Le financement de cette recherche a été assuré par un programme en neurosciences Prix de la Florida State University College of Medicine et le soutien du Département de sciences biologiques à l&#39;ex-URSS. Le financement supplémentaire a été fourni par une subvention en aide provenant du Fonds de recherche de la vente d&#39;alcool Fabricant.

1. Assemblée de la barre stabilisatrice Justification et vue d&#39;ensemble: Le système est conçu pour administrer des pourcentages contrôlées de vapeur d&#39;alcool aux mouches. Remarque: La figure 1 donne un aperçu schématique de la barre stabilisatrice mis en place comme décrit ci-dessous en trois étapes (assemblage de l&#39;écoulement de l&#39;air, mise en place de l&#39;alcool et des bouteilles d&#39;eau, et l&#39;assemblage des flacons d&#39;observation). En bref, un flux d&#39;air constant est divisé en deux fractions qui sont gondolées par l&#39;alcool et de l&#39;eau, respectivement, mélangés, et administrés à 4 flacons d&#39;observation. <ol><li> Assemblée de l&#39;Airflow <ol><li> Connecter un court morceau de tuyau souple en silicone, soit à l&#39;air d&#39;un bâtiment ou d&#39;un aérateur d&#39;aquarium pour générer un écoulement d&#39;air uniforme et fendu à l&#39;aide d&#39;un raccord en Y. Connecter la première branche au régulateur de débit d&#39;air qui commande la quantité totale d&#39;air à travers le système (généralement 1000 ml / min pendant 4 fioles d&#39;observation). </li><li> Insérer un raccord rapide dans le deuxième tubede sorte que le courant d&#39;air peut être interrompu au début de l&#39;expérience, sans affecter l&#39;écoulement d&#39;air calibré. Ajouter un raccord en Y et relier chaque tube de dérivation vers le régulateur de débit d&#39;air. </li><li> Relier les tubes pour les régulateurs de débit d&#39;air, puis relier deux mètres de débit d&#39;air. </li></ol></li><li> Mise en place des bouteilles d&#39;alcool et de l&#39;eau <ol><li> Ajouter tube flexible à la sortie des compteurs de débit d&#39;air et d&#39;insérer un tube en verre mince (sections de pipettes 1 ml) en verre avec un coude à 90 ° dans l&#39;extrémité de chaque longueur de tube. Ce sera le débit d&#39;air d&#39;admission dans les bouteilles d&#39;eau et d&#39;alcool. </li><li> Placer des bouchons en caoutchouc avec 2 trous à travers eux dans les bouteilles remplies avec de l&#39;alcool et de l&#39;eau. Gardez les deux bouteilles à une température constante de 2 ° C supérieure à la température de l&#39;air ambiant en utilisant un bain d&#39;eau. Dans nos expériences, la chambre de l&#39;environnement est maintenu à 25 ° C, tandis que le bain d&#39;eau est à 27 ° C. </li><li> Insérer la pipette de verre droit pour la uneir entrée à travers le bouchon de caoutchouc et s&#39;étendent dans le liquide jusqu&#39;à environ 1 cm du fond de la bouteille. </li><li> Insérer une section de coude de la pipette de verre dans l&#39;autre trou dans le bouchon de caoutchouc jusqu&#39;à ce que l&#39;extrémité du verre soit de niveau avec le fond du bouchon dans la bouteille. Insérer cette sortie d&#39;air dans une autre longueur de tube. </li><li> Réunir les courants d&#39;air au moyen d&#39;un raccord en Y et en utilisant une autre longueur de tube en silicone pour diriger le flux d&#39;air à travers un mélange flacon ou une bouteille vide avec des sections de pipette de verre courbés insérés à travers un bouchon en caoutchouc à deux trous. Utilisez une autre longueur de tube de silicone pour le flux d&#39;air mixte sortie. </li></ol></li><li> Assemblée de l&#39;Observation Vial <ol><li> Diviser le courant d&#39;air d&#39;évacuation sortant de la fiole de mélange 2 à 3 fois pour obtenir 4 ou 8 petits courants d&#39;air de sorte que de multiples flacons d&#39;observation peuvent être utilisées dans chaque expérience. Raccordez le tube de silicone souple pour les flacons d&#39;observation. </li><li> Mettre en place la observatisur des flacons en utilisant des flacons vides fermés par un bouchon en caoutchouc comportant deux trous à travers lesquels des tubes de verre fournissent une entrée et une sortie pour la vapeur d&#39;alcool. </li><li> Couvrir la fin du premier tube de verre avec un filet et garder le filet en place à l&#39;aide d&#39;un petit morceau de tube en plastique souple. Insérer ce tube à travers le premier trou jusqu&#39;à ce qu&#39;elle s&#39;étende à peu près la moitié de la longueur du flacon. Si nécessaire, utilisez du ruban téflon pour obtenir un ajustement parfait. </li><li> Insérer le second tube de verre également avec l&#39;extrémité couverte par le filet jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit de niveau avec le bord intérieur du bouchon de caoutchouc. </li><li> Placer les flacons horizontalement sur une feuille de papier blanc pour maximiser le contraste avec les mouches dans des conditions de faible lumière rouge. </li><li> Mélanger fractions appropriées du flux d&#39;air à barboter dans l&#39;alcool et le flux d&#39;air à barboter dans l&#39;eau. Surveillance de la pression de l&#39;air en continu et faire les ajustements nécessaires pour maintenir le mélange souhaité des courants d&#39;air. Remarque: Le fonctionnement continude plusieurs essais Fly Bar en parallèle ou même un seul essai dans une petite pièce peut conduire à une accumulation notable de vapeur d&#39;alcool. Pour éviter la libération continue de la vapeur d&#39;alcool qui peuvent potentiellement affecter le chercheur dans une pièce fermée, un système approprié doit être mis en place qui permet d&#39;éliminer convenablement la vapeur d&#39;alcool généré au cours de l&#39;expérience. Pour éliminer les vapeurs d&#39;alcool, connecter un morceau de tuyau 6-12 pouces sur le second tube de verre en saillie de chaque flacon, les regrouper et ordonner à un système d&#39;entonnoir vide. Les chercheurs doivent aussi veiller à ce que la salle d&#39;essai expérimental est correctement ventilée. </li></ol></li></ol> 2. Préparation des animaux d&#39;expérimentation Justification et aperçu: culture et de logements de vol appropriée permettra de réduire la variabilité des données. Ce résultat est obtenu grâce à la standardisation et la réduction du stress vécu par les mouches. Pour cette raison, aucune anesthésie (CO 2 ou alternatives) est utilisé During quelconque des étapes suivantes du protocole. En outre, les mouches doivent être appariés pour l&#39;âge à travers des expériences et des points de temps pour minimiser la variabilité comme c&#39;est la norme pour d&#39;autres analyses comportementales, y compris l&#39;apprentissage et de la mémoire des expériences 17. La lumière différente: l&#39;obscurité peuvent être utilisés pour sonder la fonction de l&#39;horloge circadienne dans la réponse comportementale à l&#39;éthanol. Pour déterminer si un rythme diurne existe, les expériences peuvent être effectuées en vertu d&#39;un cycle de LD définis pour mesurer la performance à Zeitgeber temps spécifique (ZT). ZT 0 représente l&#39;aube et est défini comme le temps de lumières sous cycles LD, alors que ZT 12, les feux sont éteints temps avec un cycle de LD 12:12 h. Dans des conditions constantes, le temps circadien (CT) mesure le temps pour l&#39;animal en l&#39;absence de signaux de l&#39;environnement, c&#39;est à dire le temps de roue libre, et est liée au cycle LD d&#39;entraînement précédente. Dans de type sauvage drosophile, CT reflète la ZT précédente pour la première de plusieurs jourss dans des conditions constantes que la période circadienne roue libre et les rythmes sont ~ 24 h. Pour mesurer la modulation circadienne et d&#39;éliminer les effets de lumière aiguë sur le comportement, les mouches sont entraînées à la lumière: cycles sombres et ensuite transférés à l&#39;obscurité constante (DD) avant les expériences. Expériences circadiens sont effectuées sur la deuxième journée de DD pour mesurer la performance à circadien temps spécifique (CT). Chez la drosophile, la lumière continue (LL) conditions entraînent un dysfonctionnement circadien avec des oscillations moléculaires mouillées ou supprimés de base gènes circadiens et la perturbation des rythmes circadiens de comportement, comme en témoigne l&#39;activité locomotrice arythmique 18-21 et arythmique mémoire à court terme 17. Le protocole est optimisée pour les études circadiens et peut être simplifié pour d&#39;autres expériences. Toutes les expériences circadiens sont effectuées avec lumière tamisée rouge (lumière rouge de tête ambiante &lt;1 lux au-dessus de banc, les petites lumières rouges utilisé à 12 pouces de tubes~ 1 lux de lumière). <ol><li> Arrière vol à 25 ° C sous 12h12 h lumière: conditions d&#39;entraînement sombres (LD). </li><li> Recueillir les mouches fraîchement éclos à la fin de la période de lumière du jour le jour 1 et les stocker pendant 24 heures dans des conditions de LD en tenant flacons contenant une petite quantité d&#39;aliments riches en concentration agar pour minimiser la viscosité des aliments. Remarque: Pour assurer la santé, vol normalement développés sont collectées, utilisez uniquement des mouches capturées dans les premiers jours après l&#39;éclosion commence dans un flacon de culture. </li><li> Recueillir des lots d&#39;environ 30 (25-35) vole en utilisant un aspirateur le jour 2 vers la fin de la période de lumière, et le transfert des flacons de maintien frais. </li><li> Utilisez une forte source de lumière pour diriger vol à l&#39;extrémité du flacon. Dans cette gamme, le nombre exact de vol dans chaque flacon n&#39;est pas critique tant que les observations comportementales sont rapportés en pourcentages en nombre total de mouches comptées à la fin de chaque expérience. </li><li> Maintenir vol dans des conditions DD à 25 ° C for deux jours. </li><li> Le jour de l&#39;expérience, toutes les mouches placer logés dans des conditions différentes ou d&#39;autres incubateurs de la salle de comportement expérimental dans la chambre pendant au moins 1 heure avant l&#39;expérience. Acclimatation réduit la variabilité due aux changements de température ou d&#39;humidité. </li><li> Faire des observations à six points de temps par jour (CT 1, 5, 9, 13, 17 et 21) afin de tester pour la modulation circadienne de comportement. </li><li> Comparez plusieurs points dans le temps au sein d&#39;un ensemble unique d&#39;expériences comportementales pour augmenter la robustesse de la conception expérimentale et de minimiser la variabilité spécifique à une seule expérience. Par exemple, les observations de CT 1 et CT 13 peuvent être obtenues simultanément si deux incubateurs avec des horaires clair-obscur opposés sont utilisés pour l&#39;entraînement. Remarque: Le procédé ci-dessus décrit la préparation d&#39;animaux de laboratoire pour des dosages effectués en état circadien d&#39;obscurité constante. Différents lumière: conditions sombres peuvent être utilisés pour sonder la fonction de l&#39;horlogedans les réponses comportementales à l&#39;alcool. Pour déterminer si un rythme diurne existe les expériences peuvent être réalisées en vertu d&#39;un cycle de LD pour mesurer la performance à Zeitgeber temps spécifique (ZT). En outre, le protocole peut être utilisé avec des mouches élevés dans des conditions de lumière constante pour la vérification des expériences dysfonction circadien. Pour les protocoles alternatifs qui testent vol logés dans des conditions de lumière, tests comportementaux doivent encore être effectuées dans des conditions sombres. Les mouches doivent être transférés dans l&#39;obscurité pendant 1 heure avant l&#39;expérience pour minimiser la variabilité du comportement dû aux effets aigus de la lumière sur le comportement. </li></ol> 3. Observations comportementales Justification et aperçu: Le protocole d&#39;administration d&#39;alcool suivante est optimisé pour observations sous condition de faible lumière rouge. Les deux mesures comportementales Lorr et sédation représentent deux points distincts de mouche ivresse. Lorr représente un point fin d&#39;ébriété incorporant la perte omoteur de f et le contrôle postural, tandis que les mesures de sédation un point final très tardif de l&#39;intoxication. Génotype ou modulation circadienne peuvent affecter ces deux mesures différentes; donc on peut souhaiter examiner à la fois. En bref, les mouches sont chargées dans les flacons, le numéro de vol affichant LORR sédation ou reçu sont toutes les 5 minutes pendant l&#39;exposition à la vapeur d&#39;alcool, et le nombre total de mouches comptées à la fin de l&#39;expérience. <ol><li> Avant de commencer l&#39;expérience, exécutez l&#39;air à travers le système (air barboter dans des bouteilles d&#39;eau et d&#39;alcool) pendant au moins 10 min et utiliser ce temps pour calibrer les flux d&#39;air. </li><li> Débranchez la libération rapide d&#39;arrêter le flux d&#39;air. Chargez les mouches dans les flacons, et rebranchez le flux d&#39;air et commencer les minuteries. Remarque: Si les mouches qui ne répondent pas ou mouches mortes sont laissées dans les flacons de retenue, cela pourrait être une indication de conditions de stress. En général, ces conditions peuvent être soulagés en logeant moins de mouches dans les flacons de maintien ou de diminuer la viscosité des aliments en utilisant une légèrela concentration en gélose ment plus élevé pendant la préparation des aliments. Pour les analyses comportementales optimales et une variabilité minimale entre les expériences, vol doivent être en bonne santé avant les expériences. </li><li> Pour la tenue de l&#39;heure exacte, utilisez une minuterie pour garder une trace de la durée totale de l&#39;exposition de l&#39;alcool et d&#39;utiliser un second minuteur-retour pour marquer les intervalles de 5 min. </li><li> Placez un morceau de papier blanc sous les coupes pour augmenter le contraste et voler visibilité, en particulier dans des conditions de faible lumière rouge. </li><li> Vérifiez régulièrement le flux d&#39;air lors d&#39;une expérience de maintenir des niveaux constants. Généralement, une fois que les flux d&#39;air se sont stabilisés, ils restent stables pendant la durée de l&#39;expérience. </li><li> Comptez le nombre de mouches qui ont perdu leur réflexe de redressement, une fois toutes les 5 minutes pendant une période de 1 heure. Comme la sensibilité à l&#39;alcool varie entre génotypes et des arrière-plans génétiques, il peut être souhaitable d&#39;effectuer des évaluations plus fréquentes ou de procéder à l&#39;expérience pendant une période de temps plus longue. </li><li> Soulevez le slightl flacony à partir de la surface, et à diriger la lumière provenant d&#39;une lampe-torche de lumière rouge vers le papier derrière le flacon. Gardez les lampes de poche rouges à main à une distance d&#39;au moins 12 pouces dans le flacon expérimental pour maintenir des niveaux ne dépassant pas 1 lux de lumière pour toutes les expériences dans des conditions de faible lumière rouge. </li><li> Mesurer les niveaux d&#39;éclairage utilisant un posemètre à établir des normes pour toutes les expériences. </li><li> Déterminer le nombre de mouches qui ont perdu leur réflexe de redressement en appliquant un robinet ferme le flacon et compter le nombre de mouches ne parviennent pas à se redresser dans environ 4 sec. Les mouches qui affichent Lorr peuvent encore bouger les jambes et les ailes, mais ne peuvent pas se transformer en position verticale. </li><li> A la fin de la session, compter le nombre total de mouches dans chaque flacon. Remarque: Parfois, une seule mouche peut être pris entre le bouchon et le côté lors du chargement vole dans les flacons expérimentaux. Comme cela se fait dans l&#39;obscurité, il ne peut pas être facilement remarqué, il est donc nécessaire de compter le engourdi totaleer de vol à la fin de l&#39;expérience de calculer correctement les pourcentages. </li></ol> En outre, ce procédé peut également être utilisé pour mesurer la sédation de vol, qui représente un critère d&#39;évaluation du comportement différent. Alors que les mouches sédation ont perdu leur bon réflexe, la sédation nécessite une plus grande exposition à l&#39;alcool. Comportemental, la sédation peut être caractérisé par l&#39;absence totale de l&#39;activité motrice apparente avec des mouches restant immobile dans le flacon après le cabinet d&#39;aa robinet dans le flacon. Pour la sédation, compter le nombre de mouches qui restent immobiles sans jambe en agitant après la livraison d&#39;un robinet cabinet du flacon. En outre, le flacon peut être roulé côté à l&#39;autre afin de déterminer si les mouches individuels conservent leur réflexe saisissant. 4. Analyse des données <ol><li> Déterminer le pourcentage Lorr à chaque fois évaluée sur la base du nombre total de mouches dans chaque flacon. </li><li> différences Estimer entre les points ou les souches de temps circadiens par calculating du LORR de 50% pour chaque échantillon qui tombe à l&#39;intérieur de la partie linéaire de la courbe sigmoïde (voir figure 2 ci-dessous). </li><li> Autres statistiques: <ol><li> Si la comparaison entre les génotypes sont prévues, il est souhaitable d&#39;analyser tout le cours du temps en utilisant des mesures répétées ANOVAand pour déterminer la plage de points de temps que les différences sont significatives par tests post-hoc (Figure 3). Pour ces tests, nous préférons utiliser une valeur de 0,001. Ceci permet à des différences des temps d&#39;exposition individuelles à évaluer ainsi que les différences entre les génotypes à la pente de la courbe. </li><li> Les différences de sensibilité pour peuvent être déterminées pour des moments précis de l&#39;exposition à l&#39;alcool pour une réponse particulière tels que la sédation de la partie linéaire de la courbe (figure 4). </li><li> Les différences entre les souches ou les points de temps circadien peuvent être estimées en utilisant F-statistiques standards et des tests post-hoc. </li></ol></li></ol>

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	<li>Linde, K., Lyons, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+modulation+of+acute+alcohol+sensitivity+but+not+acute+tolerance+in+Drosophila.">Circadian modulation of acute alcohol sensitivity but not acute tolerance in Drosophila.</a> Chronobiol. Int. 28, 397-406 (2011).</li><li>Kaun, K. R., Azanchi, R., Maung, Z., Hirsh, J., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+for+alcohol+reward.">A Drosophila model for alcohol reward.</a> Nat Neurosci. 14, 612-619 (2011).</li><li>Shohat-Ophir, G., Kaun, K. R., Azanchi, R., Mohammed, H., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+deprivation+increases+ethanol+intake+in+Drosophila.">Sexual deprivation increases ethanol intake in Drosophila.</a> Science. 335, 1351-1355 (2012).</li><li>Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fruit+fly:+A+model+organism+to+study+the+genetics+of+alcohol+abuse+and+addiction.">The fruit fly: A model organism to study the genetics of alcohol abuse and addiction.</a> Cell. 93, 909-912 (1998).</li><li>Guarnieri, D. J., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster,+a+genetic+model+system+for+alcohol+research.">Drosophila melanogaster, a genetic model system for alcohol research.</a> International Review of Neurobiology. 54, 203-232 (2003).</li><li>Scholz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intoxicated+fly+brains:+Neurons+mediating+ethanol-induced+behaviors.">Intoxicated fly brains: Neurons mediating ethanol-induced behaviors.</a> J. Neurogenet. 23, 111-119 (2009).</li><li>Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T. Y., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+analysis+of+ethanol-induced+locomotor+stimulation+in+Drosophila.">High-resolution analysis of ethanol-induced locomotor stimulation in Drosophila.</a> J. Neurosci. 22, 11035-11044 (2002).</li><li>Schumann, G., Spanagel, R., Mann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candidate+genes+for+alcohol+dependence:+Animal+studies.">Candidate genes for alcohol dependence: Animal studies.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 27, 880-888 (2003).</li><li>Singh, C. M., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+control+of+acute+ethanol-induced+behaviors+in+Drosophila.">Genetic control of acute ethanol-induced behaviors in Drosophila.</a> Alcohol Clin Exp Res. 24, 1127-1136 (2000).</li><li>Perreau-Lenz, S., Zghoul, T., de Fonseca, F. R., Spanagel, R., Bilbao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+regulation+of+central+ethanol+sensitivity+by+the+mPer2+gene.">Circadian regulation of central ethanol sensitivity by the mPer2 gene.</a> Addiction Biology. 14, 253-259 (2009).</li><li>Brager, A. J., Prosser, R. A., Glass, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+and+acamprosate+modulation+of+elevated+ethanol+drinking+in+mPer2+clock+gene+mutant+mice.">Circadian and acamprosate modulation of elevated ethanol drinking in mPer2 clock gene mutant mice.</a> Chronobiol. Int. 28, 664-672 (2011).</li><li>Sinclair, J. D., Geller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+consumption+by+rats+under+different+lighting+conditions.">Ethanol consumption by rats under different lighting conditions.</a> Science. 175, 1143-1144 (1972).</li><li>Danel, T., Jeanson, R., Touitou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+pattern+in+consumption+of+the+first+drink+of+the+day+in+alcohol-dependent+persons.">Temporal pattern in consumption of the first drink of the day in alcohol-dependent persons.</a> Chronobiol. Int. 20, 1093-1102 (2003).</li><li>Kapfhamer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taok2+controls+behavioral+response+to+ethanol+in+mice.">Taok2 controls behavioral response to ethanol in mice.</a> Genes, brain, and behavior. 12 (1), 87-97 (2012).</li><li>Lasek, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionary+conserved+role+for+anaplastic+lymphoma+kinase+in+behavioral+responses+to+ethanol.">An evolutionary conserved role for anaplastic lymphoma kinase in behavioral responses to ethanol.</a> PLoS One. 6, 226-236 (2011).</li><li>Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lmo+genes+regulate+behavioral+responses+to+ethanol+in+Drosophila+melanogaster+and+the+mouse.">Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse.</a> Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).</li><li>Lyons, L. C., Roman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+modulation+of+short-term+memory+in+Drosophila.">Circadian modulation of short-term memory in Drosophila.</a> Learning &amp; Memory. 16, 19-27 (2009).</li><li>Hamblen-Coyle, M. J., Wheeler, D. A., Rutila, J. E., Rosbash, M., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior+of+period-altered+circadian-rhythm+mutants+of+Drosophila+in+ligh-dark+cycles+(Diptera+Drosophilidae).">Behavior of period-altered circadian-rhythm mutants of Drosophila in ligh-dark cycles (Diptera Drosophilidae).</a> J. Insect Behav. 5, 417-446 (1992).</li><li>Konopka, R. J., Pittendrigh, C., Orr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+behavior+associated+with+altered+homeostasis+and+photosensitivity+of+Drosophila+clock+mutants.">Reciprocal behavior associated with altered homeostasis and photosensitivity of Drosophila clock mutants.</a> J. Neurogenet. 6, 1-10 (1989).</li><li>Power, J. M., Ringo, J. M., Dowse, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+period+mutations+and+light+on+the+activity+rhythms+of+Drosophila+melanogaster.">The effects of period mutations and light on the activity rhythms of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Biological Rhythms. 10, 267-280 (1995).</li><li>Yoshii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+cycles+drive+Drosophila+circadian+oscillation+in+constant+light+that+otherwise+induces+behavioural+arrhythmicity.">Temperature cycles drive Drosophila circadian oscillation in constant light that otherwise induces behavioural arrhythmicity.</a> Eur. J. Neurosci. 22, 1176-1184 (2005).</li><li>Berger, K. H., Heberlein, U., Moore, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+chronic:+two+distinct+forms+of+ethanol+tolerance+in+Drosophila.">Rapid and chronic: two distinct forms of ethanol tolerance in Drosophila.</a> Alcohol Clin Exp Res. 28, 1469-1480 (2004).</li><li>Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. M., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+ethanol+tolerance+in+Drosophila.">Functional ethanol tolerance in Drosophila.</a> Neuron. 28, 261-271 (2000).</li><li>Kong, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol-regulated+genes+that+contribute+to+ethanol+sensitivity+and+rapid+tolerance+in+Drosophila.">Ethanol-regulated genes that contribute to ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila.</a> Alcohol Clin Exp Res. 34, 302-316 (2010).</li><li>Borycz, J., Borycz, J., Kubow, A., Lloyd, V., Meinertzhagen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+ABC+transporter+mutants+white,+brown+and+scarlet+have+altered+contents+and+distribution+of+biogenic+amines+in+the+brain.">Drosophila ABC transporter mutants white, brown and scarlet have altered contents and distribution of biogenic amines in the brain.</a> J. Exp. Biol. 211, 3454-3466 (2008).</li><li>Sitaraman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+is+necessary+for+place+memory+in+Drosophila.">Serotonin is necessary for place memory in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 5579-5584 (2008).</li><li>Bainton, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+modulates+acute+responses+to+cocaine,+nicotine+and+ethanol+in+Drosophila.">Dopamine modulates acute responses to cocaine, nicotine and ethanol in Drosophila.</a> Current Biology. 10, 187-194 (2000).</li><li>Kong, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pair+of+dopamine+neurons+target+the+D1-like+dopamine+receptor+DopR+in+the+central+complex+to+promote+ethanol-stimulated+locomotion+in+Drosophila.">A pair of dopamine neurons target the D1-like dopamine receptor DopR in the central complex to promote ethanol-stimulated locomotion in Drosophila.</a> Plos One. 5, (2010).</li><li>Xu, J., Kochanek, K. D., Murphy, S. L., Tejada-Vera, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Deaths: Final data for 2007. , (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+National+Center+on+Addiction+and+Substance+Abuse.">The National Center on Addiction and Substance Abuse.</a> Shoveling up II: The impact of substance abuse on federal, state and local budgets. , (2009).</li><li>NIAAA, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimated+economic+costs+of+alcohol+abuse+in+the+United+States.">Estimated economic costs of alcohol abuse in the United States.</a> , (1992).</li><li>Devineni, A. V., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+ethanol+consumption+in+Drosophila+models+features+of+addiction.">Preferential ethanol consumption in Drosophila models features of addiction.</a> Current Biology. 19, 2126-2132 (2009).</li><li>Devineni, A. V., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addiction-like+behavior+in+Drosophila.">Addiction-like behavior in Drosophila.</a> Communicative &amp; Integrative Biology. 3, 357-359 (2010).</li><li>Rodan, A. R., Rothenfluh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+behavioral+alcohol+responses+in+Drosophila.">The genetics of behavioral alcohol responses in Drosophila.</a> International Review of Neurobiology. 91, 25-51 (2010).</li><li>Boothroyd, C. E., Young, M. W., Pfaff, D. W., Kieffer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+Biophysical+Mechanisms+of+Arousal,+Alertness,+and+Attention.">Molecular and Biophysical Mechanisms of Arousal, Alertness, and Attention.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1129, 350-357 (2008).</li><li>Nitabach, M. N., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+Drosophila+circadian+control+circuit.">Organization of the Drosophila circadian control circuit.</a> Current Biology. 18, 84-93 (2008).</li><li>Sheeba, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+melanogaster+circadian+pacemaker+circuit.">The Drosophila melanogaster circadian pacemaker circuit.</a> J. Genet. 87, 485-493 (2008).</li><li>Cohan, F. M., Graf, J. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latitudinal+cline+in+Drosophila+melanogaster+for+knockdown+resistance+to+ethanol+fumes+and+for+rates+of+response+to+selection+for+further+resistance.">Latitudinal cline in Drosophila melanogaster for knockdown resistance to ethanol fumes and for rates of response to selection for further resistance.</a> Evolution. , 278-293 (1985).</li><li>Moore, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+intoxication+in+Drosophila:+Genetic+and+pharmacological+evidence+for+regulation+by+the+cAMP+signaling+pathway.">Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway.</a> Cell. 93, 997-1007 (1998).</li><li>Berger, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+sensitivity+and+tolerance+in+long-term+memory+mutants+of+Drosophila+melanogaster.">Ethanol sensitivity and tolerance in long-term memory mutants of Drosophila melanogaster.</a> Alcohol Clin Exp Res. 32, 895-908 (2008).</li><li>Pohl, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+Genes+Differentially+Affect+Tolerance+to+Ethanol.">Circadian Genes Differentially Affect Tolerance to Ethanol.</a> in Drosophila. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. , (2013).</li><li>Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assay+for+evoked+locomotor+behavior+in+Drosophila+reveals+a+role+for+integrins+in+ethanol+sensitivity+and+rapid+ethanol+tolerance.">An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 33, 1794-1805 (2009).</li><li>Rothenfluh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+behavioral+responses+to+ethanol+are+regulated+by+alternate+RhoGAP18B+isoforms.">Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms.</a> Cell. 127, (1016).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Les coûts de l&#39;abus d&#39;alcool et l&#39;alcoolisme pour la société est énorme, tant en termes de coûts humains et économiques 29 30,31. Drosophile comme modèle propose un système rapide et souple pour examiner rapidement les réponses comportementales d&#39;un grand nombre d&#39;individus et en tant que tel a été largement utilisé à la fois pour la recherche et l&#39;alcool 5,7,32-34 circadien 35-37. Ici, nous avons décrit un proto...

Drosophila melanogaster démontrer réponses comportementales biphasique à l&#39;alcool 1 qui sont analogues aux réponses humaines à ce médicament 2,3. Lors de l&#39;exposition initiale à de faibles concentrations d&#39;alcool, les mouches augmentation de l&#39;activité locomotrice d&#39;exposition, remplacé par un manque de coordination motrice, la perte du contrôle postural et les réflexes de redressement (perte du réflexe de redressement: Lorr), et une sédation (absence complète de l&#39;activité du moteur en réponse à la stimulation mécanique) que l&#39;exposition à l&#39;alcool progresse 4-9. L&#39;horloge circadienne endogène est une forte modulateur de la sensibilité de l&#39;alcool et de la toxicité comme observé chez les souris, les rats 10,11 12, et les humains 13. Les avancées récentes dans la recherche drosophile ont montré l&#39;horloge circadienne module sensibilité aiguë à l&#39;alcool mais pas tolérance à l&#39;alcool 1. Les approches génétiques puissants disponibles chez la drosophile par des études de mutants et les manipulations transgéniques de l&#39;espaceet l&#39;expression des gènes temporelle fournir un système qui permet de rapides progrès dans l&#39;identification des mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents aux comportements complexes. L&#39;utilisation de la drosophile comme un outil d&#39;enquête a permis des avancées importantes dans la compréhension de la neurobiologie de l&#39;alcool qui peuvent être traduits rapidement aux mammifères 14-16. Afin de faciliter la compréhension des mécanismes moléculaires par lesquels l&#39;horloge circadienne module la sensibilité à l&#39;alcool et à mesurer de manière uniforme à travers les réponses comportementales points de temps circadiens, un protocole d&#39;administration de l&#39;alcool approprié pour une utilisation dans des conditions de faible lumière rouge est nécessaire. Pour la drosophile, l&#39;alcool peut être administré par une supplémentation alimentaire pour une exposition chronique ou de manière fiable grâce à l&#39;administration d&#39;alcool sous forme de vapeur pour des expositions aiguës. Ici, nous décrivons un protocole d&#39;administration d&#39;alcool approprié pour l&#39;évaluation de la modulation circadienne de la perte-de-réflexe (Lorr) 1 ainsi quesédation. Les mouches sont entraînés avec 12 h: 12 h cycles LD à température constante, puis transférés à un régime de lumière contrôlée pendant 2-5 jours en fonction de la question expérimentale. Les mouches sont exposés à la vapeur d&#39;éthanol dans un dispositif connu sous le nom la barre stabilisatrice. Dans ce dispositif, des quantités contrôlées d&#39;air sont à barboter dans l&#39;eau et l&#39;alcool; les vapeurs sont ensuite mélangés et dirigés dans un boîtier flacon les mouches. Toutes les 5 min vol sont marqués pour le nombre que ne parvient pas à afficher redressement réflexes ou sont devenus des sédatifs. Pourcentages Lorr pour chaque point de temps sont calculés et comparés entre les points de temps circadiens ou entre les souches de mouches. La simplicité et la fiabilité de la livraison d&#39;alcool en utilisant la livraison d&#39;alcool barre stabilisatrice combinée avec des options d&#39;analyse comportementale fournit un avantage significatif pour les expériences menées circadiens dans des conditions sombres.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="815">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Alcohol 190 proof</td>
			<td style="width:115px;">Various</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Name of Material</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:296px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Aerator</td>
			<td style="width:115px;">Local pet store</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:296px;">We use Whisper 60</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Silicone tubing 1/8&#8221;</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">408060-0030</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">120&#176; Y Connector</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82017-256</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Quick disconnects</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">46600-048</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Plastic tube clamps</td>
			<td style="width:115px;">Bell-art products</td>
			<td style="width:119px;">132250000</td>
			<td style="width:296px;">Either this or next</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Miniature Air Regulator</td>
			<td style="width:115px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">8727K11</td>
			<td style="width:296px;">Either this or previous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Miniature Air Regulator Mounting Bracket</td>
			<td style="width:115px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">9891K66</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Gilmont size 12 flow meter</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">29895-242</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Tool clips</td>
			<td style="width:115px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">1722A43</td>
			<td style="width:296px;">To hold flow meters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Vial</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89092-722</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Rubber stopper with two holes</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">59585-186</td>
			<td style="width:296px;">Fits in vials</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">5 mm Pyrex Glass tubes</td>
			<td style="width:115px;">Trikinetics</td>
			<td style="width:119px;">PGT5x65</td>
			<td style="width:296px;">Fits best in previous stopper.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Teflon tape</td>
			<td style="width:115px;">Hardware store</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:296px;">To achieve snug fit in stoppers if necessary</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Rubber stopper with two holes</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">59582-122</td>
			<td style="width:296px;">Fits our bottles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Disposable glass pipets</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">53283-768</td>
			<td style="width:296px;">Cut to length and bend by heating</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Very fine nylon netting</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">Various</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">15 watt bulbs</td>
			<td style="width:115px;">Hardware store</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:296px;">Overhead red light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Photographic red safe light filters</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:296px;">Overhead red light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Mini Flashlights with red filters</td>
			<td style="width:115px;">Mag-light</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the flybar: administering alcohol to flies

Les mouches des fruits (Drosophila melanogaster) sont un modèle établi pour la recherche de l&#39;alcool et de la biologie circadienne. Récemment, nous avons montré que l&#39;horloge circadienne module la sensibilité à l&#39;alcool, mais pas la formation de la tolérance. Ici, nous décrivons notre protocole en détail. L&#39;alcool est administré à vol utilisant la barre stabilisatrice. Dans cette configuration, la vapeur d&#39;alcool saturé est mélangé avec l&#39;air humidifié dans des proportions fixes, et administré à vol dans quatre tubes simultanément. Les mouches sont élevées dans des conditions normalisées de manière à minimiser la variation entre les répétitions. Trois jours anciens mouches de différents génotypes ou de traitements sont utilisés pour les expériences, de préférence par vol de deux points différents dans le temps (par exemple, CT 5 et CT 17) de faire des comparaisons directes possible correspondant. Pendant l&#39;expérience, les mouches sont exposés pendant 1 heure pour le pourcentage prédéterminé de la vapeur d&#39;alcool et le nombre de mouches qui présentent la perte du réflexe de redressement (Lorr) ou sedation sont comptées toutes les 5 min. Les données peuvent être analysées selon trois approches statistiques différentes. La première consiste à déterminer l&#39;heure à laquelle 50% des mouches ont perdu leur réflexe de redressement et en utilisant une analyse de la variance (ANOVA) pour déterminer s&#39;il existe des différences significatives entre les points dans le temps. Le second est de déterminer le pourcentage des mouches qui montrent Lorr après un certain nombre de minutes, suivie d&#39;une analyse de variance. La dernière méthode est d&#39;analyser l&#39;ensemble des séries chronologiques en utilisant les statistiques multivariées. Le protocole peut également être utilisé pour des expériences ou des comparaisons non circadiens entre les génotypes.

Modulation circadienne de l&#39;alcool Sensibilité à l&#39;aide de 50% Lorr comme un marqueur. Un exemple représentatif montrant modulation circadienne de la sensibilité de l&#39;alcool au cours de la journée est présenté à la figure 2. Lorr a été mesurée à six points dans le temps au cours de la 2 e journée de DD à Canton-S et les 50% Lorr a été déterminée pour chaque point de temps. L&#39;analyse a montré un effet significatif du moment de la ...

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The FlyBar: Administering Alcohol to Flies

Drosophila a émergé comme un système modèle important pour disséquer les fondements cellulaires et moléculaires de réponses comportementales à l&#39;alcool. Nous présentons ici un protocole pour la collecte de données sur la sensibilité de l&#39;alcool dans un contexte circadien qui peut être facilement appliquée à d&#39;autres expériences et est bien adapté pour la recherche de premier cycle.

La barre stabilisatrice: Administration de l&#39;alcool à mouches

Fruit flies (Drosophila melanogaster) are an established model for both alcohol research and circadian biology. Recently, we showed that the circadian ...

the-flybar-administering-alcohol-to-flies

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.6K vues.  Florida State University.  Drosophila a émergé comme un système modèle important pour disséquer les fondements cellulaires et moléculaires de réponses comportementales à l'alcool. Nous présentons ici un protocole pour la collecte de données sur la sensibilité de l'alcool dans un contexte circadien qui peut être facilement appliquée à d'autres expériences et est bien adapté pour la recherche de premier cycle. 

Vidéo: The FlyBar: Administering Alcohol to Flies

Assessment of Ultrasonic Vocalizations During Drug Self-administration in Rats

Drug self-administration procedures are commonly used to study behavioral and neurochemical changes associated with human drug abuse, addiction and relapse. Various types of behavioral activity are commonly utilized as measures of drug motivation in animals. However, a crucial component of drug abuse relapse in abstinent cocaine users is "drug craving", which is difficult to model in animals, as it often occurs in the absence of overt behaviors. Yet, it is possible that a class of ultrasonic vocalizations (USVs) in rats may be a useful marker for affective responses to drug administration, drug anticipation and even drug craving. Rats vocalize in ultrasonic frequencies that serve as a communicatory function and express subjective emotional states. Several studies have shown that different call frequency ranges are associated with negative and positive emotional states. For instance, high frequency calls ("50-kHz") are associated with positive affect, whereas low frequency calls ("22-kHz") represent a negative emotional state. This article describes a procedure to assess rat USVs associated with daily cocaine self-administration. For this procedure, we utilized standard single-lever operant chambers housed within sound-attenuating boxes for cocaine self-administration sessions and utilized ultrasonic microphones, multi-channel recording hardware and specialized software programs to detect and analyze USVs. USVs measurements reflect emotionality of rats before, during and after drug availability and can be correlated with commonly assessed drug self-administration behavioral data such lever responses, inter-response intervals and locomotor activity. Since USVs can be assessed during intervals prior to drug availability (e.g., anticipatory USVs) and during drug extinction trials, changes in affect associated with drug anticipation and drug abstinence can also be determined. In addition, determining USV changes over the course of short- and long-term drug exposure can provide a more detailed interpretation of drug exposure effects on affective functioning.

Drug self-administration and ultrasonic vocalizations (USV) are used as behavioral assessments in animal research, but rarely in combination. The purpose of this article is to describe the advantages of recording USVs during drug self-administration procedures to assess affective responses to drug experience.

Évaluation de vocalisations ultrasoniques Pendant médicaments auto-administration chez le rat

Drug self-administration procedures are commonly used to study behavioral and neurochemical changes associated with human drug abuse, addiction and ...

Recherche

Neurosciences

A Simple Way to Measure Ethanol Sensitivity in Flies

Low doses of ethanol cause flies to become hyperactive, while high doses are sedating. The sensitivity to ethanol-induced sedation of a given fly strain is correlated with that strain s ethanol preference, and therefore sedation is a highly relevant measure to study the genetics of alcohol responses and drinking. We demonstrate a simple way to expose flies to ethanol and measure its intoxicating effects. The assay we describe can determine acute sensitivity, as well as ethanol tolerance induced by repeat exposure. It does not require a technically involved setup, and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A simple assay to measure the sedating effects of ethanol on Drosophila flies, based on the loss of righting reflex, is described.

Une façon simple de mesurer la sensibilité d&#39;éthanol dans les mouches

Low doses of ethanol cause flies to become hyperactive, while high doses are sedating. The sensitivity to ethanol-induced sedation of a given fly strain ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation des neurones à partir de tranches de cerveau de rongeurs pour étudier la transmission synaptique et de l&#39;image terminaisons présynaptiques

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Experimental Methods for Testing the Effects of Neurotrophic Peptide, ADNF-9, Against Alcohol-induced Apoptosis during Pregnancy in C57BL/6 Mice

Experimental designs for investigating the effects of prenatal alcohol exposure during early embryonic stages in fetal brain growth are challenging. This is mostly due to the difficulty of microdissection of fetal brains and their sectioning for determination of apoptotic cells caused by prenatal exposure to alcohol. The experiments described here provide visualized techniques from mice breeding to the identification of cell death in fetal brain tissue. This study used C57BL/6 mice as the animal model for studying fetal alcohol exposure and the role of trophic peptide against alcohol-induced apoptosis. The breeding consists of a 2-hr matting window to determine the exact stage of embryonic age. An established fetal alcohol exposure model has been used in this study to determine the effects of prenatal alcohol exposure in fetal brains. This involves free access to alcohol or pair-fed liquid diets as the sole source of nutrients for the pregnant mice.
The techniques involving dissection of fetuses and microdissection of fetal brains are described carefully, since the latter can be challenging. Microdissection requires a stereomicroscope and ultra-fine forceps. Step-by-step procedures for dissecting the fetal brains are provided visually. The fetal brains are dissected from the base of the primordium olfactory bulb to the base of the metencephalon.
For investigating apoptosis, fetal brains are first embedded in gelatin using a peel-away mold to facilitate their sectioning with a vibratome apparatus. Fetal brains embedded and fixed in paraformaldehyde are easily sectioned, and the free floating sections can be mounted in superfrost plus slides for determination of apoptosis or cell death.
TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick End Labeling; TdT: terminal deoxynucleotidyl transferase) assay has been used to identify cell death or apoptotic cells. It is noteworthy that apoptosis and cell-mediated cytotoxicity are characterized by DNA fragmentation. Thus, the visualized TUNEL-positive cells are indicative of cell death or apoptotic cells.
The experimental designs here provide information about the use of an established liquid diet for studying the effects of alcohol and the role of neurotrophic peptides during pregnancy in fetal brains. This involves breeding and feeding pregnant mice, microdissecting fetal brains, and determining apoptosis. Together, these visual and textual techniques might be a source for investigating prenatal exposure of harmful agents in fetal brains.

The experimental designs proposed here focus on studying the effects of alcohol exposure in apoptosis and the application of neurotrophic peptide during pregnancy in fetal brain. A detailed description from the breeding to the collection of fetal brains is described. Techniques for determination of apoptosis are also described in detail.

Méthodes expérimentales pour tester les effets du peptide neurotrophique, ADNF-9, contre l&#39;apoptose induite par l&#39;alcool pendant la grossesse dans C57BL / 6

Experimental designs for investigating the effects of prenatal alcohol exposure during early embryonic stages in fetal brain growth are challenging. This ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation of the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient for the expression of foreign genes into neuronal cells. In this manuscript we provide a method that demonstrates uniquely how to electroporate DNA into the avian hindbrain at E2.75 in order to specifically label a subset of neuronal progenitors, and how to follow their axonal projections and synaptic targets at much advanced stages of development, up to E14.5. We have utilized novel genetic tools including specific enhancer elements, Cre/Lox - based plasmids and the PiggyBac-mediated DNA transposition system to drive GFP expression in a subtype of hindbrain cells (the dorsal most subgroup of interneurons, dA1). Axonal trajectories and targets of dA1 axons are followed at early and late embryonic stages at various brainstem regions. This strategy contributes advanced techniques for targeting cells of interest in the embryonic hindbrain and for tracing circuit formation at multiple stages of development.

How neuronal networks are established in the embryonic brain is a fundamental question in developmental neurobiology. Here we combined an electroporation technique with novel genetic tools, such as Cre/Lox&#x2013;plasmids and PiggyBac-mediated DNA transposition system in the avian hindbrain to label dorsal interneurons and track their axonal projections and synaptic targets at various developmental stages.

Électroporation de la Rhombencéphale tracer des trajectoires axonales et cibles synaptiques dans l&#39;embryon de poulet

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In Vivo Imagerie biphotonique d&#39;expérience qui dépendent des changements moléculaires dans les neurones corticaux

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

A Method to Make a Craniotomy on the Ventral Skull of Neonate Rodents

The use of a craniotomy for in vivo experiments provides an opportunity to investigate the dynamics of diverse cellular processes in the mammalian brain in adulthood and during development. Although most in vivo approaches use a craniotomy to study brain regions located on the dorsal side, brainstem regions such as the pons, located on the ventral side remain relatively understudied. The main goal of this protocol is to facilitate access to ventral brainstem structures so that they can be studied in vivo using electrophysiological and imaging methods. This approach allows study of structural changes in long-range axons, patterns of electrical activity in single and ensembles of cells, and changes in blood brain barrier permeability in neonate animals. Although this protocol has been used mostly to study the auditory brainstem in neonate rats, it can easily be adapted for studies in other rodent species such as neonate mice, adult rodents and other brainstem regions.

A surgical method is described to expose the ventral skull in neonate rats. Using this approach it is possible to open a craniotomy to perform acute electrophysiology and two-photon microscopy experiments in the brainstem of anesthetized pups.

Une méthode pour faire un Craniotomie sur le crâne ventrale de nouveaux-nés Rongeurs

The use of a craniotomy for in vivo experiments provides an opportunity to investigate the dynamics of diverse cellular processes in the mammalian brain ...

An Inexpensive, Scalable Behavioral Assay for Measuring Ethanol Sedation Sensitivity and Rapid Tolerance in Drosophila

Alcohol use disorder (AUD) is a serious health challenge. Despite a large hereditary component to AUD, few genes have been unambiguously implicated in their etiology. The fruit fly, Drosophila melanogaster, is a powerful model for exploring molecular-genetic mechanisms underlying alcohol-related behaviors and therefore holds great promise for identifying and understanding the function of genes that influence AUD. The use of the Drosophila model for these types of studies depends on the availability of assays that reliably measure behavioral responses to ethanol. This report describes an assay suitable for assessing ethanol sensitivity and rapid tolerance in flies. Ethanol sensitivity measured in this assay is influenced by the volume and concentration of ethanol used, a variety of previously reported genetic manipulations, and also the length of time the flies are housed without food immediately prior to testing. In contrast, ethanol sensitivity measured in this assay is not affected by the vigor of fly handling, sex of the flies, and supplementation of growth medium with antibiotics or live yeast. Three different methods for quantitating ethanol sensitivity are described, all leading to essentially indistinguishable ethanol sensitivity results. The scalable nature of this assay, combined with its overall simplicity to set-up and relatively low expense, make it suitable for small and large scale genetic analysis of ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila.

An Inexpensive, Scalable Behavioral Assay for Measuring Ethanol Sedation Sensitivity and Rapid Tolerance in Drosophila

Straightforward assays for measuring ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila facilitate the use of this model organism for investigating these important ethanol-related behaviors. Here, a relatively simple, scalable assay for measuring ethanol sensitivity and rapid tolerance in flies is described.

Un, test de comportement évolutives et économiques pour mesurer l&#39;éthanol sédation sensibilité et la tolérance rapide dans<em&gt; Drosophila</em

Alcohol use disorder (AUD) is a serious health challenge. Despite a large hereditary component to AUD, few genes have been unambiguously implicated in ...

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the development of more effective treatments is the relative lack of understanding of the molecular underpinnings of the effects of ethanol on behavior. The nematode, Caenorhabditis elegans (C.&#160;elegans), provides a useful model in which to generate and test hypotheses about the molecular effects of ethanol. Here, we describe an assay that has been developed and used to examine the roles of particular genes and environmental factors in behavioral responses to ethanol, in which locomotion is the behavioral output. Ethanol dose-dependently causes an acute depression of crawling on an agar surface. The effects are dynamic; animals exposed to a high concentration demonstrate an initial strong depression of crawling, referred to here as initial sensitivity, and then partially recover locomotion speed despite the continued presence of the drug. This ethanol-induced behavioral plasticity is referred to here as the development of acute functional tolerance. This assay has been used to demonstrate that these two phenotypes are distinct and genetically separable. The straightforward locomotion assay described here is suitable for examining the effects of both genetic and environmental manipulations on these acute behavioral responses to ethanol in C.&#160;elegans.

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay.

Un test pour mesurer les effets de l&#39;éthanol sur la vitesse de Locomotion<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

Video Imaging and Spatiotemporal Maps to Analyze Gastrointestinal Motility in Mice

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central nervous system. Changes in ENS function are a major cause of GI symptoms and disease and may contribute to GI symptoms reported in neuropsychiatric disorders including autism. It is well established that isolated colon segments generate spontaneous, rhythmic contractions known as Colonic Migrating Motor Complexes (CMMCs). A procedure to analyze the enteric neural regulation of CMMCs in ex vivo preparations of mouse colon is described. The colon is dissected from the animal and flushed to remove fecal content prior to being cannulated in an organ bath. Data is acquired via a video camera positioned above the organ bath and converted to high-resolution spatiotemporal maps via an in-house software package. Using this technique, baseline contractile patterns and pharmacological effects on ENS function in colon segments can be compared over 3-4 hr. In addition, propagation length and speed of CMMCs can be recorded as well as changes in gut diameter and contraction frequency. This technique is useful for characterizing gastrointestinal motility patterns in transgenic mouse models (and in other species including rat and guinea pig). In this way, pharmacologically induced changes in CMMCs are recorded in wild type mice and in the Neuroligin-3R451C mouse model of autism. Furthermore, this technique can be applied to other regions of the GI tract including the duodenum, jejunum and ileum and at different developmental ages in mice.

This article describes a video imaging technique and high-resolution spatiotemporal mapping to identify changes in the neural regulation of colonic motility in adult mice. Subtle effects on gastrointestinal (GI) function can be detected using this approach in isolated tissue preparations to advance our understanding of GI disease.

Imagerie de la vidéo et cartes spatiotemporelles d&#39;analyser motilité gastro-intestinale chez la souris

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central ...