Finanziamento per questa ricerca è stato fornito da un programma in Neuroscienze Award dalla Florida State University College of Medicine e il sostegno del Dipartimento di Scienze Biologiche a FSU. Il finanziamento aggiuntivo è stato fornito da un Grant-in-Aid dal Fondo di Ricerca di alcol Beverage Produttore.

1. Assemblea della flybar Motivazione e Panoramica: Il sistema è progettato per amministrare percentuali controllate di vapore di alcol per le mosche. Nota: La figura 1 fornisce una panoramica schematica del flybar set-up come descritto di seguito in tre fasi (assemblaggio del flusso d&#39;aria, set-up della alcol e bottiglie d&#39;acqua, e l&#39;assemblaggio delle fiale di osservazione). In breve, un flusso d&#39;aria costante è diviso in due frazioni che vengono gorgogliare attraverso alcool e acqua, rispettivamente mescolati e somministrati a 4 flaconcini di osservazione. <ol><li> Assemblea della Airflow <ol><li> Collegare un breve pezzo di tubo flessibile in silicone a uno edificio aria o con un aeratore acquario di generare un flusso d&#39;aria costante e diviso utilizzando un connettore a Y. Collegare il primo ramo al regolatore di flusso d&#39;aria che controlla la quantità totale di aria attraverso il sistema (tipicamente 1.000 ml / min per 4 flaconcini di osservazione). </li><li> Inserire una rapida connettore nella seconda provettain modo che il flusso d&#39;aria può essere interrotta all&#39;inizio dell&#39;esperimento senza influenzare il flusso d&#39;aria calibrato. Aggiungere un connettore a Y e collegare ogni tubo ramificazione al regolatore flusso d&#39;aria. </li><li> Collegare il tubo ai regolatori di flusso d&#39;aria e quindi collegare due metri del flusso d&#39;aria. </li></ol></li><li> Set-up delle bottiglie di alcool e acqua <ol><li> Aggiungere tubo flessibile per l&#39;uscita dei misuratori del flusso d&#39;aria e inserire un tubo di vetro sottile (sezioni 1 pipette di vetro ml) con una curva a 90 ° in termine di ogni pezzo di tubo. Questo servirà come il flusso d&#39;aria in ingresso nelle bottiglie di acqua e alcool. </li><li> Mettere tappi di gomma con 2 fori attraverso di loro nelle bottiglie piene di alcool e acqua. Tenere entrambe le bottiglie ad una temperatura costante di 2 ° C superiore alla temperatura dell&#39;aria ambiente con un bagno di acqua. Nei nostri esperimenti, la camera ambientale è mantenuta a 25 ° C, mentre il bagno d&#39;acqua è a 27 ° C. </li><li> Inserire la pipetta di vetro dritto per la air ingresso attraverso il tappo di gomma e si estendono nel liquido fino a circa 1 cm dal fondo della bottiglia. </li><li> Inserire una sezione gomito di pipetta di vetro nel foro rimanente nel tappo di gomma fino alla fine del vetro è a filo con la parte inferiore del tappo all&#39;interno della bottiglia. Inserire questa uscita dell&#39;aria in un&#39;altra lunghezza del tubo. </li><li> Riunire i flussi d&#39;aria tramite un connettore a Y e utilizzare un altro tratto di tubo in silicone per dirigere il flusso d&#39;aria attraverso un matraccio di miscelazione vuoto o bottiglia con sezioni piegate pipetta di vetro inseriti attraverso un tappo di gomma a due forata. Utilizzare un altro pezzo di tubo in silicone per il flusso d&#39;aria mista di uscita. </li></ol></li><li> Assemblea della Vial osservazione <ol><li> Dividere il flusso d&#39;aria presa emergente dalla miscelazione pallone da 2-3x avere 4 o 8 flussi minori di aria in modo che più flaconi di osservazione possono essere usate in ogni esperimento. Collegare il tubo in silicone flessibile alle fiale di osservazione. </li><li> Impostare il observatifiale utilizzando flaconi vuoti sigillati con un tappo di gomma contenente due fori attraverso i quali tubi di vetro offrono un ingresso ed una uscita per il vapore di alcool. </li><li> Coprire l&#39;estremità del primo tubo di vetro con rete e mantenere la rete in posizione con un piccolo pezzo di tubo di plastica flessibile. Inserire questo tubo attraverso il primo foro finché non si protrae a circa metà della lunghezza del flacone. Se necessario, usare nastro Teflon per ottenere una perfetta aderenza. </li><li> Inserire il secondo tubo di vetro anche con l&#39;estremità coperta da rete a filo con il bordo interno del tappo di gomma. </li><li> Posizionare le fiale orizzontalmente su un pezzo di carta bianca per massimizzare il contrasto con le mosche in condizioni di luce rossa. </li><li> Mix appropriato frazioni della corrente d&#39;aria gorgogliati attraverso l&#39;alcol e il flusso d&#39;aria gorgogliare attraverso acqua. Monitorare la pressione d&#39;aria continuo e apportare le modifiche necessarie per mantenere la miscelazione desiderata dei flussi d&#39;aria. Nota: la corsa continuadi numerosi saggi Fly Bar in parallelo o anche un singolo test in una piccola stanza può portare ad un accumulo notevole di vapori di alcol. Per evitare il continuo rilascio di vapori di alcol che potenzialmente possono influenzare il ricercatore in una stanza chiusa, un adeguato sistema deve essere messo in atto che rimuove adeguatamente vapori di alcol generato durante l&#39;esperimento. Per rimuovere vapori dell&#39;alcool, collegare un pezzo 6-12 pollici di tubo sul secondo tubo di vetro che sporge da ogni flaconcino, unirli e diretto ad un sistema ad imbuto sotto vuoto. I ricercatori dovrebbero anche assicurare che la sala prove sperimentali sia adeguatamente ventilato. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione degli animali da esperimento Motivazione e panoramica: la cultura adeguata e alloggiamento delle mosche ridurre la variabilità nei dati. Questo risultato è ottenuto attraverso la standardizzazione e la minimizzazione dello stress vissuto dalle mosche. Per questo motivo, nessuna anestesia (CO 2 o alternative) è usato during qualsiasi delle seguenti fasi del protocollo. Inoltre, in linea dovrebbero essere pari età attraverso esperimenti e punti di tempo per ridurre al minimo la variabilità come standard per altre analisi comportamentali, tra cui apprendimento e memoria esperimenti 17. Luce diversa: condizioni scuri possono essere usati per sondare la funzione orologio circadiano nella risposta comportamentale di etanolo. Per determinare se esiste un ritmo diurno, esperimenti possono essere eseguiti in un ciclo LD definito per misurare le prestazioni a specifici Zeitgeber volte (ZT). ZT 0 rappresenta l&#39;alba ed è definito come il tempo di luci sotto cicli LD, mentre ZT 12 è le luci di tempo sono spente con un ciclo LD 00:12 h. In condizioni costanti, il tempo circadiano (CT) misura il tempo per l&#39;animale in assenza di segnali ambientali, ovvero tempo free-running, ed è legato al precedente ciclo LD trascinamento. In wild-type Drosophila, CT rispecchia la precedente ZT per il primo più giornis in condizioni costanti come il periodo circadiano free-running e ritmi sono ~ 24 ore. Per misurare la modulazione circadiano e di eliminare gli effetti di luce acuti sul comportamento, le mosche sono trascinati alla luce: i cicli di buio e poi trasferiti a costanti condizioni di buio (DD) prima di esperimenti. Circadiani esperimenti vengono eseguiti il ​​secondo giorno di DD per misurare le prestazioni a specifici circadiano volte (CT). In Drosophila, luce continua (LL) le condizioni provocano disfunzioni circadiano con oscillazioni molecolari inumidite o aboliti del nucleo geni circadiani e rottura dei ritmi circadiani comportamentali come dimostra l&#39;attività locomotoria aritmico 18-21 e la memoria aritmica a breve termine 17. Il protocollo è ottimizzato per studi circadiani e può essere semplificata per altri esperimenti. Tutti gli esperimenti circadiani sono condotti utilizzando la luce fioca rossa (sovraccarico ambientale luce rossa &lt;1 lux sulla panchina alto; piccole luci rosse usato a 12 centimetri da tubi~ 1 luce lux). <ol><li> Posteriore in linea a 25 ° C inferiore a 12:12 h luce: condizioni di trascinamento buio (LD). </li><li> Raccogliere le mosche appena eclosed al termine del periodo di luce diurna al giorno 1 e conservarli per 24 ore in condizioni di LD in possesso di flaconi contenenti una piccola quantità di cibo di alta concentrazione di agar per ridurre al minimo il cibo viscosità. Nota: Per assicurare sani, mosche normalmente sviluppate sono raccolti, utilizzare solo le mosche raccolti entro i primi giorni dopo eclosion inizia in una bottiglia cultura. </li><li> Raccogliere lotti di circa 30 (25-35) vola usando un aspiratore il giorno 2 verso la fine del periodo di luce, e il trasferimento di fiale di partecipazione freschi. </li><li> Utilizzare una fonte di luce forte per dirigere le mosche al fondo della fiala. All&#39;interno di questo campo, il numero esatto di linea in ciascun flacone non è critica come osservazioni comportamentali sono riportati in percentuali con numero totale di mosche contati alla fine di ogni esperimento. </li><li> Mantenere mosche in condizioni DD a 25 ° C for due giorni. </li><li> Il giorno dell&#39;esperimento, posizionare tutte le mosche alloggiati in condizioni o incubatori diversi dalla camera comportamento sperimentale nel ambiente per almeno 1 ora prima dell&#39;esperimento differenti. Acclimatazione riduce la variabilità dovuta alle variazioni di temperatura o umidità. </li><li> Fare osservazioni a sei punti temporali al giorno (CT 1, 5, 9, 13, 17 e 21) al fine di verificare la modulazione circadiano di comportamento. </li><li> Confrontare più punti di tempo all&#39;interno di una singola serie di esperimenti comportamentali per aumentare la robustezza del disegno sperimentale e minimizzare la variabilità specifica per un singolo esperimento. Ad esempio, le osservazioni di CT 1 e CT 13 possono essere ottenuti contemporaneamente se vengono utilizzati due incubatori con orari di luce-buio opposte per trascinamento. Nota: La procedura sopra descrive la preparazione di animali da laboratorio per le analisi eseguite in condizioni di buio costante circadiano. Luce diversa: condizioni scuri possono essere usati per sondare la funzione orologionelle risposte comportamentali all&#39;alcool. Per determinare se un ritmo diurno esiste gli esperimenti possono essere eseguiti in un ciclo di LD per misurare le prestazioni a specifici Zeitgeber volte (ZT). Inoltre, il protocollo può essere utilizzato con le mosche sollevate in condizioni di luce costanti per i test esperimenti disfunzioni circadiano. Per i protocolli alternativi che prova in linea alloggiati in condizioni di luce, test comportamentali devono ancora essere eseguite in condizioni di oscurità. Le mosche dovrebbero essere trasferiti nel buio per 1 ora prima dell&#39;esperimento per ridurre al minimo la variabilità del comportamento a causa degli effetti acuti della luce sul comportamento. </li></ol> 3. Osservazioni comportamentali Motivazione e panoramica: il seguente protocollo amministrazione alcol è ottimizzato per le osservazioni sotto fioca condizione di luce rossa. Le due misure comportamentali Lorr e sedazione rappresentano due punti distinti di mosca ebbrezza. Lorr rappresenta un punto ritardo di ebbrezza incorporare la perdita omotore fe controllo posturale, considerando che le misure di sedazione un punto finale molto tardi di intossicazione. Genotipo o modulazione circadiano possono influire queste due misure in modo diverso; quindi si può desiderare di esaminare sia. In breve, mosche vengono caricati nelle fiale, il numero di mosche visualizzazione Lorr o sedazione è ottenuto ogni 5 minuti durante l&#39;esposizione al vapore di alcool, e il numero totale di mosche contati alla fine dell&#39;esperimento. <ol><li> Prima di iniziare l&#39;esperimento, eseguire l&#39;aria attraverso il sistema (aria gorgogliare attraverso le bottiglie di acqua e alcool) per almeno 10 minuti e usare questo tempo per calibrare i flussi d&#39;aria. </li><li> Scollegare il rilascio rapido per fermare il flusso d&#39;aria. Caricare le mosche in fiale, e ricollegare il flusso d&#39;aria e avviare il timer. Nota: se le mosche che non rispondono o mosche morte vengono lasciati in fiale di partecipazione, questo potrebbe essere indicativo di condizioni di stress. In generale, queste condizioni possono essere mitigati ospitando un numero inferiore di mosche in fiale che tengono o diminuendo il cibo vischiosità con un leggeroconcentrazione di agar ly più alto durante la preparazione dei cibi. Per le analisi comportamentali ottimali e minima variabilità tra esperimenti, in linea dovrebbero essere sani prima di esperimenti. </li><li> Per il tempo esatto che mantiene, utilizzare uno timer per tenere traccia del tempo totale di esposizione alcol e utilizzare un secondo timer count-back per contrassegnare gli intervalli di 5 min. </li><li> Posizionare un pezzo di carta bianca sotto le fiale per aumentare il contrasto e volare visibilità, soprattutto in condizioni di luce rossa fioca. </li><li> Controllare il flusso d&#39;aria regolarmente durante un esperimento di mantenere livelli costanti. Generalmente, una volta flussi d&#39;aria sono stabilizzati, essi rimangono stabili per tutta la durata dell&#39;esperimento. </li><li> Contare il numero di mosche che hanno perso il loro riflesso di raddrizzamento volta ogni 5 minuti per un periodo di 1 ora. Poiché la sensibilità alcool varia tra genotipi e background genetico, può essere desiderabile eseguire valutazioni più frequenti o condurre l&#39;esperimento per un periodo di tempo più lungo. </li><li> Sollevare il slightl flaconcinoy dalla superficie, e dirigere la luce di una torcia a luci rosse verso la carta dietro il flaconcino. Tenere le torce rosse a mano ad una distanza di almeno 12 centimetri al flaconcino sperimentale per mantenere i livelli di luce non superiori a 1 lux per tutti gli esperimenti in condizioni di luce rossa. </li><li> Misurare i livelli di luce con un esposimetro a stabilire norme per tutti gli esperimenti. </li><li> Determinare il numero di mosche che hanno perso il loro riflesso di raddrizzamento mediante l&#39;applicazione di un rubinetto ditta per la fiala e contare quante mosche non riescono a raddrizzare se stessi all&#39;interno di circa 4 sec. Mosche che visualizzano Lorr può ancora muovere le gambe e le ali, ma non può trasformarsi in posizione verticale. </li><li> Alla fine della sessione, contare il numero totale di linea in ciascun flacone. Nota: Di tanto in tanto, una mosca può essere preso tra il tappo e il lato durante il caricamento vola in fiale sperimentali. Poiché questo è fatto al buio, potrebbe non essere prontamente notato quindi è necessario contare insensibile totaleer di mosche alla fine dell&#39;esperimento per calcolare correttamente percentuali. </li></ol> Inoltre, questa procedura può anche essere usato per misurare la sedazione di mosche, che rappresenta un endpoint comportamentale differente. Mentre le mosche sedati hanno perso il loro riflesso giusto, sedazione richiede una maggiore esposizione all&#39;alcol. Comportamentale, sedazione può essere caratterizzata dalla totale mancanza di attività apparente motore con mosche rimanendo immobili nel flaconcino seguente ditta aa toccare al flaconcino. Per la sedazione, contare il numero di mosche che restano immobili senza gamba agitando dopo la consegna di un rubinetto azienda del flacone. Inoltre, il flaconcino può essere arrotolato un lato all&#39;altro per determinare se i singoli linea conservano ancora il loro riflesso grabbing. 4. Analisi dei dati <ol><li> Determinare la percentuale Lorr a ogni volta valutata in base al numero totale di linea in ciascun flacone. </li><li> Differenze di stima compresa tra i punti temporali circadiani o ceppi di calculating il Lorr 50% per ciascun campione, che rientra nella porzione lineare della curva sigma (Vedi figura 2). </li><li> Statistiche alternativi: <ol><li> Se si prevedono confronti tra genotipi, è opportuno analizzare l&#39;intero corso di tempo con misure ripetute ANOVAand per determinare l&#39;intervallo di punti temporali che le differenze siano significative test post-hoc (Figura 3). Per questi test, si preferisce utilizzare un valore di 0,001. Questo permette differenze a tempi di esposizione individuali da valutare, così come le differenze tra genotipi nella pendenza della curva. </li><li> Differenze di sensibilità per possono essere determinati momenti specifici di esposizione dell&#39;alcool una risposta particolare come sedazione dalla porzione lineare del grafico (Figura 4). </li><li> Le differenze tra ceppi o punti di tempo circadiano possono essere stimati con F-statistiche standard e test post-hoc. </li></ol></li></ol>

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L., Tejada-Vera, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Deaths: Final data for 2007. , (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+National+Center+on+Addiction+and+Substance+Abuse.">The National Center on Addiction and Substance Abuse.</a> Shoveling up II: The impact of substance abuse on federal, state and local budgets. , (2009).</li><li>NIAAA, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimated+economic+costs+of+alcohol+abuse+in+the+United+States.">Estimated economic costs of alcohol abuse in the United States.</a> , (1992).</li><li>Devineni, A. V., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+ethanol+consumption+in+Drosophila+models+features+of+addiction.">Preferential ethanol consumption in Drosophila models features of addiction.</a> Current Biology. 19, 2126-2132 (2009).</li><li>Devineni, A. V., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addiction-like+behavior+in+Drosophila.">Addiction-like behavior in Drosophila.</a> Communicative &amp; Integrative Biology. 3, 357-359 (2010).</li><li>Rodan, A. R., Rothenfluh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+behavioral+alcohol+responses+in+Drosophila.">The genetics of behavioral alcohol responses in Drosophila.</a> International Review of Neurobiology. 91, 25-51 (2010).</li><li>Boothroyd, C. E., Young, M. W., Pfaff, D. W., Kieffer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+Biophysical+Mechanisms+of+Arousal,+Alertness,+and+Attention.">Molecular and Biophysical Mechanisms of Arousal, Alertness, and Attention.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1129, 350-357 (2008).</li><li>Nitabach, M. N., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+Drosophila+circadian+control+circuit.">Organization of the Drosophila circadian control circuit.</a> Current Biology. 18, 84-93 (2008).</li><li>Sheeba, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+melanogaster+circadian+pacemaker+circuit.">The Drosophila melanogaster circadian pacemaker circuit.</a> J. Genet. 87, 485-493 (2008).</li><li>Cohan, F. M., Graf, J. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latitudinal+cline+in+Drosophila+melanogaster+for+knockdown+resistance+to+ethanol+fumes+and+for+rates+of+response+to+selection+for+further+resistance.">Latitudinal cline in Drosophila melanogaster for knockdown resistance to ethanol fumes and for rates of response to selection for further resistance.</a> Evolution. , 278-293 (1985).</li><li>Moore, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+intoxication+in+Drosophila:+Genetic+and+pharmacological+evidence+for+regulation+by+the+cAMP+signaling+pathway.">Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway.</a> Cell. 93, 997-1007 (1998).</li><li>Berger, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+sensitivity+and+tolerance+in+long-term+memory+mutants+of+Drosophila+melanogaster.">Ethanol sensitivity and tolerance in long-term memory mutants of Drosophila melanogaster.</a> Alcohol Clin Exp Res. 32, 895-908 (2008).</li><li>Pohl, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+Genes+Differentially+Affect+Tolerance+to+Ethanol.">Circadian Genes Differentially Affect Tolerance to Ethanol.</a> in Drosophila. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. , (2013).</li><li>Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assay+for+evoked+locomotor+behavior+in+Drosophila+reveals+a+role+for+integrins+in+ethanol+sensitivity+and+rapid+ethanol+tolerance.">An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 33, 1794-1805 (2009).</li><li>Rothenfluh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+behavioral+responses+to+ethanol+are+regulated+by+alternate+RhoGAP18B+isoforms.">Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms.</a> Cell. 127, (1016).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

I costi di abuso di alcol e l&#39;alcolismo per la società è enorme, sia in termini di costi umani ed economici 29 30,31. Drosophila come modello offre un sistema veloce e versatile per esaminare rapidamente le risposte comportamentali di un gran numero di individui e come tale è stato ampiamente utilizzato sia per l&#39;alcol 5,7,32-34 e ricerca circadiano 35-37. Qui, abbiamo descritto un protocollo semplice per la somministrazione controllata di...

Drosophila melanogaster dimostrare risposte comportamentali bifasico all&#39;alcool 1 che sono analoghi a risposte umane a questo farmaco 2,3. Dopo l&#39;esposizione iniziale a basse concentrazioni di alcol, mosche mostra un aumento dell&#39;attività locomotoria, sostituito da una mancanza di coordinazione motoria, la perdita del controllo posturale e raddrizzamento riflessi (perdita del riflesso di raddrizzamento: Lorr), e la sedazione (completa mancanza di attività motoria in risposta alla stimolazione meccanica) come l&#39;esposizione all&#39;alcol progredisce 4-9. L&#39;orologio circadiano endogeno è un modulatore di forte sensibilità alcol e tossicità osservata in topi, ratti 10,11 12, 13 e nell&#39;uomo. I recenti progressi nella ricerca Drosophila hanno mostrato l&#39;orologio circadiano modula la sensibilità acuta da alcol, ma non l&#39;alcol tolleranza 1. I potenti approcci genetici disponibili a Drosophila attraverso studi mutanti e manipolazioni transgeniche di spazialee l&#39;espressione genica temporale fornire un sistema che consente rapidi progressi nell&#39;identificare i meccanismi cellulari e molecolari alla base di comportamenti complessi. L&#39;uso di Drosophila come strumento di indagine ha consentito progressi sostanziali nella comprensione di alcol neurobiologia che possono essere rapidamente tradotti ai mammiferi 14-16. Al fine di facilitare la comprensione dei meccanismi molecolari attraverso i quali l&#39;orologio circadiano modula la sensibilità di alcol e di misurare uniformemente risposte comportamentali attraverso punti di tempo circadiani, un protocollo di somministrazione di alcol adatto per l&#39;uso in condizioni di luce rossa fioca è richiesto. Per Drosophila, l&#39;alcool può essere somministrato attraverso integrazione alimentare per esposizione cronica o affidabile attraverso amministrare alcol in forma di vapore per esposizioni acute. Qui, descriviamo un protocollo di somministrazione alcool adatto per la valutazione della modulazione circadiano di perdita-di-riflesso di raddrizzamento (Lorr) 1 nonchésedazione. Le mosche sono trascinate con 12 ore: 12 cicli hr LD a temperatura costante e poi trasferiti in un regime di luce controllata per 2-5 giorni a seconda della questione sperimentale. Mosche sono esposti al vapore di etanolo in un dispositivo noto come flybar. In questo dispositivo, quantità controllate di aria vengono gorgogliare attraverso acqua e alcool; i vapori vengono poi mescolati e diretti in un alloggiamento flaconcino in linea. Ogni 5 min in linea sono segnati per il numero che non riesce a visualizzare raddrizzamento riflessi o sono diventati sedato. Percentuali Lorr per ogni punto di tempo vengono calcolati e confrontati tra i punti temporali circadiani o tra ceppi di mosche. La semplicità e l&#39;affidabilità di consegna alcol con la consegna di alcol flybar combinato con le opzioni di analisi comportamentale offre un vantaggio significativo per gli esperimenti circadiani condotti in condizioni di oscurità.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="815">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Alcohol 190 proof</td>
			<td style="width:115px;">Various</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Name of Material</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:296px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Aerator</td>
			<td style="width:115px;">Local pet store</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:296px;">We use Whisper 60</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Silicone tubing 1/8&#8221;</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">408060-0030</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">120&#176; Y Connector</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82017-256</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Quick disconnects</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">46600-048</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Plastic tube clamps</td>
			<td style="width:115px;">Bell-art products</td>
			<td style="width:119px;">132250000</td>
			<td style="width:296px;">Either this or next</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Miniature Air Regulator</td>
			<td style="width:115px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">8727K11</td>
			<td style="width:296px;">Either this or previous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Miniature Air Regulator Mounting Bracket</td>
			<td style="width:115px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">9891K66</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Gilmont size 12 flow meter</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">29895-242</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Tool clips</td>
			<td style="width:115px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">1722A43</td>
			<td style="width:296px;">To hold flow meters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Vial</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89092-722</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Rubber stopper with two holes</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">59585-186</td>
			<td style="width:296px;">Fits in vials</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">5 mm Pyrex Glass tubes</td>
			<td style="width:115px;">Trikinetics</td>
			<td style="width:119px;">PGT5x65</td>
			<td style="width:296px;">Fits best in previous stopper.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Teflon tape</td>
			<td style="width:115px;">Hardware store</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:296px;">To achieve snug fit in stoppers if necessary</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Rubber stopper with two holes</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">59582-122</td>
			<td style="width:296px;">Fits our bottles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Disposable glass pipets</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">53283-768</td>
			<td style="width:296px;">Cut to length and bend by heating</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Very fine nylon netting</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">Various</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">15 watt bulbs</td>
			<td style="width:115px;">Hardware store</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:296px;">Overhead red light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Photographic red safe light filters</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:296px;">Overhead red light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Mini Flashlights with red filters</td>
			<td style="width:115px;">Mag-light</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the flybar: administering alcohol to flies

Moscerini della frutta (Drosophila melanogaster) sono un modello stabilito sia per la ricerca di alcol e di biologia circadiana. Recentemente, abbiamo dimostrato che l&#39;orologio circadiano modula alcool sensibilità, ma non la formazione di tolleranza. Qui, descriviamo il nostro protocollo in dettaglio. L&#39;alcol viene somministrato alle mosche con flybar. In questa configurazione, vapori di alcol saturo viene miscelato con aria umidificata in set proporzioni, e somministrato alle mosche in quattro tubi contemporaneamente. Le mosche sono allevati in condizioni standardizzate al fine di minimizzare la variazione tra le repliche. Tre giorni di età in linea di differenti genotipi o trattamenti vengono utilizzati per gli esperimenti, preferibilmente abbinando mosche di due diversi punti di tempo (ad esempio, CT 5 e CT 17) rendendo possibili confronti diretti. Durante l&#39;esperimento, mosche sono esposti per 1 ora alla percentuale prestabilita del vapore di alcool e il numero di mosche che esporre la perdita del riflesso di raddrizzamento (Lorr) o sedzione sono conteggiati ogni 5 min. I dati possono essere analizzati utilizzando tre differenti approcci statistici. Il primo è quello di determinare il momento in cui il 50% delle mosche hanno perso il loro riflesso di raddrizzamento e utilizzare un analisi della varianza (ANOVA) per determinare se esistono differenze significative tra i punti temporali. Il secondo è quello di determinare le mosche percentuali che mostrano Lorr dopo un determinato numero di minuti, seguita da un&#39;analisi ANOVA. L&#39;ultimo metodo è quello di analizzare l&#39;intera serie di volte con statistica multivariata. Il protocollo può essere utilizzato anche per esperimenti non circadiani o confronti tra i genotipi.

Modulazione circadiano di alcol sensibilità con la Lorr 50% come marcatore. Un esempio rappresentativo che mostra modulazione circadiano in alcool sensibilità durante il giorno è presentato in Figura 2. Lorr stata misurata a sei punti di tempo durante il 2 ° giorno di DD in Canton-S e il 50% Lorr stato determinato per ciascun punto di tempo. L&#39;analisi ha dimostrato un effetto significativo del momento della giornata (ANOVA: F 5,45 = 7.39, p<...

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The FlyBar: Administering Alcohol to Flies

Drosophila è emersa come sistema modello significativo per la dissezione delle basi cellulari e molecolari delle risposte comportamentali all&#39;alcool. Qui vi presentiamo un protocollo per la raccolta di dati di sensibilità alcol in un contesto circadiano che può essere facilmente applicato ad altri esperimenti ed è particolarmente adatto per la ricerca di laurea.

Flybar: Amministrazione alcol a Flies

Fruit flies (Drosophila melanogaster) are an established model for both alcohol research and circadian biology. Recently, we showed that the circadian ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.6K Views.  Florida State University.  Drosophila è emersa come sistema modello significativo per la dissezione delle basi cellulari e molecolari delle risposte comportamentali all'alcool. Qui vi presentiamo un protocollo per la raccolta di dati di sensibilità alcol in un contesto circadiano che può essere facilmente applicato ad altri esperimenti ed è particolarmente adatto per la ricerca di laurea. 

Video: The FlyBar: Administering Alcohol to Flies

Assessment of Ultrasonic Vocalizations During Drug Self-administration in Rats

Drug self-administration procedures are commonly used to study behavioral and neurochemical changes associated with human drug abuse, addiction and relapse. Various types of behavioral activity are commonly utilized as measures of drug motivation in animals. However, a crucial component of drug abuse relapse in abstinent cocaine users is "drug craving", which is difficult to model in animals, as it often occurs in the absence of overt behaviors. Yet, it is possible that a class of ultrasonic vocalizations (USVs) in rats may be a useful marker for affective responses to drug administration, drug anticipation and even drug craving. Rats vocalize in ultrasonic frequencies that serve as a communicatory function and express subjective emotional states. Several studies have shown that different call frequency ranges are associated with negative and positive emotional states. For instance, high frequency calls ("50-kHz") are associated with positive affect, whereas low frequency calls ("22-kHz") represent a negative emotional state. This article describes a procedure to assess rat USVs associated with daily cocaine self-administration. For this procedure, we utilized standard single-lever operant chambers housed within sound-attenuating boxes for cocaine self-administration sessions and utilized ultrasonic microphones, multi-channel recording hardware and specialized software programs to detect and analyze USVs. USVs measurements reflect emotionality of rats before, during and after drug availability and can be correlated with commonly assessed drug self-administration behavioral data such lever responses, inter-response intervals and locomotor activity. Since USVs can be assessed during intervals prior to drug availability (e.g., anticipatory USVs) and during drug extinction trials, changes in affect associated with drug anticipation and drug abstinence can also be determined. In addition, determining USV changes over the course of short- and long-term drug exposure can provide a more detailed interpretation of drug exposure effects on affective functioning.

Drug self-administration and ultrasonic vocalizations (USV) are used as behavioral assessments in animal research, but rarely in combination. The purpose of this article is to describe the advantages of recording USVs during drug self-administration procedures to assess affective responses to drug experience.

Valutazione di vocalizzazioni ultrasoniche Durante Drug autosomministrazione in topi

Drug self-administration procedures are commonly used to study behavioral and neurochemical changes associated with human drug abuse, addiction and ...

Ricerca

Neuroscienze

A Simple Way to Measure Ethanol Sensitivity in Flies

Low doses of ethanol cause flies to become hyperactive, while high doses are sedating. The sensitivity to ethanol-induced sedation of a given fly strain is correlated with that strain s ethanol preference, and therefore sedation is a highly relevant measure to study the genetics of alcohol responses and drinking. We demonstrate a simple way to expose flies to ethanol and measure its intoxicating effects. The assay we describe can determine acute sensitivity, as well as ethanol tolerance induced by repeat exposure. It does not require a technically involved setup, and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A simple assay to measure the sedating effects of ethanol on Drosophila flies, based on the loss of righting reflex, is described.

Un modo semplice per misurare sensibilità etanolo in Flies

Low doses of ethanol cause flies to become hyperactive, while high doses are sedating. The sensitivity to ethanol-induced sedation of a given fly strain ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation di neuroni da fettine di cervello di roditore studio di trasmissione sinaptica e Immagine terminali presinaptici

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Experimental Methods for Testing the Effects of Neurotrophic Peptide, ADNF-9, Against Alcohol-induced Apoptosis during Pregnancy in C57BL/6 Mice

Experimental designs for investigating the effects of prenatal alcohol exposure during early embryonic stages in fetal brain growth are challenging. This is mostly due to the difficulty of microdissection of fetal brains and their sectioning for determination of apoptotic cells caused by prenatal exposure to alcohol. The experiments described here provide visualized techniques from mice breeding to the identification of cell death in fetal brain tissue. This study used C57BL/6 mice as the animal model for studying fetal alcohol exposure and the role of trophic peptide against alcohol-induced apoptosis. The breeding consists of a 2-hr matting window to determine the exact stage of embryonic age. An established fetal alcohol exposure model has been used in this study to determine the effects of prenatal alcohol exposure in fetal brains. This involves free access to alcohol or pair-fed liquid diets as the sole source of nutrients for the pregnant mice.
The techniques involving dissection of fetuses and microdissection of fetal brains are described carefully, since the latter can be challenging. Microdissection requires a stereomicroscope and ultra-fine forceps. Step-by-step procedures for dissecting the fetal brains are provided visually. The fetal brains are dissected from the base of the primordium olfactory bulb to the base of the metencephalon.
For investigating apoptosis, fetal brains are first embedded in gelatin using a peel-away mold to facilitate their sectioning with a vibratome apparatus. Fetal brains embedded and fixed in paraformaldehyde are easily sectioned, and the free floating sections can be mounted in superfrost plus slides for determination of apoptosis or cell death.
TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick End Labeling; TdT: terminal deoxynucleotidyl transferase) assay has been used to identify cell death or apoptotic cells. It is noteworthy that apoptosis and cell-mediated cytotoxicity are characterized by DNA fragmentation. Thus, the visualized TUNEL-positive cells are indicative of cell death or apoptotic cells.
The experimental designs here provide information about the use of an established liquid diet for studying the effects of alcohol and the role of neurotrophic peptides during pregnancy in fetal brains. This involves breeding and feeding pregnant mice, microdissecting fetal brains, and determining apoptosis. Together, these visual and textual techniques might be a source for investigating prenatal exposure of harmful agents in fetal brains.

The experimental designs proposed here focus on studying the effects of alcohol exposure in apoptosis and the application of neurotrophic peptide during pregnancy in fetal brain. A detailed description from the breeding to the collection of fetal brains is described. Techniques for determination of apoptosis are also described in detail.

Metodi sperimentali per testare gli effetti del peptide neurotrofico, ADNF-9, Contro L&#39;apoptosi indotta da alcol durante la gravidanza in topi C57BL / 6

Experimental designs for investigating the effects of prenatal alcohol exposure during early embryonic stages in fetal brain growth are challenging. This ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation of the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient for the expression of foreign genes into neuronal cells. In this manuscript we provide a method that demonstrates uniquely how to electroporate DNA into the avian hindbrain at E2.75 in order to specifically label a subset of neuronal progenitors, and how to follow their axonal projections and synaptic targets at much advanced stages of development, up to E14.5. We have utilized novel genetic tools including specific enhancer elements, Cre/Lox - based plasmids and the PiggyBac-mediated DNA transposition system to drive GFP expression in a subtype of hindbrain cells (the dorsal most subgroup of interneurons, dA1). Axonal trajectories and targets of dA1 axons are followed at early and late embryonic stages at various brainstem regions. This strategy contributes advanced techniques for targeting cells of interest in the embryonic hindbrain and for tracing circuit formation at multiple stages of development.

How neuronal networks are established in the embryonic brain is a fundamental question in developmental neurobiology. Here we combined an electroporation technique with novel genetic tools, such as Cre/Lox&#x2013;plasmids and PiggyBac-mediated DNA transposition system in the avian hindbrain to label dorsal interneurons and track their axonal projections and synaptic targets at various developmental stages.

Elettroporazione del romboencefalo tracciare traiettorie assonale e Obiettivi Synaptic in embrione di pollo

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In Vivo a due fotoni di imaging dei cambi molecolari esperienza-dipendenti nei neuroni corticali

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

A Method to Make a Craniotomy on the Ventral Skull of Neonate Rodents

The use of a craniotomy for in vivo experiments provides an opportunity to investigate the dynamics of diverse cellular processes in the mammalian brain in adulthood and during development. Although most in vivo approaches use a craniotomy to study brain regions located on the dorsal side, brainstem regions such as the pons, located on the ventral side remain relatively understudied. The main goal of this protocol is to facilitate access to ventral brainstem structures so that they can be studied in vivo using electrophysiological and imaging methods. This approach allows study of structural changes in long-range axons, patterns of electrical activity in single and ensembles of cells, and changes in blood brain barrier permeability in neonate animals. Although this protocol has been used mostly to study the auditory brainstem in neonate rats, it can easily be adapted for studies in other rodent species such as neonate mice, adult rodents and other brainstem regions.

A surgical method is described to expose the ventral skull in neonate rats. Using this approach it is possible to open a craniotomy to perform acute electrophysiology and two-photon microscopy experiments in the brainstem of anesthetized pups.

Un metodo per fare una craniotomia sul ventrale Cranio di neonato Roditori

The use of a craniotomy for in vivo experiments provides an opportunity to investigate the dynamics of diverse cellular processes in the mammalian brain ...

An Inexpensive, Scalable Behavioral Assay for Measuring Ethanol Sedation Sensitivity and Rapid Tolerance in Drosophila

Alcohol use disorder (AUD) is a serious health challenge. Despite a large hereditary component to AUD, few genes have been unambiguously implicated in their etiology. The fruit fly, Drosophila melanogaster, is a powerful model for exploring molecular-genetic mechanisms underlying alcohol-related behaviors and therefore holds great promise for identifying and understanding the function of genes that influence AUD. The use of the Drosophila model for these types of studies depends on the availability of assays that reliably measure behavioral responses to ethanol. This report describes an assay suitable for assessing ethanol sensitivity and rapid tolerance in flies. Ethanol sensitivity measured in this assay is influenced by the volume and concentration of ethanol used, a variety of previously reported genetic manipulations, and also the length of time the flies are housed without food immediately prior to testing. In contrast, ethanol sensitivity measured in this assay is not affected by the vigor of fly handling, sex of the flies, and supplementation of growth medium with antibiotics or live yeast. Three different methods for quantitating ethanol sensitivity are described, all leading to essentially indistinguishable ethanol sensitivity results. The scalable nature of this assay, combined with its overall simplicity to set-up and relatively low expense, make it suitable for small and large scale genetic analysis of ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila.

An Inexpensive, Scalable Behavioral Assay for Measuring Ethanol Sedation Sensitivity and Rapid Tolerance in Drosophila

Straightforward assays for measuring ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila facilitate the use of this model organism for investigating these important ethanol-related behaviors. Here, a relatively simple, scalable assay for measuring ethanol sensitivity and rapid tolerance in flies is described.

Un poco costoso, test comportamentale scalabile per la misurazione etanolo sedazione sensibilità e tolleranza Rapid in<em&gt; Drosophila</em

Alcohol use disorder (AUD) is a serious health challenge. Despite a large hereditary component to AUD, few genes have been unambiguously implicated in ...

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the development of more effective treatments is the relative lack of understanding of the molecular underpinnings of the effects of ethanol on behavior. The nematode, Caenorhabditis elegans (C.&#160;elegans), provides a useful model in which to generate and test hypotheses about the molecular effects of ethanol. Here, we describe an assay that has been developed and used to examine the roles of particular genes and environmental factors in behavioral responses to ethanol, in which locomotion is the behavioral output. Ethanol dose-dependently causes an acute depression of crawling on an agar surface. The effects are dynamic; animals exposed to a high concentration demonstrate an initial strong depression of crawling, referred to here as initial sensitivity, and then partially recover locomotion speed despite the continued presence of the drug. This ethanol-induced behavioral plasticity is referred to here as the development of acute functional tolerance. This assay has been used to demonstrate that these two phenotypes are distinct and genetically separable. The straightforward locomotion assay described here is suitable for examining the effects of both genetic and environmental manipulations on these acute behavioral responses to ethanol in C.&#160;elegans.

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay.

Un test per misurare gli effetti di etanolo sulla velocità di Locomotion<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

Video Imaging and Spatiotemporal Maps to Analyze Gastrointestinal Motility in Mice

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central nervous system. Changes in ENS function are a major cause of GI symptoms and disease and may contribute to GI symptoms reported in neuropsychiatric disorders including autism. It is well established that isolated colon segments generate spontaneous, rhythmic contractions known as Colonic Migrating Motor Complexes (CMMCs). A procedure to analyze the enteric neural regulation of CMMCs in ex vivo preparations of mouse colon is described. The colon is dissected from the animal and flushed to remove fecal content prior to being cannulated in an organ bath. Data is acquired via a video camera positioned above the organ bath and converted to high-resolution spatiotemporal maps via an in-house software package. Using this technique, baseline contractile patterns and pharmacological effects on ENS function in colon segments can be compared over 3-4 hr. In addition, propagation length and speed of CMMCs can be recorded as well as changes in gut diameter and contraction frequency. This technique is useful for characterizing gastrointestinal motility patterns in transgenic mouse models (and in other species including rat and guinea pig). In this way, pharmacologically induced changes in CMMCs are recorded in wild type mice and in the Neuroligin-3R451C mouse model of autism. Furthermore, this technique can be applied to other regions of the GI tract including the duodenum, jejunum and ileum and at different developmental ages in mice.

This article describes a video imaging technique and high-resolution spatiotemporal mapping to identify changes in the neural regulation of colonic motility in adult mice. Subtle effects on gastrointestinal (GI) function can be detected using this approach in isolated tissue preparations to advance our understanding of GI disease.

Video Imaging e mappe spazio-temporale per analizzare la motilità gastrointestinale nei topi

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central ...

Methods Article

Flybar: Amministrazione alcol a Flies