌를 탈수. </li><li> 그런 다음, 주제, 솔루션의 침투를 강화하는동결 / 해동 사이클의 연속으로 조직. 30 분 용 드라이 아이스와 동결과 함께 용기에 튜브를 조심스럽게 넣으십시오. 그런 다음 튜브를 제거하고 15 잠시 벤치에 상온에서 둡니다. 동결 / 해동 단계는 네 번 (최소)을 수행하여야한다. </li><li> 조직 해동 지난 후 하룻밤 -80 ° C 냉동실에 튜브를 넣습니다. </li><li> 조직은 -80에서 시간 연장 기간 동안 저장할 수 ° C 즉시 이전 또는 동결 / 해동 단계 이후 중. 그렇지 않으면, 프로토콜은 계속되어야합니다. </li></ol> 2.3 일 3 : <ol class="lalpha"><li> 50 %를 세척하여 소뇌를 Rehydrate MeOH/50 % PBS 15 % MeOH/85 % PBS, 그리고 60-90분 실온에서 각각 100 % PBS. </li><li> 다음으로, 성인 마우스 cerebella, 주제 2-3분위한 PBS에서 10μg/ml Proteinase K로 효소 소화에 대한 조직입니다. 어떤 소화 단계는 젊은 동물 cerebella (마우스의 P5 세 이하)에 대한 필요가 없습니다. 긴 digestioN은 더 큰 두뇌를 위해 추천됩니다. 예를 들어, 소화는 영장류 두뇌 4 5-6분만큼 높은가 될 수 있습니다. </li><li> 소화 후 즉시 Proteinase K &#39;를 제거하기 위해 상온 10 분마다 PBS 세 번에서 소뇌를 씻어 </li><li> 4에서 하룻밤 (표 3 참조) PMT에서 조직을 차단 ° C. 그것이 저렴하기 때문에 분유 종종 단백질 일에 차단 에이전트를 선택하는 첫 번째 선택, 효과적으로 배경 염색법을 절감하고, 일반적으로 항체 바인딩이나 항원에 대한 액세스를 방해하지 않습니다. 실험자들이 추가 비용을 알고 있어야하고 처음 교차 반응 면역 글로불린 및 노이즈 비율로 최적의 신호를 생산할 수있는 능력에 대한 혈청 품질을 테스트해야합니다 비록 동물 serums 또한, 사용하실 수 있습니다. </li></ol> 2.4 일 4-5 : <ol class="lalpha"><li> 4 ° C (larg에서 48 시간 동안 5 % DMSO와 보충 PMT에 희석 일차 항체의 조직을 품어어 cerebella)은 증가 부화 시간을 요구합니다. </li></ol> 2.5 일 6 : <ol class="lalpha"><li> 언바운드 일차 항체를 제거하려면 4 ° C에서 2~3시간 PMT의 각 소뇌에게 3 배 더 씻으십시오. </li><li> 그런 다음, 4에서 5 % DMSO와 PMT를 포함하는 용액에 이차 항체의 조직을 품어 ° C에서 하룻밤 (큰 cerebella가 필요할 수 있습니다 증가 부화 시간). </li></ol> 2.6 일 7 : <ol class="lalpha"><li> 4 ° C.에 2-3시간 PMT의 각 소뇌에게 3 배 더 씻으십시오 </li><li> 조직에게 1~2시간위한 PBT (표 3 참조)와 최종 세차주세요. 이 단계는 과잉 우유를 제거하고 염색법의 선명도를 향상시킵니다. </li><li> 최적의 염색법 강도에 도달할 때까지 마지막으로, DAB (3,3 &#39;-diaminobenzidine) 용액에 조직을 품어. 갈색 반응 생성물은 ~ 10 분 이내에 명확하게 표시합니다. 빛이 precipita에 chromogen의 원인으로 그것은 어둠 속에서 DAB를 사용하는 것이 가장 좋습니다배경 염색법을 높일 수 있습니다 테. </li></ol> 2.7 최적의 염색법 강도에 도달하면 0.04 %의 나트륨 azide와 PBS에서 소뇌를 배치하여 반응을 중지합니다. 조직은이 솔루션에 장기간 저장할 수 있습니다. 나트륨 azide은 세균 성장​​의 강력한 억제제이다뿐만 아니라 양고추냉이 퍼옥시데이즈을 억제으로이 단계까지 피해야한다. 2.8 선택적 증폭 절차 : 정상적인 프로토콜을 따르지만,이 단계는 단계 위의 2.5b-2.7을 대신하여 수행되어야한다. <ol class="lalpha"><li> 4에서 하룻밤 조직을 품어 ° 5 % DMSO와 PBST에서 비오틴 - 복합 이차 항체 (표 3 참조)에서 C #. </li><li> 2~3시간 상온에서 PBST 중 3-4 변화의 각 조직을 씻어. </li><li> 4에서 하룻밤 소뇌를 품어 ° C를 PBST에서 ABC의 복잡한 솔루션. </li><li> 에서 2-3시간 각 조직을 씻어PBS의 3-4 변경 상온. </li><li> 위에서 설명한 갓 준비한 DAB 솔루션의 조직을, 알을 품다. </li><li> 염색법 최적의 경우 0.04 %의 나트륨 azide와 PBS에서 소뇌를 세척하여 반응을 중지합니다. </li></ol> 3. 이미징 얼룩진 조직 <ol><li> Wholemount 이미지 예를 들어, 사용하여 캡처할 수, Leica DFC3000 FX 카메라는 Leica 애플 리케이션 스위트 FX 소프트웨어를 실행 Leica MZ16 FA의 stereomicroscope에 장착된. 원하는 경우 deconvolution 현미경은 각 이미지가 선명하고 초점에서 단 하나의 lobule을 먹고, 서로 다른 초점 비행기에서 여러 개의 연속적인 이미지를 확보하는 데 사용할 수 있습니다. 다음 이미지는 하나의 스택과 왜곡을 제거하는 렌더링 소프트웨어로 압축 할 수 있습니다. 최종 합성 이미지는 분명 초점의 모든 보이는 patterning과 소뇌 표면 표현 패턴을 설명합니다. </li><li> PBS에 열중하면서 Wholemount 스테인드 조직 (또는를 줄 것이다 다른 미디어 군데해야최적의 굴절률). 쉽게 이미지에 대한 wholemount을 배치하기 위해서는 플라스틱 배양 접시에 1 %의 한천 젤합니다. 겔에 작은 구멍을 잘라 버릴거야. 구멍은 소뇌가 원하는 방향으로 끼여 수 있도록합니다. </li><li> 원시 데이터는 어도비 포토샵 CS4로 가져올 및 대비 및 밝기 수준으로 조정됩니다. </li></ol> 동물 모든 동물의 연구는 의학의 알버트 아인슈타인 대학에서 제도적 지침에 따라 승인된 IACUC 동물 프로토콜 하에서 수행되었다. 남성과 여성 outbred 스위스 웹스터 (Taconic, 알바니, 뉴욕) 생쥐는 우리 식민지 유지 및 모든 연구를 위해 사용되었습니다. Euthanized 성인 쥐가 친절 박사 Bryen 요르단 (의학 알버트 아인슈타인 대학)에 의해 제공되었다. 모든 동물은 한 달쯤 있었다. 4. 대표 결과 소뇌은 네 가로 구역으로 분자 표현으로하게 구분됩니다 :앞부분 영역 (AZ : ~ lobules IV), 중앙 영역 (CZ : ~ lobules VI-VII), 후부 영역 (PZ : ~ lobules VIII-IX 지느러미)와 마디가있는 영역 (NZ : ~ lobules IX 복부와 X ) 5. 각 영역 parasagittal 줄무늬 1,2,5,6 (그림 1)의 독특한 배열을 포함하고 있습니다. Purkinje 세포의 ZebrinII 표현은 AZ와 PZ (그림 2)와 CZ와 뉴질랜드 (그림 2) 유니폼을 표현의 줄무늬를 나타내고있다. Purkinje 세포의 parasagittal 조직은 수입 성의 섬유의 터미널 현장 지형 피지만. 코카인과 암페타민 - 규제 성적 증명서 (카트)이 펩타이드는 등산 섬유 (그림 3A)의 하위 집합으로 표현되는 소뇌 피질 7 (그림 3B)의 분자 층의 Purkinje 세포 dendrites의 줄무늬로 프로젝트. 같은 증폭 7 등 적절한 수정, 함께 wholemount 프로토콜은 옛 성은없이 olivocerebellar 패턴 시각화을 허용더럽히는 것 티슈 섹션 (그림 3B)에서 힘드는 시간이 소요 reconstructions위한 D. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4042/4042fig1.jpg" /> 그림 1. A. ZebrinII / aldolaseC 표현은 소뇌의 가로 섹션에 화살 밴드를 보여준다. 크기 조정 막대 = 500 μm의가. B. ZebrinII / aldolaseC은 Purkinje 세포 somata과 dendrites에만 표시됩니다. 스케일 바 = 150μm (GL = 세분화된 계층; PCL = Purkinje 세포 계층, ML = 분자 층). <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4042/4042fig2.jpg" /> 그림 2. ZebrinII / aldolaseC는 앞부분 (AZ), 중앙 (CZ), 그리고 소뇌의 후부 (PZ) 영역의 이미지에서 Purkinje 세포 줄무늬를 보여주는 동안 물들일 wholemount 소뇌. 여기에서 우리는 또한 소뇌를 nicking의 부정적인 결과의 예를 보여줍니다. 결과 artifactual 염색법이 표시됩니다빨간색 별표가있는. 스케일 바 = 1mm (LS = lobulus의 심플, PML = paramedian lobule; COP = 연결사 pyramidis). <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4042/4042fig3.jpg" /> 그림 3. A. 카트는 분자 층으로 섬유 터미널을 등산에 표시됩니다. 스케일 막대 = 100 μm의. (ML = 분자 층; PCL = Purkinje 세포 계층, GL = 세분화된 계층) 뉴질랜드에서 카트를 표현 B. Wholemount의 immunohistochemistry. 스케일 바 = 2mm (COP = 연결사 pyramidis; PML = paramedian lobule; PFL = paraflocculus; FL = 괴​​상).

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Physiol. 293, 639-650 (2007).</li><li>Coppola, E., Rallu, M., Richard, J., Dufour, S., Riethmacher, D., Guillemot, F., Goridis, C., Brunet, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epibranchial+ganglia+orchestrate+the+development+of+the+cranial+neurogenic+crest.">Epibranchial ganglia orchestrate the development of the cranial neurogenic crest.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. 107, 2066-2071 (2010).</li><li>Kubilus, J. K., Linsenmayer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+guidance+of+embryonic+corneal+innervation:+roles+of+Semaphorin3A+and+Slit2.">Developmental guidance of embryonic corneal innervation: roles of Semaphorin3A and Slit2.</a> Dev. Biol. 344, 172-184 (2010).</li><li>Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+mapping+of+afferent+topography+in+three+dimensions.">Fluorescence mapping of afferent topography in three dimensions.</a> Brain Struct. Funct. 216, 159-169 (2011).</li><li>Davis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+immunohistochemistry.">Whole-mount immunohistochemistry.</a> Methods Enzymol. 225, 502-516 (1993).</li></ol>

우리는 공개 할게 없다.

우리는 개발과 성인 두뇌의 의미 심장한 단백질 발현을위한 다목적 immunohistochemical 접근법을 사용해서 성공 wholemount의 염색법에 필요한 기술적인 세부 사항을 설명했습니다. 이 접근법을 사용하여 복잡한 분자 발현 패턴 분석 수 있으며 뇌 지형이 힘드는 시간이 소요되는 조직 sectioning 절차없이 평가. 이 프로토콜은 성인 1,2,8,9 및 조기 출생 후의 마우스 소뇌 10,11...

<table border="1"><tbody><tr><td> 자료 </td><td> 프로토콜의 기능 </td></tr><tr><td> 관류 펌프 (피셔 Scientific/13-876-2) </td><td> 일관성 있고 느린 재관류을 허용합니다. </td></tr><tr><td> 샤프 - 팁 가위 (FST/14081-08) </td><td> 관류 및 해부의 일반 사용합니다. </td></tr><tr><td> 무딘 물체 팁 포셉 (FST/91100-12) </td><td> 재관류 바늘의 삽입에 대한 마음을 안정합니다. </td></tr><tr><td> 집게 (뒤몽 AA/11210-10 의한 FST) </td><td> 두개골에서 뇌의 해부 중에 사용과 두뇌의 나머지 부분에서 소뇌를 분리. 그들은 해부 동안 소뇌의 손상을 최소화하는 데 도움이 약간 둥근 팁을 가지고 있기 때문에 이들은 필수적입니다. </td></tr><tr><td> Nutator (피셔 과학) </td><td> 인큐베이션 기간 동안 운동에 조직을 유지하는 데 사용됩니다. </td></tr><tr><td> 1.5 ML 튜브 (Sarstedt / 스크류 캡 마이크로 튜브) </td><td> 자신의 모든 단계tochemistry 프로토콜이 microtubes에서 열립니다. 둥근 바닥은 소뇌는 운동으로 유지한다는 보장합니다. </td></tr><tr><td> 다공 스푼 (FST/10370-17) </td><td> 부드럽게 보냈다 솔루션을 decanting 동안 microtubes에 wholemounts을 유지하는 데 사용됩니다. </td></tr><tr><td> Leica MZ16 FA 현미경 </td><td> wholemount 염색법을 검사하는 데 사용됩니다. </td></tr><tr><td> Leica DFC3000 FX 카메라 </td><td> wholemount 이미지를 캡처하는 데 사용됩니다. </td></tr></tbody></table> 표 1. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="9"> 전형 wholemount 실험에 대한 예제 달력 </td></tr><tr><td> 1 일 </td><td colspan="4"> 덴트의 수정, 실온 8 시간 </td><td colspan="4"> 덴트의 표백제, 4 ° C, 하룻밤 </td></tr><tr><td> 날 2 </td><td colspan="3"> 백퍼센트 MeOH, 실내 온도, 배, 30 분 각각 </td><td colspan="3"> 100 % MeOH, 프리즈 / 해동, 4X, 30 min/15 분 </td><td colspa<html> N = &quot;2&quot;&gt; 100 % MeOH, -80 ° C, 하룻밤 </td></tr><tr><td> 3 일 </td><td> 50% MeOH/50 % PBS, 실온, 60-90 분 </td><td colspan="2"> 15% MeOH / 85% PBS, 실온, 60-90 분 </td><td colspan="2"> 백퍼센트 PBS, 실온, 60-90 분 </td><td> PBS의 10μg/mL Proteinase K, 실내 온도, 2-3 분 </td><td> 배 백퍼센트 PBS, 실온, 10 분 각각 </td><td> 하룻밤 PMT, 4 ° C, </td></tr><tr><td> 일 4-5 </td><td colspan="8"> PMT + 1 ° 항체 + 5퍼센트 DMSO, 4 ° C, 48 시간 </td></tr><tr><td> 6 일 </td><td colspan="3"> PMT, 4 ° C, 2 - 3 배, 2-3 시간마다 </td><td colspan="5"> PMT + 2 ° 항체 + 5퍼센트 DMSO, 4 ° C, 24 시간 (또는 ABC 복잡한와 증폭 단계를 시작합니다) </td></tr><tr><td> 7 일 </td><td colspan="2"> PMT, 4 ° C, 2 - 3 배, 2-3 시간마다 </td><td colspan="3"> PBT, 실온, 2 시간 </td><td colspan="3"> 최적의 염색법이 시각까지 PBS에서 신선한 DAB에 품어 </td></tr></tbody></table>_content &quot;&gt; 표 2. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> 조리법은 (* = 매번 신선한 준비) </td></tr><tr><td> PBS (인산염은 염분 버퍼) </td><td> 0.1M 인산염은 탈이온수에 염분 버퍼. 산도 7.2 (시그마 정제, P4417) </td></tr><tr><td> PFA (Paraformaldehyde) </td><td> 제작 및 저장 작업 솔루션을 PBS 4 %로 희석 후 20 %의 솔루션으로 동결하고 (; T353 피셔 과학) </td></tr><tr><td> 덴트의 정착액 3 * </td><td> 4 개로 메탄올 한 부분 dimethylsulfoxide (DMSO, 피셔 과학, D159-4) </td></tr><tr><td> 덴트의 블리치 3 * </td><td> 4 개로 메탄올 한 부분 dimethylsulfoxide (DMSO, 피셔 과학, D159-4) 한 부분은 30 % 과산화수소 </td></tr><tr><td> 효소 소화 </td><td> 10 μg / Proteinase K (로슈 진단, 03,115,828,001)의 ML PBS 인치 </td></tr><tr><td> PBST </td><td> PBS 포함 : 0.1 % 십대 초반-20 (FisheR 과학, BP337, 트리톤은 모든 인스턴스에서 십대 초반-20 대신에도 사용할 수 있습니다.) </td></tr><tr><td> PMT는 25 * </td><td> PBS 포함 : 2퍼센트 무지방 탈지 우유 분말 (카네이션은 우대) 0.1 % 십대 초반-20 (피셔 과학, BP337) </td></tr><tr><td> PBT 25 * </td><td> PBS 포함 : 0.2 % 소 혈청 알부민 (시그마; B9001S) 0.1 % 십대 초반-20 (피셔 과학, BP337) </td></tr><tr><td> DAB * </td><td> PBS의 40 ML에서, 3,3-diaminobenzidine 중 10 밀리그램 정제 (D5905 시그마 - 올드 리치)를 해산. ) 반응을 촉진시키기 위해서 30 % 과산화수소 10 μl를 추가합니다. </td></tr><tr><td> ABC 복합 솔루션 </td><td> Vectastain 키트 (벡터 실험실, INC, PK-4000) </td></tr></tbody></table> 표 3.

wholemount immunohistochemistry for revealing complex brain topography

소뇌의 반복이고 잘 이해 셀룰러 아키텍처는 뇌의 지형을 탐험하는 데 이상적인 모델 시스템을 확인합니다. 그것의 비교적 균일한 cytoarchitecture 밑에는 유전자 및 단백질 표현의 parasagittal 도메인의 복잡한 배열입니다. 소뇌의 분자 compartmentalization는 수입 성의 섬유의 해부 학적 및 기능적 조직 피지만. 완전히 소뇌 조직의 복잡도를 감사하기 위해 우리는 이전에 마우스 소뇌의 patterning 결함의 높은 처리량 분석을위한 wholemount 염색법 방식을 정제. 이 프로토콜은 상세히 시약, 도구 및 성공적 wholemount immunostaining를 사용하여 성인 마우스 소뇌에서 단백질 발현 패턴을 표시하는 방법으로 유용 실용적인 단계를 설명합니다. 단계는 여기에서 뇌의 미세 지형이 그 드러날 수있는 방법의 예로 zebrinII / aldolaseC의 표현을 사용하여이 방법의 유틸리티를 입증 강조네이티브 입체 형태. 또한 설명은 분자 지형의 비교 연구를위한 수입 성의 전망 및 대형 cerebella의 단백질 표현의 시각화 수 있도록 프로토콜에 adaptations 있습니다. 이러한 응용 프로그램을 설명하기 위해 쥐의 소뇌의 수입 성의 염색법의 데이터가 포함되어 있습니다.

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Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography

신경 회로는 topographically 특정 분자 프로필과 기능적 구획으로 구성되어 있습니다. 여기서는 다양한 wholemount immunohistochemical 염색법 접근 방식을 사용하여 글로벌 뇌의 지형을 드러내는을위한 실용적이고 기술적인 단계를 제공합니다. 우리는 잘 이해 cytoarchitecture과 소뇌의 회로를 사용하는 방법의 유틸리티를 보여줍니다.

의미 심장한 복잡한 두뇌 지형에 대한 Wholemount Immunohistochemistry

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its ...

wholemount-immunohistochemistry-for-revealing-complex-brain-topography

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.5K 조회수.  Albert Einstein College of Medicine, Yeshiva University. 신경 회로는 topographically 특정 분자 프로필과 기능적 구획으로 구성되어 있습니다. 여기서는 다양한 wholemount immunohistochemical 염색법 접근 방식을 사용하여 글로벌 뇌의 지형을 드러내는을위한 실용적이고 기술적인 단계를 제공합니다. 우리는 잘 이해 cytoarchitecture과 소뇌의 회로를 사용하는 방법의 유틸리티를 보여줍니다.

비디오: Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography

The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an extensively studied model system for understanding the behavior of neural stem cells and the regulation of adult neurogenesis. Traditionally, these studies have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region. Compared to sections, wholemounts preserve the complete cytoarchitecture and cellular relationships within the SVZ. This approach has recently revealed that the adult neural stem cells, or type B1 cells, are part of a mixed neuroepithelium with differentiated ependymal cells lining the lateral ventricles. In addition, this approach has been used to study the planar polarization of ependymal cells and the cerebrospinal fluid flow they generate in the ventricle. With recent evidence that adult neural stem cells are a heterogeneous population that is regionally specified, the wholemount approach will likely be an essential tool for understanding the organization and parcellation of this stem cell niche.

The lateral ventricle walls contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. Traditionally, studies on neurogenesis in this region have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region.

Subventricular 존 엉 - 얼굴 : Wholemount 스테 이닝 및 Ependymal 흐름

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an ...

연구

신경과학

Revealing Neural Circuit Topography in Multi-Color

Neural circuits are organized into functional topographic maps. In order to visualize complex circuit architecture we developed an approach to reliably label the global patterning of multiple topographic projections. The cerebellum is an ideal model to study the orderly arrangement of neural circuits. For example, the compartmental organization of spinocerebellar mossy fibers has proven to be an indispensable system for studying mossy fiber patterning. We recently showed that wheat germ agglutinin (WGA) conjugated to Alexa 555 and 488 can be used for tracing spinocerebellar mossy fiber projections in developing and adult mice (Reeber et al. 2011). We found three major properties that make the WGA-Alexa tracers desirable tools for labeling neural projections. First, Alexa fluorophores are intense and their brightness allows for wholemount imaging directly after tracing. Second, WGA-Alexa tracers label the entire trajectory of developing and adult neural projections. Third, WGA-Alexa tracers are rapidly transported in both retrograde and anterograde directions. Here, we describe in detail how to prepare the tracers and other required tools, how to perform the surgery for spinocerebellar tracing and how best to image traced projections in three dimensions. In summary, we provide a step-by-step tracing protocol that will be useful for deciphering the organization and connectivity of functional maps not only in the cerebellum but also in the cortex, brainstem, and spinal cord.

We provide a practical guide for delivering tracers in vivo and use the spinocerebellar pathway as a model system to demonstrate essential steps for successful neuronal circuit analysis in mice. We describe in detail our versatile tracing protocol that exploits wheat germ agglutinin (WGA) conjugated to Alexa fluorophores.

멀티 컬러의 신경 회로 지형을 공개

Neural circuits are organized into functional topographic maps. In order to visualize complex circuit architecture we developed an approach to reliably ...

Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for immunohistochemistry and, 2) calcium imaging for the study of voltage gated calcium channel (VGCC) mediated calcium signaling in retinal ganglion cells. The calcium imaging method we describe circumvents issues concerning non-specific loading of displaced amacrine cells in the ganglion cell layer.

Immunohistochemistry protocols are used to study the localization of a specific protein in the retina. Calcium imaging techniques are employed to study calcium dynamics in retinal ganglion cells and their axons.

Wholemount 쥐의 망막에서 면역 조직 화학 및 칼슘 이미징 방법

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

이후 Wholemount을위한 완벽한 척수 손상 및 뇌 해부 프로토콜<em&gt; 제자리에서</em&gt; 애벌레 바다 장어의 하이브리드

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brain tissue, using markers for microglia and neuronal elements as an example. Specifically, this paper is a step-by-step protocol for fluorescent visualization of microglia and neurons via immunohistochemistry for Iba1 and Pan-neuronal, respectively. Fluorescence double-labeling is particularly useful for the localization of multiple proteins within the same sample, providing the opportunity to accurately observe interactions between cell types, receptors, ligands, and/or the extracellular matrix in relation to one another as well as protein co-localization within a single cell. Unlike other visualization techniques, fluorescence immunohistochemistry staining intensity may decrease in the weeks to months following staining, unless appropriate precautions are taken. Despite this limitation, in many applications fluorescence double-labeling is preferred over alternatives such as 3,3&#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) or alkaline phosphatase (AP), as fluorescence is more time efficient and allows for more precise differentiation between two or more markers. The discussion includes troubleshooting tips and advice to promote success.

This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example.

미세 아교 세포와 신경 세포에 대한 예 염색 : 저온 절단 된 쥐의 뇌 조직에서 면역 조직 화학에 대한 입문서

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result of chemical inputs to its synapses. However, neurons can also be excited by an imposed electric field. In particular, recent clinical applications activate neurons by creating an electric field externally. It is therefore of interest to investigate how the neuron responds to the external field and what causes the action potential. Fortunately, precise and controlled application of an external electric field is possible for embryonic neuronal cells that are excised, dissociated and grown in cultures. This allows the investigation of these questions in a highly reproducible system.
In this paper some of the techniques used for controlled application of external electric field on neuronal cultures are reviewed. The networks can be either one dimensional, i.e. patterned in linear forms or allowed to grow on the whole plane of the substrate, and thus two dimensional. Furthermore, the excitation can be created by the direct application of electric field via electrodes immersed in the fluid (bath electrodes) or by inducing the electric field using the remote creation of magnetic pulses.

Neuronal cultures are a good model for studying emerging brain stimulation techniques via their effect on single neurons or a population of neurons. Presented here are different methods for stimulation of patterned neuronal cultures by an electric field produced directly by bath electrodes or induced by a time-varying magnetic field.

전기 단일 및 두 개 차원 문화에 자기장을 사용하여 신경 세포의 외부인가 전압

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

면역 조직 화학 및 전자 현미경을 사전은 임베딩에 대한 비 인간 영장류 뇌 조직의 준비

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent development of thin, flexible ECoG electrodes has enabled conduction of stable recordings of large-scale cortical activity. We have developed a whole-cortical ECoG array for the common marmoset. The array continuously covers almost the entire lateral surface of cortical hemisphere, from the occipital pole to the temporal and frontal poles, and it captures whole-cortical neural activity in one shot. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain. Marmosets have two advantages regarding ECoG recordings, one being the homologous organization of anatomical structures in humans and macaques, including frontal, parietal, and temporal complexes. The other advantage is that the marmoset brain is lissencephalic and contains a large number of complexes, which are more difficult to access in macaques with ECoG, that are exposed to the brain surface.These features allow direct access to most cortical areas beneath the surface of the brain. This system provides an opportunity to investigate global cortical information processing with high resolutions at a sub-millisecond order in time and millimeter order in space.

We have developed a whole-cortical electrocorticographic array for the common marmoset that continuously covers almost the entire lateral surface of cortex, from the occipital pole to the temporal and frontal poles. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain.

일반적인 마모 셋에 전체 피 질 Electrocorticographic 배열의 만성 이식

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for determining the mechanisms underlying retinal diseases. Maintaining structural integrity throughout the tissue preparation is vital for obtaining reproducible retinal IHC data but can be challenging due to the fragility and complexity of retinal cytoarchitecture. Strong fixatives like 10% formalin or Bouin's solution optimally preserve the retinal structure, they often impede IHC analysis by enhancing the background fluorescence and/or diminishing antibody-epitope interactions, a process known as epitope masking. Milder fixatives, on the other hand, like 4% paraformaldehyde, reduces background fluorescence and epitope-masking, meticulous dissection techniques must be utilized to preserve the retinal structure. In this article, we present a comprehensive method to prepare mouse ocular posterior cups for IHC that is sufficient to preserve most antibody-epitope interactions without loss of retinal structural integrity. We include representative IHC with antibodies to various retinal cell type markers to illustrate tissue preservation and orientation under optimal and sub-optimal conditions. Our goal is to optimize IHC studies of the retina by providing a complete protocol from ocular posterior cup dissection to IHC.

This report describes comprehensive methods for preparing frozen mouse retina sections for immunohistochemistry (IHC). Methods described include dissection of the ocular posterior cup, paraformaldehyde fixation, embedding in Optimal Cutting Temperature (OCT) media and tissue orientation, sectioning and immunostaining.

면역 조직 화학을 위한 마우스 망막 극저온 단면도 단면도의 준비

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

성인 소뇌 슬라이스에 장기 우울증 유도의 평가

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...