RVS è sostenuta da investigatore nuova start-up fondi da Albert Einstein College of Medicine della Yeshiva University.

1. Animal perfusione e dissezione Cervelletto <ol><li> A seconda della proteina, perfusione può essere essenziale per 1,2 colorazione successo. Perfusione transcardiaca è invasivo, non la sopravvivenza procedura che richiede il corretto uso di anestetici. Corretta formazione, approvazione istituzionale, e l&#39;approvazione IACUC sono tutte necessarie prima di tentare la procedura. E &#39;sempre una buona idea di consultare i veterinari dell&#39;ente per ottenere aiuto per identificare i requisiti sperimentali e l&#39;acquisizione di un corretto allenamento. Prima della procedura, l&#39;animale deve essere profondamente anestetizzati e non risponde agli stimoli, come a piedi o pizzico coda. Utilizzando forbici fare un taglio nella pelle addominale e parete muscolare e quindi continuare ad aprire la gabbia toracica, tagliando appena adiacente allo sterno su ogni lato. Inoltre, il sperimentatore può creare un più ampio spazio utile interno tagliando la fascia che circonda la membrana. Sollevando la parete addominale e toracica superiorly, il cuore sarà ora esposto. Effettuare un piccolo taglio nell&#39;atrio destro per permettere al sangue di fluire e immediatamente inserire l&#39;ago perfusione nel ventricolo sinistro. Una pompa idrostatica di base è preferito fornire le soluzioni di perfusione (vedi Tabella 1 per i dettagli). In primo luogo, lavare il sangue con fosfato 0,1 M soluzione salina tamponata (PBS, vedi Tabella 3) fino a quando il liquido si chiaro. Quindi, spegnere la pompa idrostatica, passare velocemente il tubo di mandata soluzione ad un contenitore del 4% paraformaldeide (PFA, vedi Tabella 3) diluito in PBS e poi girare la pompa a consegnare il fissativo. L&#39;uso di una pompa non è necessaria: con la pratica, due siringhe riempito con PBS e il 4% PFA possono essere usati per fornire lentamente le soluzioni. </li><li> È fondamentale sezionare accuratamente il cervello dal cranio senza introdurre alcuna lesione al tessuto. Anche le piccole lacerazioni al cervello durante la dissezione amplierà gradualmente nelle fessure visibili cheanticorpi trappola e causare macchie artefatti durante la lavorazione del tessuto (ad esempio asterischi rossi in figura 2). Per dissezioni cerebellari, è tipico per tagliare la pelle lungo il centro della testa e poi delicatamente provocare gli lembi parte per esporre il cranio. Tagliare il cranio da anteriore a posteriore lungo la linea mediana dorsale, e anche lateralmente lungo entrambi i lati del cranio. Non tagliare oltre il bregma come questo corre il rischio di intaccare il cervelletto. Utilizzando pinze sollevare delicatamente la parte anteriore del cranio fuori dal cervello facendo attenzione a non strappare il tessuto cerebrale che è collegato alle meningi. Recidere i nervi cranici sul lato ventrale del cervello. </li><li> Separazione del cervelletto dal resto del cervello è importante per due motivi. In primo luogo, esso consente di esplorazione di pattern di espressione nei lobuli anteriori, che sono nascosti alla vista dal collicoli in situ. La seconda è che separare il tessuto in più piccole, le regioni isolate consente more fissaggio completo, che può facilitare la colorazione di alcune proteine. Durante questa fase la dissezione finale, si deve prestare attenzione a non toccare il cervelletto con le punte della pinza. Inserire le punte di un paio di pinze in mezzo ai collicoli superiori e inferiori. Con una seconda serie di pinze lentamente stuzzicare via il collicoli inferiore del cervelletto. Poi, c&#39;era il cervelletto in modo che il suo lato anteriore sia rivolto verso il basso e il tronco cerebrale sia rivolto verso l&#39;alto. Inserire le pinze nel quarto ventricolo tra il tronco encefalico e lobuli IX / X del cervelletto. Tagliare i peduncoli da pizzicare con le pinze da entrambi i lati e poi sollevare delicatamente il cervelletto dal tronco encefalico. Una volta che il cervelletto è isolato, post-fissare mediante immersione in PFA 4% a 4 ° C per un minimo di 24-48 ore. Il cervelletto può essere memorizzato in PFA 4% per un periodo prolungato di tempo. Le meningi devono essere rimossi prima o dopo colorazione per una migliore visibilità dei pattern di espressione.Se il sperimentatore sceglie di rimuovere le meningi prima della colorazione vi è una forte possibilità che il cervelletto verranno intaccate durante il processo. Rimossi i meningi al termine della procedura di colorazione è molto più semplice poiché diventano più facile individuare dopo acquisiscono una debole colorazione di fondo diventano fragili e post-elaborazione. </li></ol> 2. Elaborazione del tessuto per la colorazione Wholemount Poiché il metodo di colorazione wholemount richiede più di colorazione immunoistochimica di sezioni di tessuto, è utile programmare i tempi per ciascuno degli esperimenti, come mostrato nel calendario esempio fornito (Tabella 2). Prima di iniziare, ci sono diverse cose importanti da tenere a mente. 1) Le microprovette contenenti il ​​tessuto deve essere ruotato su un nutator in qualsiasi momento, tranne durante il congelamento / scongelamento processo. 2) Diverse soluzioni devono essere fresco per ogni esperimento (vedi Tabella 3 per le ricette di soluzione). 3)In tutto il protocollo, quando si cambia soluzioni, delicatamente versare la soluzione esausta, piuttosto che rimuovere il cervelletto con le pinze, per evitare di toccare il cervelletto. Poi, dopo la miscelazione la nuova soluzione in un altro contenitore, una pipetta per aggiungere lentamente la soluzione fresca al tubo. 2,1 Giorno 1: <ol class="lalpha"><li> Fissare il cervelletto in 3 fix Dent a temperatura ambiente per 6-8 ore dondolandosi dolcemente sulla nutator. Se il metanolo è distruttivo per il vostro antigene, sostituire i passaggi attraverso 2.1a 2.3a con un metodo di recupero antigene. Il calore e tamponi utilizzati per il recupero dell&#39;antigene contribuirà a preparare il tessuto per la penetrazione degli anticorpi. </li><li> Bleach Bleach del cervelletto in Dent a 3 notte a 4 ° C. </li></ol> 2,2 Giorno 2: <ol class="lalpha"><li> Disidratare il cervelletto in due turni di 100% MeOH a temperatura ambiente per 30 minuti ciascuno. </li><li> Quindi, per migliorare la penetrazione delle soluzioni, soggettoil tessuto ad una serie di congelamento / scongelamento. Posizionare il tubo in un contenitore con ghiaccio secco e congelare per 30 min. Quindi, rimuovere il tubo e lasciarlo a temperatura ambiente in panchina per 15 minuti. Il gelo / disgelo passo deve essere effettuata quattro volte (almeno). </li><li> Dopo l&#39;ultimo scongelamento del tessuto, inserire il tubo in un congelatore a -80 ° C per una notte. </li><li> Il tessuto può essere immagazzinato per lunghi periodi di tempo a -80 ° C o immediatamente prima o dopo il congelamento / scongelamento passi. In caso contrario, il protocollo deve essere continuato. </li></ol> 2,3 Giorno 3: <ol class="lalpha"><li> Reidratare il cervelletto mediante lavaggio in 50% MeOH/50% PBS, 15% MeOH/85% PBS, e il 100% PBS per 60-90 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Successivamente, per l&#39;adulto del mouse cervelletti, soggetti del tessuto alla digestione enzimatica con proteinasi K 10μg/ml in PBS per 2-3 minuti. Nessun passo è necessario per la digestione cervelletti di animali giovani (P5 o più giovani nel topo). Più digestion è consigliato per i più grandi cervelli. Ad esempio, la digestione può essere l&#39;altezza di 5-6 minuti per cervello dei primati 4. </li><li> Dopo la digestione, immediatamente lavare il cervelletto in PBS tre volte per 10 minuti ciascuno a temperatura ambiente per rimuovere la proteinasi K. </li><li> Bloccare il tessuto in PMT (vedi Tabella 3) notte a 4 ° C. Il latte in polvere è spesso la prima scelta quando si seleziona un agente bloccante di lavoro proteina perché è poco costoso, riduce effettivamente la colorazione di fondo, e tipicamente non interferisce con il legame anticorpo o l&#39;accesso al antigene. Sieri animali possono anche essere utilizzati, sebbene la sperimentatore deve essere a conoscenza dei costi aggiuntivi e devono prima verificare la qualità siero per cross-reattivi immunoglobuline e capacità di produrre un segnale ottimale rispetto al rumore. </li></ol> 2,4 Giorno 4-5: <ol class="lalpha"><li> Incubare il tessuto in anticorpi primari diluiti in PMT supplementati con DMSO 5% per 48 ore a 4 ° C (Larger cervelletti richiederà tempi di incubazione maggiore). </li></ol> 2,5 6 ° giorno: <ol class="lalpha"><li> Lavare il cervelletto 2-3 volte per 2-3 ore ciascuno in PMT a 4 ° C per rimuovere gli anticorpi non legati primari. </li><li> Quindi, incubare il tessuto in anticorpi secondari in una soluzione contenente PMT con DMSO 5% a 4 ° C per una notte (maggiore cervelletti può richiedere tempi di incubazione aumento). </li></ol> 2,6 Giorno 7: <ol class="lalpha"><li> Lavare il cervelletto 2-3 volte per 2-3 ore ciascuno in PMT a 4 ° C. </li><li> Dare il tessuto un lavaggio finale con PBT (cfr. tabella 3) per 1-2 ore. Questo passaggio elimina il latte in eccesso e migliora la chiarezza della colorazione. </li><li> Infine, incubare il tessuto in DAB (3,3 &#39;-diaminobenzidina) soluzione fino alla intensità di colorazione ottimale è raggiunta. Il prodotto di reazione marrone deve essere chiaramente visibile in ~ 10 minuti. E &#39;meglio usare DAB al buio come la luce fa sì che il cromogeno precipitazionete, che possono aumentare la colorazione di fondo. </li></ol> 2,7 Quando l&#39;intensità di colorazione ottimale è raggiunta, arrestare la reazione inserendo il cervelletto in PBS con 0,04% di sodio azide. Il tessuto può essere immagazzinato a lungo termine in questa soluzione. La sodio azide è un potente inibitore della crescita batterica, ma dovrebbe essere evitato fino a questo passo dal momento che inibisce anche perossidasi di rafano. 2,8 procedura di amplificazione Optional: seguire il protocollo normale, ma queste procedure devono essere eseguite in luogo di passi 2.5b-2.7 di cui sopra. <ol class="lalpha"><li> Incubare il tessuto notte a 4 ° C in anticorpi secondari coniugati biotina-in PBST (vedi Tabella 3) con 5% di DMSO. </li><li> Lavare il tessuto per 2-3 ore ciascuno in cambiamenti di PBST 3-4 a temperatura ambiente. </li><li> Incubare il cervelletto notte a 4 ° C in soluzione ABC complessa in PBST. </li><li> Sciacquare il tessuto per 2-3 ore ciascuno atemperatura ambiente in 3-4 variazioni di PBS. </li><li> Incubare il tessuto appena preparata in soluzione DAB, come descritto sopra. </li><li> Quando la colorazione è ottimale, arrestare la reazione mediante lavaggio del cervelletto in PBS con 0,04% di sodio azide. </li></ol> 3. Imaging del Tissue Stained <ol><li> Wholemount immagini possono essere catturate utilizzando, ad esempio, una macchina fotografica Leica DFC3000 FX montata su uno stereomicroscopio Leica MZ16 FA esecuzione Leica Application Suite software FX. Se desiderato, microscopia deconvoluzione può essere utilizzato per acquisire più immagini consecutive in differenti piani focali, con ogni immagine avente solo un singolo lobo a fuoco fresco. Poi, le immagini possono essere compressi in un unico stack e software reso per rimuovere la distorsione. L&#39;immagine composita finale illustrerà cerebellari pattern di espressione superficie con tutti i patterning visibile in chiaro focus. </li><li> Tessuto tinto Wholemount deve essere ripreso mentre si è immersi in PBS (o altro supporto che darà unindice di rifrazione ottimale). Al fine di posizionare facilmente il wholemount per l&#39;imaging, fare un gel di agar 1% in una capsula Petri di plastica. Tagliare piccoli fori nel gel. I fori che permettono il cervelletto di essere incuneato l&#39;orientamento desiderato. </li><li> I dati grezzi vengono importati in Adobe Photoshop CS4 e rettificato per livelli di contrasto e luminosità. </li></ol> Animali Tutti gli studi sugli animali sono stati effettuati nel quadro di un protocollo approvato animale IACUC secondo le linee guida istituzionali di Albert Einstein College of Medicine. Maschio e femmina outbred svizzera Webster (Taconic, Albany, NY), i topi sono stati mantenuti nella nostra colonia e utilizzata per tutti gli studi. Ratti adulti eutanasia sono stati gentilmente forniti dal Dr. Bryen Jordan (Albert Einstein College of Medicine). Tutti gli animali sono stati almeno un mese. 4. Risultati rappresentativi Il cervelletto è compartimentato mediante l&#39;espressione molecolare in quattro zone trasversali:la zona anteriore (AZ: ~ lobuli IV), la zona centrale (CZ: ~ lobuli VI-VII), la zona posteriore (PZ: ~ lobuli VIII-IX dorsale) e la zona nodulare (NZ: ~ lobuli ventrale IX e X ) 5. Ogni zona contiene una serie unica di parasagittale strisce 1,2,5,6 (Fig. 1). ZebrinII espressione in cellule di Purkinje rivela strisce in AZ e PZ (Fig. 2) e l&#39;espressione uniforme in CZ e NZ (Fig. 2). L&#39;organizzazione parasagittale delle cellule di Purkinje si riflette la topografia settore terminale delle fibre afferenti. Cocaina e anfetamine regolamentato trascrizione (CART) peptide è espresso in sottoinsiemi di fibre rampicanti (Fig. 3a) che il progetto di strisce di dendriti delle cellule di Purkinje nello strato molecolare della corteccia cerebellare 7 (Fig. 3b). Con le opportune modifiche, come amplificazione 7, il protocollo wholemount permette la visualizzazione dei modelli olivocerebellar senza need per un laborioso che richiede tempo, ricostruzioni provenienti da sezioni di tessuto colorazione (Fig. 3b). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4042/4042fig1.jpg" /> Figura 1. A. ZebrinII / aldolaseC espressione rivela bande sagittali in sezioni trasversali del cervelletto. Scala bar = 500 micron. B. ZebrinII / aldolaseC è espresso esclusivamente in somata cellule di Purkinje e dendriti. Scale bar = 150μm (gl = strato granulare; pcl = strato di cellule di Purkinje; ml = strato molecolare). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4042/4042fig2.jpg" /> Figura 2. Un cervelletto wholemount colorate per ZebrinII / aldolaseC mostrando strisce di cellule di Purkinje in immagini la parte anteriore (AZ), centrale (CZ) e posteriori (PZ) zone del cervelletto. Qui mostriamo anche un esempio di conseguenza negativa di intaccare la cervelletto. La colorazione risultante artefatta è indicatacon asterischi rossi. Barra della scala = 1 mm (LS = simplex lobulus; PML = paramediana lobulo; COP = copula pyramidis). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4042/4042fig3.jpg" /> Figura 3. CART A. è espresso in arrampicata terminali di fibre nello strato molecolare. Scala bar = 100 micron. (Ml = strato molecolare; pcl = strato di cellule di Purkinje, gl = strato granulare) B. Wholemount immunoistochimica di espressione CART in NZ. Barra della scala = 2 mm (COP = copula pyramidis; PML = paramediana lobulo; PFL = paraflocculus; FL = flocculo).

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Non abbiamo nulla da rivelare.

Abbiamo descritto i dettagli tecnici necessari per la colorazione wholemount successo con un approccio versatile immunoistochimica per l&#39;espressione delle proteine ​​rivelatrici nel cervello in via di sviluppo e adulti. Usando questo approccio, complessi schemi di espressione molecolari possono essere analizzati e topografia cervello apprezzato senza la necessità di procedure tessuti laboriose e richiedono tempo sezionamento. Questo protocollo è stato usato per rivelare l&#39;espre...

<table border="1"><tbody><tr><td> Materiale </td><td> Funzione nel protocollo </td></tr><tr><td> Perfusione pompa (Fisher Scientific/13-876-2) </td><td> Consente di perfusione costante e lento. </td></tr><tr><td> Sharp punta-Forbici (FST/14081-08) </td><td> Uso generale della perfusione e dissezione. </td></tr><tr><td> Blunt-tip Pinza (FST/91100-12) </td><td> Per stabilizzare il cuore per l&#39;inserimento dell&#39;ago perfusione. </td></tr><tr><td> Pinza (FST da Dumont AA/11210-10) </td><td> Per l&#39;uso durante la dissezione del cervello dal cranio e per separare il cervelletto dal resto del cervello. Questi sono essenziali perché hanno una punta leggermente arrotondata, che aiuta a minimizzare i danni al cervelletto durante la dissezione. </td></tr><tr><td> Nutator (Fisher Scientific) </td><td> Utilizzato per mantenere i tessuti in movimento durante i periodi di incubazione. </td></tr><tr><td> 1,5 ml di tubo (Sarstedt / Tappo a vite Micro Tube) </td><td> Tutte le fasi del suotochemistry protocollo si svolgono in questi microprovette. Il fondo arrotondato assicura che il cervelletto rimane in movimento. </td></tr><tr><td> Mestolo forato (FST/10370-17) </td><td> Usato per mantenere wholemounts nelle microprovette mentre delicatamente decantazione la soluzione esausta. </td></tr><tr><td> Leica MZ16 FA microscopio </td><td> Utilizzato per esaminare la colorazione wholemount. </td></tr><tr><td> Leica DFC3000 fotocamera FX </td><td> Permette di catturare immagini wholemount. </td></tr></tbody></table> Tabella 1. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="9"> Calendario Esempio di un esperimento tipico wholemount </td></tr><tr><td> Giorno 1 </td><td colspan="4"> Dent fix, temperatura ambiente, 8 ore </td><td colspan="4"> Dent candeggina, 4 ° C, overnight </td></tr><tr><td> Giorno 2 </td><td colspan="3"> 100% MeOH, temperatura ambiente, 2x, ogni 30 min </td><td colspan="3"> MeOH 100%, gelo / disgelo, 4x, 30 min/15 min </td><td colspa<html> n = &quot;2&quot;&gt; 100% MeOH, -80 ° C, overnight </td></tr><tr><td> Giorno 3 </td><td> 50% MeOH/50% PBS, temperatura ambiente, 60-90 min </td><td colspan="2"> 15% MeOH / 85% PBS, temperatura ambiente, 60-90 min </td><td colspan="2"> 100% PBS, temperatura ambiente, 60-90 min </td><td> 10μg/mL proteinasi K in PBS, temperatura ambiente, 2-3 min </td><td> 100% PBS, temperatura ambiente, 3x, 10 min ciascuno </td><td> PMT, 4 ° C, overnight </td></tr><tr><td> Giorno 4-5 </td><td colspan="8"> PMT + 1 ° anticorpo + 5% DMSO, 4 ° C, 48 ore </td></tr><tr><td> Giorno 6 </td><td colspan="3"> PMT, 4 ° C, 2-3x, 2-3 ore ciascuna </td><td colspan="5"> PMT + 2 ° anticorpo + 5% DMSO, 4 ° C, 24 ore (o iniziare fasi di amplificazione con ABC complesso) </td></tr><tr><td> 7 ° giorno </td><td colspan="2"> PMT, 4 ° C, 2-3x, 2-3 ore ciascuna </td><td colspan="3"> PBT, temperatura ambiente, 2 ore </td><td colspan="3"> Incubare in DAB fresco in PBS fino colorazione ottimale è visualizzato </td></tr></tbody></table>_content &quot;&gt; Tabella 2. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Ricette (* = preparare fresca ogni volta) </td></tr><tr><td> PBS (tampone fosfato salino) </td><td> 0.1M soluzione salina tampone fosfato in acqua deionizzata. pH 7.2 (Sigma compresse; P4417) </td></tr><tr><td> PFA (paraformaldeide) </td><td> Prodotto congelato e memorizzati come una soluzione al 20% e poi diluita al 4% in PBS per la soluzione di lavoro (Fisher Scientific, T353) </td></tr><tr><td> Dent Fissante 3 * </td><td> 4 parti di metanolo 1 parte dimetilsolfossido (DMSO, Fisher Scientific, D159-4) </td></tr><tr><td> Dent Bleach 3 * </td><td> 4 parti di metanolo 1 parte dimetilsolfossido (DMSO, Fisher Scientific, D159-4) 1 parte di perossido di idrogeno 30% </td></tr><tr><td> Digestione enzimatica </td><td> 10 ug / ml di proteinasi K (Roche Diagnostics; 03.115.828,001 mila) in PBS. </td></tr><tr><td> PBST </td><td> PBS contenente: 0,1% Tween-20 (Fisher Scientific, BP337, Triton può anche essere usato al posto di Tween-20 in tutti i casi). </td></tr><tr><td> PMT 25 * </td><td> PBS contenente: 2% senza grassi del latte scremato in polvere (Carnation preferito) 0,1% Tween-20 (Fisher Scientific; BP337) </td></tr><tr><td> PBT 25 * </td><td> PBS contenente: 0,2% bovino (Sigma; B9001S) albumina sierica 0,1% Tween-20 (Fisher Scientific; BP337) </td></tr><tr><td> DAB * </td><td> Sciogliere una compressa da 10 mg di 3,3-diaminobenzidina (Sigma-Aldrich, D5905) in 40 ml di PBS. Aggiungere 10 pl di perossido di idrogeno al 30% per iniziare la reazione). </td></tr><tr><td> ABC soluzione complessa </td><td> Vectastain kit (Vector Laboratories, Inc; PK-4000) </td></tr></tbody></table> Tabella 3.

wholemount immunohistochemistry for revealing complex brain topography

L&#39;architettura ripetuto e ben compreso cellulare del cervelletto ne fanno un sistema modello ideale per esplorare la topografia del cervello. Alla base della sua citoarchitettura relativamente uniforme è una complessa serie di domini parasagittali del gene e l&#39;espressione delle proteine. La compartimentazione molecolare del cervelletto si riflette l&#39;organizzazione anatomica e funzionale delle fibre afferenti. Per apprezzare pienamente la complessità di organizzazione cerebellare in precedenza abbiamo affinato un approccio wholemount colorazione ad alto rendimento per l&#39;analisi dei difetti di patterning nel cervelletto mouse. Questo protocollo descrive in dettaglio i reagenti, strumenti e misure pratiche che sono utili per rivelare con successo pattern di espressione delle proteine ​​nel cervelletto topo adulto utilizzando immunostaining wholemount. I passaggi qui evidenziati dimostrare l&#39;utilità di questo metodo utilizza l&#39;espressione di zebrinII / aldolaseC come esempio di come la topografia sottile del cervello può essere rivelato nel suonativo conformazione tridimensionale. Anche descritto sono adattamenti al protocollo che permettono la visualizzazione di espressione della proteina in proiezioni afferenti e cervelletti grande per gli studi comparativi di topografia molecolare. Per illustrare queste applicazioni, i dati di colorazione afferente del cervelletto di ratto sono inclusi.

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Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography

Circuiti neurali sono topograficamente organizzate in compartimenti funzionali con specifici profili molecolari. Qui, forniamo i passi pratici e tecnici per rivelare la topografia globale del cervello utilizzando un approccio versatile wholemount colorazione immunoistochimica. Abbiamo dimostrato l&#39;utilità del metodo che utilizza il ben capito citoarchitettura e circuiti del cervelletto.

Immunoistochimica Wholemount per rivelare Topografia Cervello Complex

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.5K Views.  Albert Einstein College of Medicine, Yeshiva University. Circuiti neurali sono topograficamente organizzate in compartimenti funzionali con specifici profili molecolari. Qui, forniamo i passi pratici e tecnici per rivelare la topografia globale del cervello utilizzando un approccio versatile wholemount colorazione immunoistochimica. Abbiamo dimostrato l'utilità del metodo che utilizza il ben capito citoarchitettura e circuiti del cervelletto.

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The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an extensively studied model system for understanding the behavior of neural stem cells and the regulation of adult neurogenesis. Traditionally, these studies have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region. Compared to sections, wholemounts preserve the complete cytoarchitecture and cellular relationships within the SVZ. This approach has recently revealed that the adult neural stem cells, or type B1 cells, are part of a mixed neuroepithelium with differentiated ependymal cells lining the lateral ventricles. In addition, this approach has been used to study the planar polarization of ependymal cells and the cerebrospinal fluid flow they generate in the ventricle. With recent evidence that adult neural stem cells are a heterogeneous population that is regionally specified, the wholemount approach will likely be an essential tool for understanding the organization and parcellation of this stem cell niche.

The lateral ventricle walls contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. Traditionally, studies on neurogenesis in this region have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region.

La zona subventricolare En-face: colorazione Wholemount e flusso ependimale

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an ...

Ricerca

Neuroscienze

Revealing Neural Circuit Topography in Multi-Color

Neural circuits are organized into functional topographic maps. In order to visualize complex circuit architecture we developed an approach to reliably label the global patterning of multiple topographic projections. The cerebellum is an ideal model to study the orderly arrangement of neural circuits. For example, the compartmental organization of spinocerebellar mossy fibers has proven to be an indispensable system for studying mossy fiber patterning. We recently showed that wheat germ agglutinin (WGA) conjugated to Alexa 555 and 488 can be used for tracing spinocerebellar mossy fiber projections in developing and adult mice (Reeber et al. 2011). We found three major properties that make the WGA-Alexa tracers desirable tools for labeling neural projections. First, Alexa fluorophores are intense and their brightness allows for wholemount imaging directly after tracing. Second, WGA-Alexa tracers label the entire trajectory of developing and adult neural projections. Third, WGA-Alexa tracers are rapidly transported in both retrograde and anterograde directions. Here, we describe in detail how to prepare the tracers and other required tools, how to perform the surgery for spinocerebellar tracing and how best to image traced projections in three dimensions. In summary, we provide a step-by-step tracing protocol that will be useful for deciphering the organization and connectivity of functional maps not only in the cerebellum but also in the cortex, brainstem, and spinal cord.

We provide a practical guide for delivering tracers in vivo and use the spinocerebellar pathway as a model system to demonstrate essential steps for successful neuronal circuit analysis in mice. We describe in detail our versatile tracing protocol that exploits wheat germ agglutinin (WGA) conjugated to Alexa fluorophores.

Rivelando Topografia Neural Circuit in Multi-Color

Neural circuits are organized into functional topographic maps. In order to visualize complex circuit architecture we developed an approach to reliably ...

Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for immunohistochemistry and, 2) calcium imaging for the study of voltage gated calcium channel (VGCC) mediated calcium signaling in retinal ganglion cells. The calcium imaging method we describe circumvents issues concerning non-specific loading of displaced amacrine cells in the ganglion cell layer.

Immunohistochemistry protocols are used to study the localization of a specific protein in the retina. Calcium imaging techniques are employed to study calcium dynamics in retinal ganglion cells and their axons.

Metodi di imaging immunoistochimici e di calcio in Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

Completa lesioni del midollo spinale e del cervello dissezione Protocollo per Wholemount successiva<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in larvale Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brain tissue, using markers for microglia and neuronal elements as an example. Specifically, this paper is a step-by-step protocol for fluorescent visualization of microglia and neurons via immunohistochemistry for Iba1 and Pan-neuronal, respectively. Fluorescence double-labeling is particularly useful for the localization of multiple proteins within the same sample, providing the opportunity to accurately observe interactions between cell types, receptors, ligands, and/or the extracellular matrix in relation to one another as well as protein co-localization within a single cell. Unlike other visualization techniques, fluorescence immunohistochemistry staining intensity may decrease in the weeks to months following staining, unless appropriate precautions are taken. Despite this limitation, in many applications fluorescence double-labeling is preferred over alternatives such as 3,3&#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) or alkaline phosphatase (AP), as fluorescence is more time efficient and allows for more precise differentiation between two or more markers. The discussion includes troubleshooting tips and advice to promote success.

This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example.

Primer per immunoistochimica su Cryosectioned Rat tessuto cerebrale: Esempio colorazione per Microglia e neuroni

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

Preparazione del tessuto cerebrale Primate non umano per la pre-embedding immunoistochimica e microscopia elettronica

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent development of thin, flexible ECoG electrodes has enabled conduction of stable recordings of large-scale cortical activity. We have developed a whole-cortical ECoG array for the common marmoset. The array continuously covers almost the entire lateral surface of cortical hemisphere, from the occipital pole to the temporal and frontal poles, and it captures whole-cortical neural activity in one shot. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain. Marmosets have two advantages regarding ECoG recordings, one being the homologous organization of anatomical structures in humans and macaques, including frontal, parietal, and temporal complexes. The other advantage is that the marmoset brain is lissencephalic and contains a large number of complexes, which are more difficult to access in macaques with ECoG, that are exposed to the brain surface.These features allow direct access to most cortical areas beneath the surface of the brain. This system provides an opportunity to investigate global cortical information processing with high resolutions at a sub-millisecond order in time and millimeter order in space.

We have developed a whole-cortical electrocorticographic array for the common marmoset that continuously covers almost the entire lateral surface of cortex, from the occipital pole to the temporal and frontal poles. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain.

Impianto cronico di tutto-corticale Electrocorticographic Array nel Marmoset comune

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for determining the mechanisms underlying retinal diseases. Maintaining structural integrity throughout the tissue preparation is vital for obtaining reproducible retinal IHC data but can be challenging due to the fragility and complexity of retinal cytoarchitecture. Strong fixatives like 10% formalin or Bouin's solution optimally preserve the retinal structure, they often impede IHC analysis by enhancing the background fluorescence and/or diminishing antibody-epitope interactions, a process known as epitope masking. Milder fixatives, on the other hand, like 4% paraformaldehyde, reduces background fluorescence and epitope-masking, meticulous dissection techniques must be utilized to preserve the retinal structure. In this article, we present a comprehensive method to prepare mouse ocular posterior cups for IHC that is sufficient to preserve most antibody-epitope interactions without loss of retinal structural integrity. We include representative IHC with antibodies to various retinal cell type markers to illustrate tissue preservation and orientation under optimal and sub-optimal conditions. Our goal is to optimize IHC studies of the retina by providing a complete protocol from ocular posterior cup dissection to IHC.

This report describes comprehensive methods for preparing frozen mouse retina sections for immunohistochemistry (IHC). Methods described include dissection of the ocular posterior cup, paraformaldehyde fixation, embedding in Optimal Cutting Temperature (OCT) media and tissue orientation, sectioning and immunostaining.

Preparazione delle sezioni ricrello della retina

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

Valutazione dell'induzione della depressione a lungo termine nelle fette di cerebellar adulto

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within cells. Neurochemical phenotyping of functionally identified neurons usually requires concurrent labelling with multiple antibodies (targeting protein) using immunohistochemistry (IHC) and optimization of in situ hybridization (targeting RNA), in tandem. A &#34;neurochemical signature&#34; to characterize particular neurons may be achieved however complicating factors include the need to verify FISH and IHC targets before combining the methods, and the limited number of RNAs and proteins that may be targeted simultaneously within the same tissue section.
Here we describe a protocol, using both fresh frozen and fixed mouse brain preparations, which detects multiple mRNAs and proteins in the same brain section using RNAscope FISH followed by fluorescence immunostaining, respectively. We use the combined method to describe the expression pattern of low abundance mRNAs (e.g., galanin receptor 1) and high abundance mRNAs (e.g., glycine transporter 2), in immunohistochemically identified brainstem nuclei.
Key considerations for protein labelling downstream of the FISH assay extend beyond tissue preparation and optimization of FISH probe labelling. For example, we found that antibody binding and labelling specificity can be detrimentally affected by the protease step within the FISH probe assay. Proteases catalyze hydrolytic cleavage of peptide bonds, facilitating FISH probe entry into cells, however they may also digest the protein targeted by the subsequent IHC assay, producing off target binding. The subcellular location of the targeted protein is another factor contributing to IHC success following FISH probe assay. We observed IHC specificity to be retained when the targeted protein is membrane bound, whereas IHC targeting cytoplasmic protein required extensive troubleshooting. Finally, we found handling of slide-mounted fixed frozen tissue more challenging than fresh frozen tissue, however IHC quality was overall better with fixed frozen tissue, when combined with RNAscope.

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

This protocol describes a method for combining fluorescence in situ hybridization (FISH) and fluorescence immunohistochemistry (IHC) in both fresh frozen and fixed mouse brain sections, with the goal of achieving multilabel FISH and fluorescence IHC signal. IHC targeted cytoplasmic and membrane attached proteins.

Combinazione dell'ibridazione in situ a fluorescenza multiplex con immunoistochimica fluorescente su sezioni cerebrali di topo fresche, congelate o fisse

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within ...