このプロトコルは、単一の変換ステップで異なる遺伝子座に複数の発現カセットを導入することにより、サッカロミセス・セレビシエのマルチプレックスゲノム編集のための新しい方法を示す。単一のcrRNAアレイを発現するためのこのクローニングフリープラスミドアセンブリアプローチは、迅速で効率的で柔軟なゲノム編集プロトコルにつながります。野生型酵母細胞を設計し、遊離ゲノム座に遊離異種遺伝子を導入してカロテノイドを産生します。
単一のcrRNAアレイは、RNAポリメラーゼ遊離プロモーターから発現される遊離個体crRNAで構成される。Cas12aは、crRNAアレイを生体内で個々のcrRNAに処理する。crRNAはCas12aが二本鎖破断を導入するゲノムDNAの標的遺伝子座にCas12aを導く。
下向きのDNA断片は、インビボ組み換えのために再結合し、ゲノムDNAに統合します。プロトコルのデモンストレーションは、博士課程の学生であるクラウディア・シウルコットです。ジェフリー・ファン・ウェイク、アソシエイト・サイエンティスト。
そして、私たちの研究室のシニアアソシエイトサイエンティスト、ブレンダ・フォンク。合成DNAのマルチプレックスゲノム編集実験用の単一crRNAアレイを取得した後、PCR増幅ミックスを調製し、増幅のためにアレイをサーモサイクラーにロードします。PCR産物を電気泳動で分析するには、0.8%アガロースゲルを5V/cmで40分間実行します。
100個の10000塩基対の範囲のDNA断片をDNAラダーにロードし、製造業者の指示に従ってPCR精製キットを使用してPCR製品を精製します。酵母変換の場合、20 mLの酵母エキスペプトンデキストロースまたはYEPD培地を含む100mLフラスコで野生型酵母を前培養することから始めます。一晩インキュベーションの場合、摂氏30度、および毎分250回転で翌朝、一晩培養前酵母の計算量で20mLの新鮮なYEPD培地を接種する。
600ナノメートルで測定した光学密度が1.0になるまで、振度インキュベーターに培養液を入れる。遠心分離によって酵母細胞を収穫する。酵母細胞ペレットを20mLの室温脱塩水で洗浄し、続いてさらに遠心分離を行います。
100マイクロリットルの酢酸トリス-EDTA溶液中のペレットを再懸濁し、酵母をマイクロ遠心分離チューブに移します。一本鎖キャリアDNA5マイクロリットルとプラスミドpCSN067の1マイクログラムを酵母細胞懸濁液と混合します。その後、サンプルとポリエチレングリコールLiAc-TE溶液の600マイクロリットルを混合します。
酵母細胞とプラスミドを30分摂氏30度、テーブルトップヒートブロックで450prmインキュベートします。インキュベーションの終了時に、70 mLのジメチルスルホキシドを変質溶液と混合する。42°Cの水浴で15分間加熱衝撃を与えます。
混合物を15mLの丸い底管に移す。摂氏30度と250rpmで一晩インキュベーションのためにチューブにYEPDの10 mLを追加します。翌朝、遠心分離によって形質転換された細胞を収集し、上清の最後の200マイクロリットルを除くすべてを吸引する。
変容した酵母細胞ペレットを残りの上清に再懸濁させる。変換ミックスのプレート150マイクロリットル、およびYEPDの変換ミックスの残りの50マイクロリットルの20倍の希釈の150マイクロリットル、YEPD寒天板上、G418の1リットル当たり0.2グラムを補った。摂氏30度で48〜72時間後、G418の0.2 g /Lを補った新しいYEPD寒天プレートに再ストリーキングするための単一の変容剤を選びます。
2番目の変換では、ちょうど示したように、1.0の600ナノメートルで光学密度に培養を成長させます。そして、マイクロ遠心チューブに細胞の20マイクロリットルを追加します。遠心分離後、細胞ペレットを100マイクロリットルのLiAc-TE溶液で再懸濁し、ssDNAを添加する。
別のチューブでは、単一crRNAアレイの1マイクログラム、crRNAアレイ用の直線化されたレシピエントプラスミドの1マイクログラム、各ドナーDNAの1マイクログラム、および各隣接領域の1マイクログラムを組み合わせます。次に、DNA混合物を有能な酵母細胞のチューブに移し、最初の変換のために実証された2番目の変換を完了する。翌朝、遠心分離によって細胞を収集し、上清の小さなアリコートでペレットを再懸濁する。
次に、変換ミックスのプレート150マイクロリットル、 YEPD培地中の変換ミックスの20倍の希釈の150マイクロリットル、0.2 g/L G418を補ったYEPD寒天プレート、0.2 g/Lノルセトリシン48〜72時間後、摂氏30度で、新しいYPDプレートで再ストリークするための単色の変質剤を選ぶ。ゲノム編集効率を決定するには、変換プレート上の色と白のコロニーの数を数え、着色されたコロニーの数をコロニーの総数で割ります。酵母画素技術を創り出すために、S.cerevisiae株を生産する3つの異なる色のカロテノイドを有するYEPD培地の100mLを含有する個々の500mLシェイクフラスコ、および野生型CENを接種する。
PK113-7D株。250 rpmで振ると摂氏30度で一晩培養します。各一晩培養物の0.5mLを、チューブあたり0.5mLの無菌非イオン密度勾配培地を含む個々のチューブに移し、ボルテックスで溶液を簡単に混合します。
細胞懸濁液を個々の修飾された貯蔵所2を3つの井戸に移す。音響液体ハンドラ装置の流体校正設定6RES_AQ_GPSA2を持つcsvファイルを使用して、適切な修飾された貯水池ソースプレートからYEPD寒天体の50 mLを含む6144ウェル宛先マイクロプレートに各S.cerevisiae株の25ナノリットルを発見します。すべての井戸が発見されたら、マイクロプレートを30デグレス摂氏で48時間インキュベートします。
株の色を強めるには、寒天プレートを摂氏4度で少なくとも72時間保存します。ロザリンド・フランクリンの写真がプレートに現れました。実証されるように、プロモーター、オープンリーディングフレーム、ターミネータ、および2つの連続した50bpコネクタ配列をゴールデンゲートクローニング反応を介して発現カセットに組み立て、PCRによって検証することができる。
PCRによる単一crRNAアレイの増幅後、単一crRNAアレイのレパレプラスミドは、電気泳動により確認されるようにリニア化される。多重ゲノム編集の効率は、変換後の着色コロニーの割合と、意図されたゲノムDNAの位置におけるドナーDNAの統合を確認するPCR分析の結果によって計算することができます。例えば、ロザリンド・フランクリンの白黒写真から始まり、4つのカラー画像とスポッティングリストが作成され、実証されているように、音響液体ハンドラを介して寒天マイクロプレート上の4つの異なる酵母株を見つけるために使用され、科学者の高解像度酵母絵画をもたらしました。
この変換には、新しく調製した溶液と高品質のDNA断片を使用してください。この方法は、ゲノムDNAへの定義された欠失および点突然変異の多重導入にも適用することができる。また、CRISPRレギュレーション実験も行うことができる。
このメソッドを変更して、配列内に解放 crRNA を超える数を導入して、同時に行うことができる変更の数を増やすことができます。
