Bu çalışma, Batı Ontario, Doğum ve Jinekoloji Anabilim Dalı Üniversitesi tarafından desteklenen ve Ministryof Araştırma ve Yenilikçilik, Erken Araştırmacı Ödülü bir hibe ER06-02-188. MMD Üreme, Erken Gelişim ve Sağlık (REDIH) Lisansüstü Bursu ile Etki bir CIHR Eğitim Programı tarafından desteklenmiştir.

1. GÜN Böyle GIBCO su gibi steril, distile su ile oosit toplama günü taze aşağıdaki çözümleri hazırlayın. DNA bulaşma olasılığını azaltmak için, çoğu zaman eldiven değiştirme ve filtre ipuçlarını kullanın. Zaman açık tüpler uzak açılı tutun ve kullanılmadığı zaman tüm tüpler recap. Biz çözümler n +1 olarak yapılır öneririz. % 3 LMP Agaroz 30 mg Düşük Erime Noktası (LMP) agaroz 1 ml GIBCO H 2 O @ 70 çözülür ° C Lizis Çözüm 8 ul lizis tamponu 1 ul proteinaz K 1 ul% 10 IGEPAL kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde yer 02:01 Agaroz: Lysis Çözüm (bireysel oosit başına 10 ul, miktarı 3 oosit için) 20 ul% 3 LMP agaroz 10 ul Lizis Çözüm @ 70 karıştırın ° C SDS Lysis Tampon (bireysel oosit başına 501 ul) <table border="0"><tbody><tr><td> 1x TE pH 7.5 </td><td> 450 ul </td></tr><tr><td> % 10 SDS </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td> Proteinaz K </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td></td><td> 501 ul </td></tr></tbody></table> 1. Yumurta Toplama <ol><li> M2 medyada disseke fare siyon hatası yerleştirin ve kümülüs hücre kompleksi ayıklamak için ampullae gözyaşı. </li><li> 0.3 mg / M2 medya 30 ul açılan ml hyaluronidaz çözümü kullanarak kümülüs hücre kompleksinden oosit ayırın. Sadece uzun uzun pozlama onlara zarar verebileceği gibi, kümülüs hücreleri çıkarmak için alır gibi çözüm oosit tutun. Periyodik kümülüs hücreleri giderici M2 medya 30 ul açılan 3x oosit, yıkayın. </li><li> Asidik tyrode çözümü kullanarak zona pellucida çıkarın. Bir 30 transfer daha sonra ilk çözüm biri 30 ul açılan oosit yerleştirin veul damla gibi birlikte yürütülen herhangi bir medya asit sulandırmak ve etkinliğini azaltacaktır. Sadece sürece uzun pozlama onlara zarar verebilir, zona kaldırmak için alır gibi çözüm oosit tutun. Not: insan zona pellucida fare daha asidik Tyrode çözeltisi ile muamele daha dirençli olduğu gibi asidik çözeltisi ya da Tyrode pronaz artan bir konsantrasyon, insan numuneler için kullanılabilir. </li><li> Bir kez daha M2 medya 30 ul açılan oosit yıkayın. </li></ol> 2. Agaroz gömülmesi ve Lizis <ol><li> Agaroz gömme gerçekleştirmek için, bir 70 ° C heatblock üzerine lizis çözeltisi yerleştirin. Lizis çözüm: 2:1 agaroz üreten lizis çözümü için önceden ısıtılmış LMP agaroz ekleyin. </li><li> Minimal M2 medyada temiz bir cam slayt üzerine tek bir yumurta koyun. Bir pipet içine lizis solüsyonu ve (mikroskop altında) yavaşça damla ile karışmasına izin cam slayt üzerine (~ 1 ul veya daha az) küçük bir miktar sınırdışı: agaroz 10 ul sürebiliral ortam. Yavaşça pipet içine oosit pick up ve boncuk bir küre oluşturur böylece 300 ul mineral yağ ile bir Eppendorf tüp içine tüm 10 ul koydu. Not: Bu işlem agaroz gibi oldukça hızlı bir şekilde yapılmalıdır donacaktır sıcaklığı az 5 ° C ile 70 ° C&#39;nin altına düşerse </li><li> 10 dakika süreyle buz üzerinde inkübe tüpü. Lizis gerçekleştirmek için, 300 ul mineral yağ kaldırmak ve SDS lizis tampon 500 ul ekleyin. 50 ° C su banyosunda gece inkübe edin. Not: Lysis çözeltisi (Tablo 1), aynı zamanda, bu amaç için kullanılabilir. </li></ol> 2. GÜN Bisülfit mutagenez gününde taze aşağıdaki çözümleri hazırlayın. DNA bulaşma olasılığını azaltmak için, çoğu zaman eldiven değiştirme ve filtre ipuçlarını kullanın. Zaman açık tüpler uzak açılı tutun ve kullanılmadığı zaman tüm tüpler recap. Biz çözümler n +1 olarak yapılır öneririz. <table border="0"><tbody><tr><td> 3 M NaOH </td> &lt;20 ml otoklavlanmış GKD 2 O td&gt; 2.4 g NaOH </td></tr><tr><td> 0.1 M NaOH </td><td> 14.5 ml otoklavlanmış GKD 2 O 3M 0.5 ml </td></tr><tr><td> 0.3 M NaOH </td><td> 13.5 ml otoklavlanmış GKD 2 O 3M 1.5 ml </td></tr></tbody></table> 2.5 M Bisülfit Çözüm <ol class="lalpha"><li> 3.8 g sodyum bisülfit 5.5 ml damıtılmış GIBCO H2O 1 ml 3 M NaOH @ oda sıcaklığında çözülür </li><li> 110 mg Hidrokinon 1 ml damıtılmış GIBCO H2O @ 90 ° C (sadece sürece eritmek için alır gibi için, düzenli mix) çözülür </li></ol> Tamamen çözündüğünde çözeltisi (a) karışımı ve (b) * Işık * uzak tutun 3. Bisülfit Mutagenezi <ol><li> Tam 500 ul SDS lizis tamponu çıkarın ve 300 ul mineral yağ (~ 20 saat) ekleyin. Kalan herhangi bir lizis tamponu inci sulandırmak olure agaroz bu ısıtılır ve boncuk sonraki adımlarda eriterek daha duyarlı olacak zaman. Hemen bisülfit mutagenez ile devam edin, ya da 5 güne kadar -20 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Varsa, dondurucudan oosit kaldırmak ve (agaroz boncuk nispeten saydam sadece kadar) çözülme sağlar. 10 dakika buz üzerinde hangi inkübe takiben, 90 ° C ısıya blok üzerinde 2.5 dakika inkübe. Not: karıştırmak veya karıştırın, daha uzun süre 2.5 dakika uzatmak, ya da sıcaklık dalgalanma etmeyin. </li><li> Denatürasyon gerçekleştirmek için, mineral yağ çıkarmak ve her tüp, fiske 1 ml 0.1M NaOH ekleyin ve 5-6 kez ters çevirin. </li><li> Ters bir 37 ° C su banyosunda 15 dakika, her 3-4 dakika inkübe edin. Boncuk NaOH içinde yüzer olmalıdır. </li><li> Bisülfit tedavi gerçekleştirmek için hafifçe döndürün tüp, daha sonra NaOH kaldırmak ve 300 ul mineral yağ ve 500 ul bisülfit çözeltisi ekleyin. 50 ° C su banyosunda 3.5 saat boyunca tüp inkübe edin. * Işık * uzak tutun </strong&gt; Not: inkübasyon süresi ampirik ilgi gen için belirlenen gerekebilir. </li><li> Desulfonation gerçekleştirmek için, 3 dakika buz üzerinde inkübe, daha sonra, madeni yağ ve bisülfit çözüm kaldırmak hafifçe döndürün ve 1 ml 0.3 M NaOH ekleyin. Flick ve 5-6 kez ters çevirin. </li><li> Ters bir 37 ° C su banyosunda 15 dakika, her 3-4 dakika inkübe edin. Boncuk NaOH içinde yüzer olmalıdır. </li><li> Örnekleri yıkayın, önce yumuşak iplik tarafından, daha sonra NaOH kaldırmak ve 1 ml 1x TE pH 7.5 ekleyin. Oda sıcaklığında (bir çalkalayıcı) de 5-10 dakika boyunca sallayın. Tekrar yavaşça çevirin, daha sonra 1x TE kaldırın. Bu yıkama işlemi iki kez tekrarlayın. </li><li> 1 ml otoklav GKD 2 O. ekle Oda sıcaklığında (bir çalkalayıcı) de 5-10 dakika boyunca sallayın. Yavaşça Spin, daha sonra 2 H, O. kaldırmak Iki kez GKD 2 O yıkama tekrarlayın. </li><li> Üstte kalan sıvı kısmın pH kontrol edilir; bu pH 5,0 olmalıdır. Hala çok temel varsa, H 2 O ile tekrar yıkayın Sadece agaroz olması bırakarak, tüm süpernatantıreklam. </li></ol> 4. 1. ve 2. Yuvarlak PCR <ol><li> ** Yıkarken 1. tur PCR karışımı hazırlayın ** </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> Forward Outer 10 uM Astar </td><td> 0.5 ul </td></tr><tr><td> Dış 10 uM Astar Ters </td><td> 0.5 ul </td></tr><tr><td> 240 ng / ml tRNA </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> H2O </td><td> 13 ul </td></tr></tbody></table> Misal-Hazır git Sıcak Başlangıç ​​PCR boncuk ekle Dikkatle PCR tüpü (~ 10 ul) içine katı agaroz boncuk kaydırın 70 ° C ve karıştırın Isı 25 ul mineral yağ ekleyin Toplam: 50 ul <ol start="2"><li> Yükseltmek Not: Fare Snrpn için minimize eder bir örneği, 94 de 2 dakika süreyle 94 denatürasyon olup az 30 saniye 40 döngü izledi ° C, ° C, 50 ° C&#39;de 1 dakika ile 168 dakikada ° C ve 68 azından bir nihai uzamaya 10 dakikalık bir adım ° C. 1. turda fare H19 için PCR ve Peg3 sıcaklık Tavlama 50 ° C&#39;dir </li><li> 2. turda PCR karışımı hazırlayın </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> İleri İç 10 uM Astar </td><td> 0.5 ul </td></tr><tr><td> İç 10 uM Astar Ters </td><td> 0.5 ul </td></tr><tr><td> H2O </td><td> 19 ul </td></tr></tbody></table> Misal-Hazır git Sıcak Başlangıç ​​PCR boncuk ekle Bir şablon olarak 5 ul 1. Yuvarlak ürün ekleyin. ° C&#39;de 1 dakika agaroz yumuşatmak için 70 1. turda ürün ısıtın. Mineral yağ tabakası altında Pipeti emin olun. 25 ul mineral yağ ekleyin Toplam: 50 ul Not: Snrpn, H19 ve Peg3 için iç içe primer dizilerinden Pazar-Velker ark 10 bulunabilir,12. <ol start="4"><li> Yükseltmek Not: BİSİKLET koşulları fare Snrpn için 94 de 2 dakika süreyle 94 ° denatürasyon az 30 saniye 40 döngü izledi C, ° C, 50 ° C&#39;de 1 dakika ve 68 de 1 dakika ° C ve 10 dakikalık bir nihai uzamaya 68 de adım ° C&#39;de 10. Fare H19 ve Peg3 gerektiren bir 50 ° C 2. tur PCR sıcaklık tavlama. </li><li> Bir tanı testi olarak, ikinci turda örnekleri metilasyon veya suş spesifik bir restriksiyon enzimi ile kesilebilir. </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> 2. Yuvarlak ürün </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> Kısıtlama Enzim </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> Tampon </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> H2O </td><td> 4 ul </td></tr></tbody></table><ol start="6"><li> Bir 8% akrilamid jel üzerinde, sindirim ürünleri Electrophorese. Herhangi bir heterojen bantları, birden fazla seque temsilnce. </li></ol> 5.. TA Klonlama ve Colony PCR <ol><li> 2. yuvarlak ürün, 70 ilk ısı klonlamak için ° C 1 dakika Promega pGEM-T Vector Sistemi (Fisher Scientific Kedi # A1360) kullanarak vektör sonra içine ligate agaroz, yumuşatmak için. </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> 2. Yuvarlak PCR </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> pGEMT-KOLAY vektör </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> Ligaz </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> H2O </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> 2x Ligasyonu Tampon </td><td> 5 ul </td></tr></tbody></table> Gece @ 4 ° C PCR makinesi inkübe edin. <ol start="2"><li> 15 dakika buz üzerinde yetkili E.coli hücreleri (Zymo Research Corp Kedi # T3009) çözülmesini sağlayın. 8 ul E.coli ve 15 dakika buz üzerinde inkübe ligasyona 3 ul ligasyon reaksiyonu ekleyin. </li><li> 42 ° C su banyosunda 40 saniye için ısı çarpması,ve 2 dakika buz üzerinde inkübe. 1 saat (sallama) için 37 ° C&#39;de 60 ul SOC orta ve inkübe ekleyin. </li><li> 37 ° C&#39;da gece boyunca bir LB / Agar / IPTG / Xgal / Amp plakası ve inkübe plaka üzerinde, reaksiyon karışımına tüm yerleştirin. </li><li> Koloni PCR karışımı hazırlayın </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> 20 uM M13 İleri Astar </td><td> 0.7 ul </td></tr><tr><td> 20 uM M13 Ters Astar </td><td> 0.7 ul </td></tr><tr><td> 5X Yeşil Go Taq Tampon </td><td> 7.0 ul </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP </td><td> 0.7 ul </td></tr><tr><td> Taq DNA polimeraz </td><td> 0.28 ul </td></tr><tr><td> H2O </td><td> 25.62 ul </td></tr><tr><td></td><td> 35 ul toplam </td></tr></tbody></table> Bir PCR tüpüne 35 ul Colony PCR master miks ekleyin. Bir pipet ve PCR reaksiyon içine girdap onunla plakadan beyaz bir bakteri kolonisi seçin. <ol start="6"><li> 94 de 10 dakika boyunca denatürasyon ile amplifiye ° 94, 45 saniye 30 döngü izledi C, 57 ° C&#39;de, 30 saniye ° C ve 72 de 1 dakika ° C ve 72 azından bir nihai uzamaya 10 dakikalık bir adım ° C. % 1.5 agaroz jel üzerinde 4 ul Electrophorese. Sıralama için PCR ürün ~ 30 ul gönder. Not: oosit için 5 koloni PCR ürünleri dizilerek. </li><li> Sıralama sonuçları elde edildikten sonra, metilasyonu okunabilir. Bir CG olarak kalmıştır herhangi bir orijinal CG metillenmiş ve şimdi bir TG herhangi bir orijinal CG unmethylated edildi. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Bizim çalışmalarımızda, tahlil bireysel oosit ve embriyoların (Şekil 1) metilasyon basılır. Bisülfit dönüştürülür primerler kullanılarak iç içe PCR ardından, bir agaroz jel (Şekil 2) bir doğru parçası boyutu görselleştirerek başarılı bir dönüşüm onaylamak mümkün. Bir birey oositBir ebeveyn aleli temsil eder, ve teorik olarak, bir baskılı metilasyon paterni vardır. Bu nedenle, ikinci tur PCR ürünleri kasıtsız kontaminasyon için test edilebilir. DNA metilasyon (örneğin HinfI ya DpnII gibi) karşı duyarlı bir kısıtlayıcı enzim, bir metil veya unmethylated alel (Şekil 3) içermesi durumunda değerlendirmek için ikinci turda PCR ürünü sindirimi için kullanılabilir. T dönüştürülür bir unmethylated C artık enzimi tarafından tanınan ve kesilmemiş bir durumdayken enzim tanıma dizisi içinde bir metil C parçalanabilen edilir. Bu kümülüs hücre kontaminasyonu (Şekil 3) göstergesi olarak metillenmiş ve unmethylated allelleri hem içeren herhangi bir MII oosit örnek, atılmalıdır. Ligasyonu ve dönüşüm sonrasında, başarılı bir koloni PCR doğru ürün boyutu numunelerde (Şekil 4) sıralama için gönderilir sağlamak için bir jelde görüntülenebilmekte. Son olarak, beş ayrı cl sekansıBir MII oosit den olanlar beş aynı metilasyonu ve aynı nonCpG dönüşüm oranları (Şekil 5a) üretmelidir. Birden fazla desen içeren herhangi bir örneği (Şekil 5B) atılmalıdır. Ovulasyon MII oosit iki kromozom kopya veya ekli bir kutup bedene sahip olduğundan, benzer iki dizi paternleri (Şekil 5c) elde etmek için bir olasılık vardır. Biz kümülüs hücre kontaminasyonu ekarte edilemez yana oldukça farklı metilasyonu sahip oositler gelen verileri atarak öneririz. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4046/4046fig1.jpg" /> Şekil 1. Tek Oosit Bisülfit Mutagenez tahlil şematik. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/4046/4046fig2.jpg" /> Bir şarkı gelen Snrpn için 2. turda amplifikasyon Şekil 2&#39;de. Temsilcisi sonuçları% 1.5 agaroz jel le MII oosit. Lanes 1-4 dört tek MII oosit ve şeritli 5 negatif kontrol (oosit) &#39;dir. Snrpn Beklenen amplikon boyutu 420 bp olduğunu. L, merdiven. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4046/4046fig3.jpg" /> % 8&#39;lik bir akrilamid jel üzerinde tek bir MII oosit den Snrpn için 2. turda metilasyon spesifik sınırlama sindirim gelen Şekil 3. Temsilcisi sonuçları. HinfI tanı sınırlama sindirim (420bp, hat 1) kısıtlama sitesi yasaklayan bir T barındırıyor unmethylated DNA gösterir ya (kesim, 262, 103, ve 54 bp, şerit 2) tanıma site içinde bir C içerir metillenmiş DNA. Metillenmiş ve unmethylated hem restriksiyon enzimi siteleri (kesim ve kesilmemiş bantlar, şerit 3) gösteren Sindirim kümülüs hücre kontaminasyonu göstergesidir. L, merdiven. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/4046/4046fig4.jpg" /> Şekil 4. </strong&gt;% 1.5 agaroz jel üzerinde tek bir MII oosit den Snrpn için koloni PCR Temsilcisi sonuçlar. Beklenen amplikon boyutu pGEM-T Kolay vektör Snrpn ligasyonu takip eden ve ileri M13 kullanarak ve geri primerleri 656 bp olduğunu. Lane 1-8, klonlar 1-8 dan amplikonlar. Clone 5 yanlış bir amplikon boyutu vardır ve sıralama için gönderilen edilmemelidir. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/4046/4046fig5.jpg" /> Şekil 5. Temsilcisi tek MII oosit den Snrpn sonuçları sıralama. Snrpn oositlerinde metillenmiş edilir. Siyah daireler metillenmiş CpG&#39;ler göstermektedir. Beyaz çevreler unmethylated CpG&#39;ler göstermektedir. CpG sayısı ve yerleşimi bir B6 suşu dişi fare temsilcisidir. a) Tek bir MII oosit den Snrpn sonuçları sıralama bekleniyordu. DNA Yalnızca tek bir iplikçik beş klon yükseltmek gerekir. Tek bir metilasyon paterni ve özdeş olmayan CpG dönüşüm pıtırtı ile oositn (non-larını yüzde dönüşüm toplam olmayan CpG sitozinleri bir yüzdesi olarak timin dönüştürülür non-CpG sitozinleri sayısı olarak hesaplandı sağa gösterilir) analizleri dahil edilmesi gerekmektedir. kümülüs hücre kontaminasyonu ile tek MII oosit den Snrpn b) Sıralama sonuçları. Birden iplikçik amplifikasyon belirten metilasyon devletler ve dönüşüm kalıpları arasındaki farklılık dikkat edin. c) kromozom kopya veya polar body dahil ikisi de tek bir MII oosit den Snrpn sonuçları Sıralama.

<ol>
	<li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+gene+expression:+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals.">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nat. Genet. 33, 245-254 (2003).</li><li>Rodenhiser, D., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+and+human+disease:+translating+basic+biology+into+clinical+applications.">Epigenetics and human disease: translating basic biology into clinical applications.</a> CMAJ. 174, 341-348 (2006).</li><li>Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands.">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 1827-1831 (1992).</li><li>Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines.">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).</li><li>Feil, R., Charlton, J., Bird, A. P., Walter, J., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylation+analysis+on+individual+chromosomes:+improved+protocol+for+bisulphite+genomic+sequencing.">Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing.</a> Nucleic Acids Res. 22, 695-696 (1994).</li><li>Raizis, A. M., Schmitt, F., Jost, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bisulfite+method+of+5-methylcytosine+mapping+that+minimizes+template+degradation.">A bisulfite method of 5-methylcytosine mapping that minimizes template degradation.</a> Anal. Biochem. 226, 161-166 (1995).</li><li>Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Methylation:+Bisulphite+Modification+and+Analysis.">DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis.</a> J. Vis. Exp. (56), e3170 (2011).</li><li>Olek, A., Oswald, J., Walter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+and+improved+method+for+bisulphite+based+cytosine+methylation+analysis.">A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis.</a> Nucleic Acids Res. 24, 5064-5066 (1996).</li><li>Mann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+loss+of+imprinting+in+the+placenta+following+preimplantation+development+in+culture.">Selective loss of imprinting in the placenta following preimplantation development in culture.</a> Development. 131, 3727-3735 (2004).</li><li>Market-Velker, B. A., Zhang, L., Magri, L. S., Bonvissuto, A. C., Mann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+effects+of+superovulation:+loss+of+maternal+and+paternal+imprinted+methylation+in+a+dose-dependent+manner.">Dual effects of superovulation: loss of maternal and paternal imprinted methylation in a dose-dependent manner.</a> Hum. Mol. Genet. 19, 36-51 (2010).</li><li>Meng, L. H., Xiao, S. Q., Huang, X. F., Zhou, Y., Xu, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+on+bisulfite+sequencing+method+for+methylation+status+of+imprinted+genes+in+single+human+oocytes.">A study on bisulfite sequencing method for methylation status of imprinted genes in single human oocytes.</a> Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 25, 289-292 (2008).</li><li>Denomme, M. M., Zhang, L., Mann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+imprinting+perturbations+do+not+originate+from+superovulation-induced+defects+in+DNA+methylation+acquisition.">Embryonic imprinting perturbations do not originate from superovulation-induced defects in DNA methylation acquisition.</a> Fertil. Steril. 96, 734-738 (2011).</li><li>Tahiliani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1.">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324, 930-935 (2009).</li><li>Hajj, N. E. l. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limiting+dilution+bisulfite+(pyro)sequencing+reveals+parent-specific+methylation+patterns+in+single+early+mouse+embryos+and+bovine+oocytes.">Limiting dilution bisulfite (pyro)sequencing reveals parent-specific methylation patterns in single early mouse embryos and bovine oocytes.</a> Epigenetics. 6, 1176-1188 (2011).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu tek yumurta tahlil kritik ve özel bakım gerektiren bir dizi ile birçok adımları içerir. İlk oosit yıkanmasıdır. Mümkün olduğunca çok kümülüs hücreleri olarak kaldırmak için hiyalüronidaz tedaviyi takiben düşer taze ortamda her oosit birden çok kez yıkamak için özellikle önemlidir. Ayrıca, zona pellucida kaldırılması için asidik tyrode çözümü için oosit aktarırken orta çevreleyen cumulus hücreleri temiz olduğundan emin olun. Oosit zona çıkarılmasını takiben çok yapışka...

Özel reaktifler ve ekipman Tablo. <table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td colspan="4"> Yumurta Toplama </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> Sigma </td><td> H4272 </td><td></td></tr><tr><td> Asidik Tyrode </td><td> Sigma </td><td> T1788 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinaz K </td><td> Sigma </td><td> P5568 </td><td></td></tr><tr><td> % 10 IGEPAL </td><td> Bioshop </td><td> NON999.500 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Lizis Çözüm </td></tr><tr><td> Tris pH 7.5 </td><td> Bioshop </td><td> TRS001.5 </td><td></td></tr><tr><td> LiCl </td><td> Sigma </td><td> L9650 </td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> EDTA pH 8.0 </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td> KAPAKLAR </td><td> Bioshop </td><td> LDS701.10 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> Invitrogen </td><td> P2325 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> SDS Lizis Tampon </td></tr><tr><td> TE pH 7.5 </td><td> Bioshop (Tris) Sigma (EDTA) </td><td> TRS001.5 E5134 </td><td></td></tr><tr><td> % 10 SDS </td><td> Bioshop </td><td> SDS001.500 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Bisülfit Dönüşüm </td></tr><tr><td> Sodyum Hidroksit </td><td> Sigma </td><td> S8045 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum hidrojensülfit (sodyum bisülfit) </td><td> Sigma </td><td> 243973 </td><td>; </td></tr><tr><td> Hidrokinon </td><td> Sigma </td><td> H9003 </td><td></td></tr><tr><td> Düşük Erime Noktası (LMP) agaroz </td><td> Sigma </td><td> A9414 </td><td></td></tr><tr><td> Madeni Yağ </td><td> Sigma </td><td> M8410 </td><td></td></tr><tr><td> M2 Orta </td><td> Sigma </td><td> M7167 </td><td></td></tr><tr><td> GIBCO Damıtılmış su </td><td> Invitrogen </td><td> 15230-196 </td><td></td></tr><tr><td> Otoklavlı çift distile (dd) su </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> PCR </td></tr><tr><td> Misal Sıcak Başlangıç ​​Mix RTG </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9006-54 </td><td></td></tr><tr><td> 240 ng / ml maya tRNA </td><td> Invitrogen </td><td> 15401-011 </td><td></td></tr><tr><td> 5x Yeşil GoTaq Reaksiyon Tamponu </td><td> Profesyonelmega </td><td> M7911 </td><td></td></tr><tr><td> İç ve dış iç içe primerler </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Ligasyonu </td></tr><tr><td> Promega pGEM-T Kolay Vektör </td><td> Fisher Scientific </td><td> A1360 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> TA Klonlama </td></tr><tr><td> Yetkili E.coli hücreleri </td><td> Zymo Araştırma Corp </td><td> T3009 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Ekipman </td></tr><tr><td> Mikroskop Kesme </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 70 ° C ile 90 ° C Isı Blokları </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 37 ° C ile 50 ° C Isıtıcıları (42 ° C dönüşümler için) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rock&#39;çı </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PCR makinesi </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

single oocyte bisulfite mutagenesis

Epigenetik tüm kalıtsal kapsar ve geri dönüşümlü değişiklikler dolayısıyla alter gen erişilebilirlik ve gen transkripsiyonu 1 düzenleyen birincil mekanizmaları olduğunu kromatine. DNA metilasyon baskıcı bir işareti olarak ağırlıklı olarak hareket eden bir epigenetik modifikasyon olduğunu. CpG dinucleotides in sitozinleri üzerine, bir metil grubu ile kovalent yanı boyunca, bu kromatin kondensasyon ve genler 2 susturulmasında süreçleri başlatmak için ek protein ve baskıcı histon modifikasyonları katabildikleri. Bu gelişimsel programlama, hücre farklılaşması, retroviral elemanlarının baskı, X kromozomu inaktivasyonu ve genomik imprinting kritik bir rol oynar gibi DNA metilasyon normal gelişimi için gereklidir. DNA metilasyon analizi için en etkili yöntemlerinden biri bisülfit mutagenez olduğunu. Sodyum bisülfit uracils içine sitozinleri deaminates bir DNA mutajen olup. PCR ve seque ardından<html> ncing, bu dönüşüm olaylar thymines olarak algılanır. Metillenmiş sitozinleri deaminasyon korumalıdır ve böylece kişi nükleotid 3. seviyede DNA metilasyon belirlenmesini sağlamaktadır sitozinleri olarak kalır. Bisülfit mutagenez testin geliştirilmesi başlangıçta daha duyarlı ve 7 tekrarlanabilir hangileri doğru 4-6 bildirdi olanlardan ilerlemiştir. Bir anahtar ilerleme böylece sert bisülfit tedavisi 8 DNA koruyan bir agaroz boncuk DNA az miktarda gömme edildi. Bu etkin metilasyon analizi oosit ve blastosist aşamasındaki embriyoların 9 havuzlarda yapılacak. Bugüne kadar en sofistike bisülfit mutagenez protokolü bireysel blastosist aşaması embriyo için 10 olduğunu. Blastokist ortalama 64 hücreleri (genomik DNA 120-720 pg içeren) üzerinde var Ancak, bu yöntem bireysel oosit veya klivaj aşamasındaki embryo metilasyon çalışmaları için etkili değildir. çadır &quot;&gt; oosit dahil 11 dakikalık DNA miktarda agaroz gömme gelen ipuçları alarak, burada oosit doğrudan bir agaroz ve lizis çözüm boncuk hemen aşağıdaki alımı ve oosit den zona pellucida çıkarılması gömülü sayede bir yöntem sunuyoruz. Bu bize sağlar iki tek yumurta bisülfit mutagenez başlıca zorlukları aşmak:. bozulması DNA bir dakika miktarda korunması ve çok sayıda protokol adımları boyunca sonraki veri kaybını tek oosit elde edilir gibi önemlisi, havuzlar içinde PCR yanlılık sorunu ortadan kalkar Dahası. , birden fazla metilasyon desen ile herhangi bir örnek analizi 12 dışında tutulabilir yana istenmeyen cumulus hücre kirlenme. Bu metod ile tespit edilebilir Bu protokol, tek hücre düzeyinde DNA metilasyon başarılı bir şekilde ve tekrarlanabilir analizler için geliştirilmiş bir yöntem sağlar ve ideal olarak uygundur bireysel oositlerin yanı sıra klivaj dönemi embriyodan için.

Watch this Scientific Journal Video about Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis at JoVE.com

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Bisülfit mutagenez DNA metilasyon analizi için altın standarttır. Bizim modifiye protokolü tek hücre düzeyinde DNA metilasyon analizini sağlar ve özellikle bireysel oositler için tasarlanmıştır. Ayrıca, bölünme aşamalı embriyo için de kullanılabilir.

Tek Oosit Bisülfit Mutagenez

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K Görüntüleme.  Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario. Bisülfit mutagenez DNA metilasyon analizi için altın standarttır. Bizim modifiye protokolü tek hücre düzeyinde DNA metilasyon analizini sağlar ve özellikle bireysel oositler için tasarlanmıştır. Ayrıca, bölünme aşamalı embriyo için de kullanılabilir.

Video: Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

Tüm Plazmidler Homemade Sitesi Yönetmen Mutagenez

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Biyoloji

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

İyon Kanalları ve Fonksiyonel Analiz Mutagenez Heterologously Memeli Hücreleri cinsinden ifade edilir

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane sulfonate (EMS) and 4, 5', 8-trimethylpsoralen combined with ultraviolet light (TMP/UV). Nematodes are powerful biological systems for genetics studies because of their simple body plan and mating system, which is composed of self-fertilizing hermaphrodites and males that can generate hundreds of progeny per animal. Nematodes are maintained in agar plates containing a lawn of bacteria and can be easily transferred from one plate to another using a pick. EMS is an alkylating agent commonly used to induce point mutations and small deletions, while TMP/UV mainly induces deletions. Depending on the species of nematode being used, concentrations of EMS and TMP will have to be optimized. To isolate recessive mutations of the nematode Pristionchus pacificus, animals of the F2 generation were visually screened for phenotypes. To illustrate these methods, we mutagenized worms and looked for Uncoordinated (Unc), Dumpy (Dpy) and Transformer (Tra) mutants.

Screening for mutants with phenotypic defects is a straightforward method for identifying genes that function in a given biological process. In this article we describe how to culture free living worms (e.g., Pristionchus pacificus) in the laboratory and show two different mutagenesis methods, EMS and TMP/UV.

Solucan Lab An Introduction to: Kültürleme Worms Mutagenez

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Proteinlerin Yönetmen Evolution Mutagenez ve Fonksiyonel Seçim Protokolleri E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

Fare Oosit Mikroenjeksiyon, olgunlaşması ve ploidi Değerlendirmesi

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4

TRPV4 (Transient Receptor Potentials, vanilloid family, type 4) is widely expressed in vertebrate tissues and is activated by several stimuli, including by mechanical forces. Certain TRPV4 mutations cause complex hereditary bone or neuronal pathologies in human. Wild-type or mutant TRPV4 transgenes are commonly expressed in cultured mammalian cells and examined by Fura-2 fluorometry and by electrodes. In terms of the mechanism of mechanosensitivity and the molecular bases of the diseases, the current literature is confusing and controversial. To complement existing methods, we describe two additional methods to examine the molecular properties of TRPV4. (1) Rat TRPV4 and an aequorin transgene are transformed into budding yeast. A hypo-osmtic shock of the transformant population yields a luminometric signal due to the combination of aequorin with Ca2+, released through the TRPV4 channel. Here TRPV4 is isolated from its usual mammalian partner proteins and reveals its own mechanosensitivity. (2) cRNA of TRPV4 is injected into Xenopus oocytes. After a suitable period of incubation, the macroscopic TRPV4 current is examined with a two-electrode voltage clamp. The current rise upon removal of inert osmoticum from the oocyte bath is indicative of mechanosensitivity. The microAmpere (10-6 to 10-4 A) currents from oocytes are much larger than the subnano- to nanoAmpere (10-10 to 10-9 A) currents from cultured cells, yielding clearer quantifications and more confident assessments. Microscopic currents reflecting the activities of individual channel proteins can also be directly registered under a patch clamp, in on-cell or excised mode. The same oocyte provides multiple patch samples, allowing better data replication. Suctions applied to the patches can activate TRPV4 to directly assess mechanosensitivity. These methods should also be useful in the study of other types of TRP channels.

Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4

To complement commonly used methods to study TRPV4&#8217;s, two methods are described: Its mechanosensitivity can be studied by Ca2+-aequorin luminometry in transgenic yeast upon hypo-osmotic challenge. It can also be examined in TRPV4-RNA injected Xenopus oocytes by whole-cell two-electrode voltage clamp or patch clamp in on-cell or excised mode.

Maya lüminometrik ve<em&gt; Xenopus</emTRPV4 Moleküler Mechanosensitivity arasında&gt; Yumurta Elektrofizyolojik Sınavları

TRPV4 (Transient Receptor Potentials, vanilloid family, type 4) is widely expressed in vertebrate tissues and is activated by several stimuli, including ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion channels in oocytes. Recordings from the cut-open setup are particularly useful for resolving low magnitude gating currents, rapid ionic current activation, and deactivation. The main benefits over the two-electrode voltage clamp (TEVC) technique include increased clamp speed, improved signal-to-noise ratio, and the ability to modulate the intracellular and extracellular milieu.
Here, we employ the human cardiac sodium channel (hNaV1.5), expressed in Xenopus oocytes, to demonstrate the cut-open setup and protocol as well as modifications that are required to add voltage clamp fluorometry capability.
The properties of fast activating ion channels, such as hNaV1.5, cannot be fully resolved near room temperature using TEVC, in which the entirety of the oocyte membrane is clamped, making voltage control difficult. However, in the cut-open technique, isolation of only a small portion of the cell membrane allows for the rapid clamping required to accurately record fast kinetics while preventing channel run-down associated with patch clamp techniques.
In conjunction with the COVG technique, ion channel kinetics and electrophysiological properties can be further assayed by using voltage clamp fluorometry, where protein motion is tracked via cysteine conjugation of extracellularly applied fluorophores, insertion of genetically encoded fluorescent proteins, or the incorporation of unnatural amino acids into the region of interest1. This additional data yields kinetic information about voltage-dependent conformational rearrangements of the protein via changes in the microenvironment surrounding the fluorescent molecule.

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open Vaseline gap approach is used to obtain low noise recordings of ionic and gating currents from voltage-dependent ion channels expressed in Xenopus oocytes with high resolution of fast channel kinetics. With minor modification, voltage clamp fluorometry can be coupled to the cut-open oocyte protocol.

<em&gt; Xenopus</emFluorometri ile&gt; Yumurta Kes-açık Vazelin Gap Gerilim-kelepçe Tekniği

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can be generated using a transposome. The commercially available, Tn5-derived transposome used in this protocol consists of a linear segment of DNA containing an R6K&#947; replication origin, a gene for kanamycin resistance and two mosaic sequence ends, which serve as transposase binding sites. The transposome, provided as a DNA/transposase protein complex, is introduced by electroporation into the prototrophic strain, Enterobacter sp. YSU, and randomly incorporates itself into this host&#8217;s genome. Transformants are replica plated onto Luria-Bertani agar plates containing kanamycin, (LB-kan) and onto M-9 medium agar plates containing kanamycin (M-9-kan). The transformants that grow on LB-kan plates but not on M-9-kan plates are considered to be auxotrophs. Purified genomic DNA from an auxotroph is partially digested, ligated and transformed into a pir+ Escherichia coli (E. coli) strain. The R6K&#947; replication origin allows the plasmid to replicate in pir+ E. coli strains, and the kanamycin resistance marker allows for plasmid selection. Each transformant possesses a new plasmid containing the transposon flanked by the interrupted chromosomal region. Sanger sequencing and the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) suggest a putative identity of the interrupted gene. There are three advantages to using this transposome mutagenesis strategy. First, it does not rely on the expression of a transposase gene by the host. Second, the transposome is introduced into the target host by electroporation, rather than by conjugation or by transduction and therefore is more efficient. Third, the R6K&#947; replication origin makes it easy to identify the mutated gene which is partially recovered in a recombinant plasmid. This technique can be used to investigate the genes involved in other characteristics of Enterobacter sp. YSU or of a wider variety of bacterial strains.

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Enterobacter sp. YSU grows in glucose minimal salts medium. Auxotrophs are generated by transforming it with a transposome which randomly inserts itself into the host genome. Mutants are found by replica plating from complex medium to minimal medium. Interrupted genes are identified by gene rescue and sequencing.

Üretilmesi<em&gt; Enterobacter</em&gt; Sp. YSU oksotroflan transpozon mutajenezi kullanarak,

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine methylation patterns in cells. Reduced representation of whole genome bisulfite sequencing was developed to detect quantitative base pair resolution cytosine methylation patterns at GC-rich genomic loci. This is accomplished by combining the use of a restriction enzyme followed by bisulfite conversion. Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing (ERRBS) increases the biologically relevant genomic loci covered and has been used to profile cytosine methylation in DNA from human, mouse and other organisms. ERRBS initiates with restriction enzyme digestion of DNA to generate low molecular weight fragments for use in library preparation. These fragments are subjected to standard library construction for next generation sequencing. Bisulfite conversion of unmethylated cytosines prior to the final amplification step allows for quantitative base resolution of cytosine methylation levels in covered genomic loci. The protocol can be completed within four days. Despite low complexity in the first three bases sequenced, ERRBS libraries yield high quality data when using a designated sequencing control lane. Mapping and bioinformatics analysis is then performed and yields data that can be easily integrated with a variety of genome-wide platforms. ERRBS can utilize small input material quantities making it feasible to process human clinical samples and applicable in a range of research applications. The video produced demonstrates critical steps of the ERRBS protocol.

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.

Baz Çifti Çözünürlük DNA metilasyon Değerlendirme Temsil bisülfit sıralamayı İndirimli pekiştirilmiş

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 &#946;-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to &#946;-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

We present a protocol for the functional assessment of comprehensive single-site saturation mutagenesis libraries of proteins utilizing high-throughput sequencing. Importantly, this approach uses orthogonal primer pairs to multiplex library construction and sequencing. Representative results using TEM-1 &#946;-lactamase selected at a clinically relevant dosage of ampicillin are provided.

Yüksek verimlilik sıralaması kullanılması Tüm-Protein Doygunluk Mutagenez Kütüphaneleri Fonksiyonel Değerlendirme Protokolü

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...