培養ショウジョウバエ脳外植体中の静止神経幹細胞を再活性化する方法を開発しました。この方法は、外因性因子を培養培地に供給することができ、神経芽細胞の再活性化をアッセイすることができる。より優れた幹細胞療法は、静止期幹細胞が外因性の手がかりにどのように反応し、細胞周期に入るかをよりよく理解することによって開発される可能性があります。
手順を実演するのは、私の研究室の研究員であるスーザン・ドイルです。解剖顕微鏡下でブドウ寒天プレートから約20〜25匹の孵化したばかりの幼虫を慎重に摘み取り始める。ペトリ皿に約2ミリリットルのPBSを入れ、幼虫を含む道具の先端をPBSに2分間沈める。
2分後、皿を斜めに傾けて底に液体を溜め込み、小さなペイントブラシを使用して、幼虫を液体からペトリ皿の底までブラシで塗ります。ペイントブラシ上のすべての幼虫を収集し、PBSを含むペトリ皿に戻す前に、幼虫を70%エタノールで短時間すすいでください。作業エリア、解剖ツール、鉗子、および2つのガラス時計皿に70%エタノールをスプレーし、ベンチで乾燥させます。
補充したシュナイダーの培養液(SSM)を作り、氷の上に置きます。各ガラス時計皿に培地1ミリリットルをピペットする。滅菌チップを有するマイクロピペットを用いて、孵化したばかりの幼虫をPBSのプレートから第1のガラス時計皿中のSSMに移す。
2枚目のガラス時計皿に入れた幼虫から脳を解剖顕微鏡下で鉗子を用いてSSMで解剖し、必要に応じて倍率を調整する。片方の鉗子を使って口のフックをつかみ、もう片方の鉗子を使って体を半分下にそっとつかみ、反対方向に引っ張って幼虫を2つに分けます。15〜20個の脳を解剖した後、滅菌24ウェル培養トレイの1ウェルに1ミリリットルのSSMを加える。
マイクロピペットおよび滅菌チップを用いて、新しく解剖した脳をSSMに移し、続いて、培地を脳と共に摂氏25度で24時間インキュベートした。10マイクロリットルの5−エチニル−2'デオキシウリジンまたはEDUの10ミリモルストックを、990マイクロリットルのSSMと共に滅菌微量遠心チューブにピペットし、混合し、次いで、滅菌12ウェル培養トレイの1ウェルに1ミリリットルのEDU SSMをピペットする。SSMを含むウェルからEDU SSM溶液を含む新しいウェルに滅菌チップを有するマイクロピペットを用いて脳を移し、摂氏25度で1時間インキュベートする。
次に、EDU標識された脳を、1ミリリットルの固定液を含む同じ培養トレイ内の別のウェルに移し、脳を20分間固定する。固定後、マイクロピペットを使用して脳を72ウェルのミニトレイウェルに素早く移します。10マイクロリットルのPBTで脳を3回すすぎ、それぞれ10分間3回の洗浄を繰り返し、脳が常に液体で覆われていることを確認してください。
ピペット10マイクロリットルのブロッキング溶液を脳に。トレイを覆い、端の周りにパラフィルムのストリップで密封します。図は、インスリンおよび染色を用いてSSM中で培養して24時間後の大型EDU陽性およびデッドパン陽性神経芽細胞を示す。
インスリンを含まないシュナイダーの培地で24時間後、孵化したばかりのオレゴンR野生型脳には、4つのキノコ体神経芽細胞と1つの腹側神経芽細胞以外に、大型のEDU陽性およびデッドパン陽性神経芽細胞はなかった。共焦点画像化の間、外植された脳組織の小〜大きめの穴のような損傷を有するいくつかの脳半球が時折観察された。穴の開いた脳は分析に使用されなかった。
組織を注意深く解剖し、組織の損傷を避けるために優しくピペットをします。また、できるだけ無菌にし、あなたの文化を汚染しないようにしてください。培養培地は、異なる因子を加えることによって容易に操作することができるので、この技術は、外因性シグナル伝達および神経芽細胞静止入および退出に関する将来の仮説に対処するために使用することができる。
