Die Finanzierung dieser Forschung wurde von einem Programm in Neuroscience Award von der Florida State University College of Medicine und die Unterstützung von der Abteilung für Biowissenschaften an der FSU zur Verfügung gestellt. Zusätzliche Finanzierung wurde durch einen Grant-in-Aid aus der Spirituosenherstellerforschungsfonds zur Verfügung gestellt.

1. Versammlung der Paddelstange Begründung und Übersicht: Das System ist so konzipiert, gesteuert Prozentsätze der Alkoholdampf, um Fliegen zu verwalten. Hinweis: Abbildung 1 zeigt eine schematische Übersicht über die Paddelstange Set-up, wie unten in drei Stufen (Montage des Luftstroms, Set-up des Alkohol-und Wasserflaschen, und die Montage der Beobachtung Fläschchen) beschrieben. Kurz gesagt, ist ein stetiger Luftstrom in zwei Fraktionen, die durch Alkohol und Wasser sprudelte werden jeweils gemischt und auf 4 Beobachtungs Fläschchen verabreicht aufgeteilt. <ol><li> Versammlung der Airflow <ol><li> Schließen Sie ein kurzes Stück von flexiblen Silikonschlauch, entweder Gebäude Luft oder ein Aquarium Belüfter, um eine konsistente Luftstrom und Split mit einem y-Stecker zu erzeugen. Verbinden den ersten Zweig mit dem Luftstromregler, der die Gesamtmenge der Luft durch das System (typischerweise 1.000 ml / min für 4 Beobachtungs Vials) steuert. </li><li> Legen Sie eine Schnellkupplung in der zweiten Röhreso dass der Luftstrom am Anfang des Versuchs, ohne die Luftströmung kalibriert unterbrochen werden. Fügen Sie einen Y-Stecker und verbinden jeden Verzweigungsrohr mit dem Volumenstromregler. </li><li> Schließen Sie den Schlauch an Volumenstromregler und verbinden zwei Meter Luftstrom. </li></ol></li><li> Set-up der Alkohol-und Wasserflaschen <ol><li> In flexiblen Schlauch an den Ausgang der Luftmengenmesser und führen Sie einen dünnen Glasrohr (Abschnitte von 1 ml Glaspipetten) mit einer 90 °-Bogen in das Ende eines jeden Rohrlänge. Dies wird als der Einlassluftstrom in den Wasser-und Alkohol-Flaschen dienen. </li><li> Platzieren Gummistopfen mit 2 Löchern durch sie in die Flaschen mit Alkohol und Wasser. Halten beider Flaschen bei einer konstanten Temperatur 2 ° C höher als die Umgebungslufttemperatur unter Verwendung eines Wasserbades. In unseren Experimenten wird die Umgebungsraum bei 25 ° C gehalten wird, während das Wasserbad auf 27 ° C. </li><li> Stecken Sie das gerade Glaspipette für die einir durch den Gummistopfen Einlass und erstrecken sich in die Flüssigkeit bis ungefähr 1 cm von der Unterseite der Flasche. </li><li> Legen Sie eine Kniestückabschnitt Glaspipette in die verbleibende Öffnung in dem Gummi-Stopper, bis das Ende des Glas bündig mit der Unterseite des Stopfens in der Flasche. Fügen Sie diesen Luftaustritt in einem anderen Rohrlänge. </li><li> Vereinige die Luftströme mit einem y-Stecker und eine andere Länge der Silikonschlauch um den Luftstrom durch eine leere Mischflasche oder Flasche mit gebogenen Glaspipette Schnitte durch eine zwei-Loch Gummistopfen eingesetzt lenken. Verwenden Sie eine andere Länge der Silikonschlauch für den Austritt Mischluftstrom. </li></ol></li><li> Versammlung der Beobachtung Vial <ol><li> Teilen die Austrittsluftstrom, der aus dem Mischkolben 2-3x bis 4 oder 8 kleinere Luftströme zu erhalten, so dass mehrere Beobachtungs Fläschchen können in jedem Experiment verwendet werden. Schließen Sie den flexiblen Silikonschlauch auf die Beobachtung Fläschchen. </li><li> Richten Sie die Beobauf Phiolen mit leeren Flaschen mit einem Gummistopfen mit zwei Löchern, durch die Glasrohre liefern einen Einlass und einen Auslass für den Alkoholdampf abgedichtet. </li><li> Decken Sie die Ende des ersten Glasrohr mit Netz und halten das Netz an Ort und Stelle mit einem kleinen Stück aus flexiblem Kunststoffrohr. Legen diese Röhre durch das erste Loch erstreckt, bis sie ungefähr die Hälfte der Länge des Röhrchens. Falls erforderlich, verwenden Sie Teflonband um eine bequeme Passform zu erhalten. </li><li> Legen Sie die zweite Glasröhre auch mit dem Ende durch Verrechnung abgedeckt, bis sie bündig mit der Innenkante des Gummistopfens ist. </li><li> Die Durchstechflaschen horizontal auf einem weißen Stück Papier, um den Kontrast mit den Fliegen unter schlechten Lichtverhältnissen rot maximieren. </li><li> Mix entsprechenden Fraktionen des Luftstroms durch sprudelte Alkohol und der Luftstrom durch das Wasser geleitet. Überwachung der Luftdruck kontinuierlich und Anpassungen vornehmen, wie notwendig, um die gewünschte Durchmischung der Luftströme zu erhalten. Hinweis: Die Dauerlaufvon mehreren Fly Bar-Tests parallel oder auch nur einen einzigen Test in einem kleinen Raum kann zu einer deutlichen Anhäufung von Alkoholdampf führen. Um kontinuierliche Freisetzung von Alkoholdampf, die möglicherweise die Forscher in einem geschlossenen Raum beeinflussen zu vermeiden, muss ein geeignetes System, um an Ort und Stelle, die während des Experiments erzeugt Alkoholdampf ausreichend entfernt genommen werden. Um Alkoholdämpfe zu entfernen, schließen Sie ein 12.6-Zoll-Rohrstück auf den zweiten Glasrohr aus jedem Fläschchen vorsteht, bündeln sie und leiten zu einer trichterVakuumSystem. Forscher sollten auch dafür sorgen, dass die experimentelle Testraum ausreichend belüftet wird. </li></ol></li></ol> 2. Vorbereitung der Versuchstiere Begründung und Übersicht: Die richtige Kultur und Gehäuse der Fliegen wird Variabilität in den Daten zu reduzieren. Dies wird durch die Standardisierung und die Minimierung der Belastung durch den Fliegen erlebt erreicht. Aus diesem Grund ist keine Anästhesie (CO 2 oder Alternativen) verwendet During der folgenden Schritte des Protokolls. Außerdem sollte Fliegen Alter über Experimente und Zeitpunkte abgestimmt, um die Variabilität zu minimieren, wie dies bei anderen Verhaltensanalysen einschließlich Lern-und Gedächtnisexperimente 17 sein. Verschiedene Licht: Dunkelheit kann verwendet werden, um die Funktion der circadianen Uhr in der Verhaltensreaktion auf Ethanol zu sondieren. Um festzustellen, ob ein Tagesrhythmus existiert, können Experimente unter einer definierten LD Zyklus durchgeführt werden, um die Leistung zu bestimmten Zeiten Zeitgeber (ZT) zu messen. ZT 0 steht für Dämmerung und wird als die Zeit der Lichter auf unter LD-Zyklen definiert, während ZT 12 ist die Zeit Lichter werden mit einem 12:12 h LD Zyklus eingeschaltet. Unter konstanten Bedingungen, die zirkadianen Zeit (CT) misst die Zeit für das Tier in der Abwesenheit von Umweltsignale, dh Freilaufzeit und wird auf die vorherige LD Mitnahmezyklus zusammen. In Wildtyp Drosophila, CT spiegelt die früheren ZT für die ersten paar Tages in konstanten Bedingungen wie der Freilaufzeit und circadianen Rhythmen sind ~ 24 Stunden. Zur Messung der circadiane Modulation und Beseitigung akuter Licht Auswirkungen auf Verhalten, sind die Fliegen zum Licht mitgerissen: Dunkel-Zyklen und dann konstant Dunkelheit (DD) vor den Experimenten übertragen. Circadian Experimente werden am zweiten Tag der DD durchgeführt, um die Leistung zu bestimmten Zeiten des zirkadianen (CT) zu messen. In Drosophila führen Dauerlicht (LL) Bedingungen der circadianen Dysfunktion mit angefeuchteten oder abgeschafft molekularen Schwingungen der Kernzirkadianen Gene und die Störung der Verhaltenszirkadianen Rhythmen wie Herzrhythmusstörungen und der Bewegungsaktivität 18-21 arrhythmische Kurzzeitgedächtnis 17 belegt. Das Protokoll ist für zirkadianen Studien optimiert und kann für andere Experimente vereinfacht werden. Kleine rote Lichter in 12 Zoll aus Rohren verwendet; zirkadianen Alle Experimente werden mit dim rotes Licht (Umgebungsoverhead-rotes Licht &lt;1 Lux auf Tischplatte durchgeführt~ 1 lux Licht). <ol><li> Rück die Fliegen bei 25 ° C unter 0.12 Stunden Licht: dunkelMitnahmeBedingungen (LD). </li><li> Sammeln frisch geschlüpften Fliegen am Ende des Tages-Lichtperiode am Tag 1 und speichern Sie sie für 24 Stunden unter LD Bedingungen halten Fläschchen mit einer kleinen Menge von High-Agar-Konzentration Lebensmitteln darauf Klebrigkeit zu minimieren. Hinweis: Um sicherzustellen, gesund, normal entwickelt Fliegen erhoben werden, nur Fliegen in den ersten Tagen nach dem Schlüpfen beginnt gesammelt in einer Kulturflasche. </li><li> Sammeln Chargen von ca. 30 (25-35) fliegt unter Verwendung eines Gebläses am Tag 2 gegen Ende der Lichtperiode, und Transfer zum Frischhalte Fläschchen. </li><li> Verwenden Sie eine starke Lichtquelle, um Fliegen zum anderen Ende des Fläschchens zu lenken. Innerhalb dieses Bereichs ist die genaue Anzahl der Fliegen in jeder Ampulle nicht kritisch, Verhaltensbeobachtungen sind in Prozentgesamtanzahl von Fliegen am Ende jedes Experiments gezählt berichtet. </li><li> Pflegen Fliegen unter DD Bedingungen bei 25 ° C for zwei Tage. </li><li> Am Tag des Experiments, legen alle Fliegen in verschiedenen Bedingungen oder anderen als der experimentelle Verhalten Raum in den Raum für mindestens 1 Stunde vor dem Experiment Inkubatoren gebracht. Akklimatisierung reduziert Variabilität durch Änderungen der Temperatur oder Luftfeuchtigkeit. </li><li> Beobachtungen machen zu sechs Zeitpunkten am Tag (CT 1, 5, 9, 13, 17 und 21), um für die circadiane Modulation des Verhaltens zu prüfen. </li><li> Vergleichen Sie mehrere Zeitpunkte in einem einzigen Satz von Verhaltensexperimenten, um die Robustheit des experimentellen Design zu erhöhen und die Variabilität zu minimieren auf einen einzigen Versuch. So kann beispielsweise Beobachtungen von CT 1 und CT-13 gleichzeitig erhalten werden, wenn zwei Inkubatoren mit gegen Hell-Dunkel-Zeitpläne werden zur Mitnahme verwendet. Hinweis: Das obige Verfahren beschreibt die Herstellung von Versuchstieren für Assays in zirkadianen Bedingung konstanter Dunkelheit durchgeführt. Verschiedene Licht: Dunkelheit kann die Funktion der Uhr zu sondierender Verhaltensreaktionen auf Alkohol. Um festzustellen, ob ein Tagesrhythmus besteht die Experimente unter einem LD-Zyklus zu bestimmten Zeiten Zeitgeber (ZT) durchgeführt, um die Leistung zu messen. Zusätzlich kann das Protokoll mit Fliegen unter konstanten Lichtbedingungen für Experimente Testzirkadianen Funktionsstörung erhöht werden. Für alternative Protokolle, die Fliegen im Lichtverhältnissen untergebracht testen, sollten Verhaltenstests noch unter dunklen Bedingungen durchgeführt werden. Fliegen sollte in den dunklen 1 h vor dem Experiment überführt werden, um Verhaltensvariabilität aufgrund der akuten Wirkungen von Licht auf das Verhalten zu minimieren. </li></ol> 3. Verhaltensbeobachtungen Begründung und Übersicht: Der folgende Alkoholverwaltung Protokoll wird für Beobachtungen unter schwachem Rotlicht Zustand optimiert. Die beiden Verhaltensmaßnahmen LORR und Sedierung repräsentieren zwei verschiedene Punkte des Fliegen Rausch. LORR stellt einen späten Punkt der Trunkenheit Einbeziehung der Verlust of Motor-und Haltungskontrolle, während Sedierung Maßnahmen eine sehr späte Endpunkt der Rausch. Genotyp oder zirkadiane Modulation kann diese beiden Maßnahmen unterschiedlich auswirken; damit man sich wünschen kann, um sowohl zu untersuchen. Kurz gesagt, werden entfernt in der Fläschchen geladen wird, werden die Anzahl der Fliegen Anzeige LORR oder Sedierung alle 5 min während der Alkoholdampf-Exposition, und die Gesamtzahl der entfernt am Ende des Experiments gezählt hat. <ol><li> Vor Beginn des Experiments, führen Sie die Luft durch das System (Luft durch Wasser-und Alkoholflaschen sprudelte) für mindestens 10 min und nutzen diese Zeit, um die Luftströme zu kalibrieren. </li><li> Trennen Sie den Schnellspanner um den Luftstrom zu stoppen. Laden Sie die Fliegen in den Fläschchen, und schließen Sie den Luftstrom und starten Sie die Timer. Hinweis: Wenn nicht mehr reagiert Fliegen oder tote Fliegen in den Halte Fläschchen verließ, könnte dies ein Hinweis auf Stress-Bedingungen sein. Im Allgemeinen können diese Bedingungen durch das Gehäuse weniger Fliegen in den Halte Fläschchen oder Verringerung der Nahrungs Klebrigkeit mit einem leichten gelindert werdenlich höher Agar-Konzentration während der Zubereitung von Speisen. Für eine optimale Verhaltens-Analysen und minimaler Variabilität zwischen den Experimenten sollten gesunde Fliegen vor den Experimenten sein. </li><li> Für die genaue Zeitmessung, verwenden Sie einen Timer, den Überblick über die Gesamtzeit der Exposition Alkohol halten und eine zweite Zählung-Timer zurück, um die 5-Minuten-Intervallen zu markieren. </li><li> Legen Sie ein weißes Blatt Papier unter den Fläschchen, um den Kontrast besonders unter schlechten Lichtverhältnissen zu erhöhen rot und fliegen Sichtbarkeit. </li><li> Überprüfen Sie regelmäßig den Luftstrom während eines Experiments zu konstanten Niveau zu halten. Im allgemeinen Luftströme einmal stabilisiert, stabil bleiben sie während der Dauer des Experiments. </li><li> Zählen Sie die Anzahl der Fliegen, die ihre Aufrichtungsreflexes einmal alle 5 Minuten für eine 1 Stunde Zeit verloren zu haben. Als die Alkoholempfindlichkeit variiert zwischen Genotypen und genetischen Hintergründen, kann es wünschenswert sein, häufiger Abschätzungen durchzuführen oder um den Versuch für eine längere Zeitdauer durchzuführen. </li><li> Heben Sie die Fläschchen slightly von der Oberfläche, und lenken das Licht von einem Rotlicht-Taschenlampe in Richtung der Papier hinter dem Fläschchen. Halten Sie die Hand-rot-Taschenlampen in einem Abstand von mindestens 12 cm zu den experimentellen Fläschchen Lichtverhältnisse nicht mehr als 1 Lux für alle Experimente unter schwachem Rotlicht Bedingungen aufrecht zu erhalten. </li><li> Messen Sie mit einem Lichtspiegel Lichtmesser, um Standards für alle Experimente zu etablieren. </li><li> Bestimmen Sie die Anzahl der Fliegen, die ihre Aufrichtungsreflexes, indem eine Firma Hahn in das Fläschchen verloren haben und zählen, wie viele Fliegen nicht, sich innerhalb von ca. 4 Sekunden rechts. Fliegen, die LORR anzeigen kann immer noch ihre Beine und Flügel zu bewegen, aber kann sich nicht aufrecht zu drehen. </li><li> Am Ende der Sitzung, zählen Sie die Anzahl der Fliegen in jeder Flasche. Hinweis: Gelegentlich kann eine Fliege zwischen dem Anschlag und der Seite, wenn das Laden in den Versuchsflaschen fliegt gefangen werden. Wie dies in der Dunkelheit durchgeführt, kann es nicht ohne weiteres bemerkt, so ist es notwendig, die Gesamt taub zu zählenER entfernt am Ende des Experiments Prozente korrekt zu berechnen. </li></ol> Darüber hinaus kann dieses Verfahren auch zur Sedierung von Fliegen, die eine andere Verhaltens Endpunkt darstellt messen. Während Fliegen sediert haben ihr Recht verloren Reflex, Sedierung erfordert eine größere Alkohol-Exposition. Verhaltens kann Sedierung durch das völlige Fehlen von Motorscheinaktivität mit Fliegen verbleibenden regungslos in dem Fläschchen folgenden aa Firma Hahn in das Fläschchen charakterisiert werden. Für Sedierung, zählen die Anzahl der Fliegen, die kein Bein unbewegt mit winken nach Lieferung der Firma Hahn der Flasche bleiben. Zusätzlich kann die Ampulle aufgerollt werden und her, um zu bestimmen, ob einzelne Fliegen noch ihre erregenden Reflex erhalten. 4. Datenanalyse <ol><li> Bestimmung der prozentualen LORR zu jedem Zeitpunkt auf der Basis der Gesamtzahl der in jedem Fläschchen entfernt beurteilt. </li><li> Schätz Unterschiede zwischen circadianen Zeitpunkten oder Stämme von Berechng 50% LORR für jede Probe, die in den linearen Teil der sigmoiden Kurve fällt (siehe Fig. 2). </li><li> Alternative Statistiken: <ol><li> Wenn Vergleiche zwischen Genotypen sind geplant, ist es wünschenswert, den gesamten Zeitverlauf analysiert mit wiederholten Messungen ANOVAand um den Bereich der Zeitpunkte, dass die Unterschiede signifikant mit Post-hoc-Tests (Fig. 3) zu bestimmen. Für diese Tests, bevorzugen wir einen Wert von 0,001 zu verwenden. Diese Unterschiede können an den einzelnen Belichtungszeiten sowie bewertet werden als Unterschiede zwischen den Genotypen in der Steigung der Kurve. </li><li> Unterschiede in der Empfindlichkeit kann für bestimmte Zeiten von Alkohol Belichtung für eine bestimmte Reaktion wie Sedierung aus dem linearen Teil der Kurve (Fig. 4) bestimmt werden. </li><li> Unterschiede zwischen Stämmen oder zirkadiane Zeitpunkte können mit Standard-F-Statistiken und Post-hoc-Tests geschätzt werden. </li></ol></li></ol>

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V., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+ethanol+consumption+in+Drosophila+models+features+of+addiction.">Preferential ethanol consumption in Drosophila models features of addiction.</a> Current Biology. 19, 2126-2132 (2009).</li><li>Devineni, A. V., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addiction-like+behavior+in+Drosophila.">Addiction-like behavior in Drosophila.</a> Communicative &amp; Integrative Biology. 3, 357-359 (2010).</li><li>Rodan, A. R., Rothenfluh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+behavioral+alcohol+responses+in+Drosophila.">The genetics of behavioral alcohol responses in Drosophila.</a> International Review of Neurobiology. 91, 25-51 (2010).</li><li>Boothroyd, C. E., Young, M. W., Pfaff, D. W., Kieffer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+Biophysical+Mechanisms+of+Arousal,+Alertness,+and+Attention.">Molecular and Biophysical Mechanisms of Arousal, Alertness, and Attention.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1129, 350-357 (2008).</li><li>Nitabach, M. N., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+Drosophila+circadian+control+circuit.">Organization of the Drosophila circadian control circuit.</a> Current Biology. 18, 84-93 (2008).</li><li>Sheeba, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+melanogaster+circadian+pacemaker+circuit.">The Drosophila melanogaster circadian pacemaker circuit.</a> J. Genet. 87, 485-493 (2008).</li><li>Cohan, F. M., Graf, J. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latitudinal+cline+in+Drosophila+melanogaster+for+knockdown+resistance+to+ethanol+fumes+and+for+rates+of+response+to+selection+for+further+resistance.">Latitudinal cline in Drosophila melanogaster for knockdown resistance to ethanol fumes and for rates of response to selection for further resistance.</a> Evolution. , 278-293 (1985).</li><li>Moore, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+intoxication+in+Drosophila:+Genetic+and+pharmacological+evidence+for+regulation+by+the+cAMP+signaling+pathway.">Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway.</a> Cell. 93, 997-1007 (1998).</li><li>Berger, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+sensitivity+and+tolerance+in+long-term+memory+mutants+of+Drosophila+melanogaster.">Ethanol sensitivity and tolerance in long-term memory mutants of Drosophila melanogaster.</a> Alcohol Clin Exp Res. 32, 895-908 (2008).</li><li>Pohl, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+Genes+Differentially+Affect+Tolerance+to+Ethanol.">Circadian Genes Differentially Affect Tolerance to Ethanol.</a> in Drosophila. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. , (2013).</li><li>Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assay+for+evoked+locomotor+behavior+in+Drosophila+reveals+a+role+for+integrins+in+ethanol+sensitivity+and+rapid+ethanol+tolerance.">An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 33, 1794-1805 (2009).</li><li>Rothenfluh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+behavioral+responses+to+ethanol+are+regulated+by+alternate+RhoGAP18B+isoforms.">Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms.</a> Cell. 127, (1016).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Die Kosten für Alkoholmissbrauch und Alkoholismus für die Gesellschaft ist enorm, sowohl in Bezug auf die menschliche und wirtschaftliche Kosten 29 30,31. Drosophila als Modell bietet eine schnelle und vielseitiges System, um schnell prüfen, die Verhaltensreaktionen von einer großen Zahl von Individuen und als solche wurde ausführlich sowohl für Alkohol 5,7,32-34 und circadianen Forschung 35-37 verwendet. Hier haben wir beschrieben, ein einfach...

Drosophila melanogaster zeigen zweiphasige Verhaltensreaktionen auf Alkohol ein, die analog zu menschlichen Reaktionen auf dieses Medikament 2,3 sind. Bei der ersten Exposition gegenüber niedrigen Konzentrationen von Alkohol, fliegt eine erhöhte Bewegungsaktivität, durch einen Mangel an Bewegungskoordination, den Verlust der Haltungskontrolle und Stellreflexe (Verlust des Stellreflexes: LORR) ersetzt, und Sedierung (vollständige Fehlen der motorischen Aktivität in Reaktion auf mechanische Stimulation) die Exposition gegenüber Alkohol fort 4-9. Die endogenen circadianen Uhr ist ein starker Modulator von Alkohol Empfindlichkeit und Toxizität in Mäusen 10,11, 12 Ratten beobachtet, und Menschen 13. Jüngste Fortschritte in der Drosophila-Forschung haben gezeigt, die innere Uhr moduliert akuten Alkoholempfindlichkeit, aber nicht ein Alkoholtoleranz. Die leistungsfähigen genetischen Ansätzen in Drosophila-Mutanten verfügbar durch Studien und transgenen Manipulationen der Raumund zeitliche Genexpression ein System, das eine schnelle Fortschritte bei der Identifizierung der zugrunde liegenden zellulären und molekularen Mechanismen für komplexe Verhalten ermöglicht. Die Verwendung von Drosophila als Untersuchungswerkzeug hat inhaltliche Fortschritte im Verständnis der Neurobiologie Alkohol, die schnell zu den Säugetieren 14-16 übersetzt werden kann, erlaubt. Um das Verständnis der molekularen Mechanismen, durch die der circadianen Uhr moduliert Alkohol Empfindlichkeit zu erleichtern und Verhaltensreaktionen über zirkadianen Zeitpunkten, eine Alkoholverwaltung Protokoll für den Einsatz bei schlechten Lichtverhältnissen rot gleichmäßig zu messen ist nicht erforderlich. Für Drosophila kann Alkohol durch Nahrungsergänzung für die chronische Exposition oder zuverlässig durch die Verwaltung Alkohol in Form von Dampf für die akute Exposition verabreicht werden. Hier ein Alkoholverwaltung Protokoll für die Beurteilung der Modulation der zirkadianen Loss-of-Stellreflex (LORR) 1 als auch beschreiben wirSedierung. 12-Stunden-LD-Zyklen bei konstanter Temperatur und dann auf eine gesteuerte Lichtregelung für 2-5 Tage, je nach Versuchs Frage übertragen: Fliegen sind mit 12 Stunden mitgenommen. Fliegen sind zu Ethanol Dampf in einem Gerät wie der Paddelstange bekannte ausgesetzt. In dieser Vorrichtung werden gesteuerte Mengen von Luft durch Wasser und Alkohol blasen; die Dämpfe werden dann gemischt und in eine Ampulle Gehäuse die Fliegen gerichtet. Alle 5 min die Fliegen für die Nummer, die angezeigt werden Stellreflexe oder haben sich nicht sediert erzielt. LORR Prozentsätze für jeden Zeitpunkt berechnet werden und unter zirkadianen Zeitpunkten oder zwischen Stämmen verglichen entfernt. Die Einfachheit und Zuverlässigkeit der Lieferung Alkohol mit der Paddelstange Alkohol Lieferung kombiniert mit Verhaltensanalyse-Optionen bietet einen bedeutenden Vorteil für circadiane Experimente unter dunklen Bedingungen durchgeführt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="815">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Alcohol 190 proof</td>
			<td style="width:115px;">Various</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Name of Material</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:296px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Aerator</td>
			<td style="width:115px;">Local pet store</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:296px;">We use Whisper 60</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Silicone tubing 1/8&#8221;</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">408060-0030</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">120&#176; Y Connector</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82017-256</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Quick disconnects</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">46600-048</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Plastic tube clamps</td>
			<td style="width:115px;">Bell-art products</td>
			<td style="width:119px;">132250000</td>
			<td style="width:296px;">Either this or next</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Miniature Air Regulator</td>
			<td style="width:115px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">8727K11</td>
			<td style="width:296px;">Either this or previous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Miniature Air Regulator Mounting Bracket</td>
			<td style="width:115px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">9891K66</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Gilmont size 12 flow meter</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">29895-242</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Tool clips</td>
			<td style="width:115px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">1722A43</td>
			<td style="width:296px;">To hold flow meters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Vial</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89092-722</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Rubber stopper with two holes</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">59585-186</td>
			<td style="width:296px;">Fits in vials</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">5 mm Pyrex Glass tubes</td>
			<td style="width:115px;">Trikinetics</td>
			<td style="width:119px;">PGT5x65</td>
			<td style="width:296px;">Fits best in previous stopper.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Teflon tape</td>
			<td style="width:115px;">Hardware store</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:296px;">To achieve snug fit in stoppers if necessary</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Rubber stopper with two holes</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">59582-122</td>
			<td style="width:296px;">Fits our bottles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Disposable glass pipets</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">53283-768</td>
			<td style="width:296px;">Cut to length and bend by heating</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Very fine nylon netting</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">Various</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">15 watt bulbs</td>
			<td style="width:115px;">Hardware store</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:296px;">Overhead red light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Photographic red safe light filters</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:296px;">Overhead red light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Mini Flashlights with red filters</td>
			<td style="width:115px;">Mag-light</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the flybar: administering alcohol to flies

Fruchtfliegen (Drosophila melanogaster) sind ein etabliertes Modell sowohl für Alkoholforschung und circadianen Biologie. Kürzlich haben wir gezeigt, dass die innere Uhr moduliert Alkoholempfindlichkeit, aber nicht die Bildung von Toleranz. Hier beschreiben wir unser Protokoll im Detail. Alkohol wird den Fliegen mit dem Paddelstange verabreicht. Bei diesem Aufbau wird gesättigten Alkohol mit Dampf befeuchtete Luft in der Serie Verhältnissen gemischt, und die Fliegen in vier Röhrchen gleichzeitig verabreicht werden. Fliegen sind unter standardisierten Bedingungen, um die Abweichung zwischen den Replikaten minimieren aufgezogen. Drei Tage alte Fliegen der verschiedenen Genotypen oder Behandlungen werden für die Experimente bevorzugt durch Anpassen entfernt von zwei verschiedenen Zeitpunkten (z. B. CT 5 und CT 17) direkte Vergleiche möglich eingesetzt. Während des Versuchs werden entfernt für 1 h in den vorbestimmten Prozentsatz der Alkoholdampf und der Anzahl von Fliegen, die den Verlust des Stellreflexes (LORR) aufweisen ausgesetzt oder Sedation werden alle 5 min gezählt. Die Daten können unter Verwendung von drei verschiedenen statistischen Methoden analysiert werden. Die erste ist die Zeit, bei der 50% der Fliegen ihre Aufrichtungsreflexes verloren bestimmen und eine Analyse der Varianz (ANOVA), um festzustellen, ob wesentliche Unterschiede zwischen den Zeitpunkten vorhanden sein. Die zweite ist die Prozent Fliegen, die LORR zeigen nach einer bestimmten Anzahl von Minuten, gefolgt von einer ANOVA-Analyse zu bestimmen. Die letzte Methode ist, um die gesamte Zeitreihe mit multivariaten Statistiken zu analysieren. Das Protokoll kann auch für Nicht-circadianen Experimente oder Vergleiche zwischen Genotypen verwendet werden.

Die Modulation der zirkadianen Alkohol-Empfindlichkeit mit dem 50% LORR als Markierung. Ein repräsentatives Beispiel zeigt circadiane Modulation in Alkohol Empfindlichkeit während des Tages ist in Abbildung 2 dargestellt. LORR wurde an sechs Zeitpunkten während der 2. Tag der DD in Canton-S gemessen und die 50% LORR wurde für jeden Zeitpunkt bestimmt. Analyse zeigte einen signifikanten Effekt der Tageszeit (ANOVA: F 5,45 = 7,39, p &lt;0,001...

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The FlyBar: Administering Alcohol to Flies

Drosophila ist als bedeutsamer Modellsystem zum Zerlegen der zellulären und molekularen Grundlagen von Verhaltensreaktionen auf Alkohol entstanden. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Sammlung von Alkohol Empfindlichkeit von Daten in einem zirkadianen Kontext, die leicht auf andere Experimente angewendet werden kann und ist für Bachelor-Forschung gut geeignet.

Paddelstange: Verwaltung Alkohol zu Flies

Fruit flies (Drosophila melanogaster) are an established model for both alcohol research and circadian biology. Recently, we showed that the circadian ...

the-flybar-administering-alcohol-to-flies

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.6K Aufrufe.  Florida State University.  Drosophila ist als bedeutsamer Modellsystem zum Zerlegen der zellulären und molekularen Grundlagen von Verhaltensreaktionen auf Alkohol entstanden. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Sammlung von Alkohol Empfindlichkeit von Daten in einem zirkadianen Kontext, die leicht auf andere Experimente angewendet werden kann und ist für Bachelor-Forschung gut geeignet. 

Serie: The FlyBar: Administering Alcohol to Flies

Assessment of Ultrasonic Vocalizations During Drug Self-administration in Rats

Drug self-administration procedures are commonly used to study behavioral and neurochemical changes associated with human drug abuse, addiction and relapse. Various types of behavioral activity are commonly utilized as measures of drug motivation in animals. However, a crucial component of drug abuse relapse in abstinent cocaine users is "drug craving", which is difficult to model in animals, as it often occurs in the absence of overt behaviors. Yet, it is possible that a class of ultrasonic vocalizations (USVs) in rats may be a useful marker for affective responses to drug administration, drug anticipation and even drug craving. Rats vocalize in ultrasonic frequencies that serve as a communicatory function and express subjective emotional states. Several studies have shown that different call frequency ranges are associated with negative and positive emotional states. For instance, high frequency calls ("50-kHz") are associated with positive affect, whereas low frequency calls ("22-kHz") represent a negative emotional state. This article describes a procedure to assess rat USVs associated with daily cocaine self-administration. For this procedure, we utilized standard single-lever operant chambers housed within sound-attenuating boxes for cocaine self-administration sessions and utilized ultrasonic microphones, multi-channel recording hardware and specialized software programs to detect and analyze USVs. USVs measurements reflect emotionality of rats before, during and after drug availability and can be correlated with commonly assessed drug self-administration behavioral data such lever responses, inter-response intervals and locomotor activity. Since USVs can be assessed during intervals prior to drug availability (e.g., anticipatory USVs) and during drug extinction trials, changes in affect associated with drug anticipation and drug abstinence can also be determined. In addition, determining USV changes over the course of short- and long-term drug exposure can provide a more detailed interpretation of drug exposure effects on affective functioning.

Drug self-administration and ultrasonic vocalizations (USV) are used as behavioral assessments in animal research, but rarely in combination. The purpose of this article is to describe the advantages of recording USVs during drug self-administration procedures to assess affective responses to drug experience.

Beurteilung der Ultraschall-Vocalizations Während Drug Selbstverwaltung in Ratten

Drug self-administration procedures are commonly used to study behavioral and neurochemical changes associated with human drug abuse, addiction and ...

Forschung

Neurowissenschaften

A Simple Way to Measure Ethanol Sensitivity in Flies

Low doses of ethanol cause flies to become hyperactive, while high doses are sedating. The sensitivity to ethanol-induced sedation of a given fly strain is correlated with that strain s ethanol preference, and therefore sedation is a highly relevant measure to study the genetics of alcohol responses and drinking. We demonstrate a simple way to expose flies to ethanol and measure its intoxicating effects. The assay we describe can determine acute sensitivity, as well as ethanol tolerance induced by repeat exposure. It does not require a technically involved setup, and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A simple assay to measure the sedating effects of ethanol on Drosophila flies, based on the loss of righting reflex, is described.

Ein einfacher Weg zu Ethanol Empfindlichkeit in Flies Measure

Low doses of ethanol cause flies to become hyperactive, while high doses are sedating. The sensitivity to ethanol-induced sedation of a given fly strain ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation von Neuronen aus Nager Hirnschnitten zu Study Synaptic Transmission and Image präsynaptischen

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Experimental Methods for Testing the Effects of Neurotrophic Peptide, ADNF-9, Against Alcohol-induced Apoptosis during Pregnancy in C57BL/6 Mice

Experimental designs for investigating the effects of prenatal alcohol exposure during early embryonic stages in fetal brain growth are challenging. This is mostly due to the difficulty of microdissection of fetal brains and their sectioning for determination of apoptotic cells caused by prenatal exposure to alcohol. The experiments described here provide visualized techniques from mice breeding to the identification of cell death in fetal brain tissue. This study used C57BL/6 mice as the animal model for studying fetal alcohol exposure and the role of trophic peptide against alcohol-induced apoptosis. The breeding consists of a 2-hr matting window to determine the exact stage of embryonic age. An established fetal alcohol exposure model has been used in this study to determine the effects of prenatal alcohol exposure in fetal brains. This involves free access to alcohol or pair-fed liquid diets as the sole source of nutrients for the pregnant mice.
The techniques involving dissection of fetuses and microdissection of fetal brains are described carefully, since the latter can be challenging. Microdissection requires a stereomicroscope and ultra-fine forceps. Step-by-step procedures for dissecting the fetal brains are provided visually. The fetal brains are dissected from the base of the primordium olfactory bulb to the base of the metencephalon.
For investigating apoptosis, fetal brains are first embedded in gelatin using a peel-away mold to facilitate their sectioning with a vibratome apparatus. Fetal brains embedded and fixed in paraformaldehyde are easily sectioned, and the free floating sections can be mounted in superfrost plus slides for determination of apoptosis or cell death.
TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick End Labeling; TdT: terminal deoxynucleotidyl transferase) assay has been used to identify cell death or apoptotic cells. It is noteworthy that apoptosis and cell-mediated cytotoxicity are characterized by DNA fragmentation. Thus, the visualized TUNEL-positive cells are indicative of cell death or apoptotic cells.
The experimental designs here provide information about the use of an established liquid diet for studying the effects of alcohol and the role of neurotrophic peptides during pregnancy in fetal brains. This involves breeding and feeding pregnant mice, microdissecting fetal brains, and determining apoptosis. Together, these visual and textual techniques might be a source for investigating prenatal exposure of harmful agents in fetal brains.

The experimental designs proposed here focus on studying the effects of alcohol exposure in apoptosis and the application of neurotrophic peptide during pregnancy in fetal brain. A detailed description from the breeding to the collection of fetal brains is described. Techniques for determination of apoptosis are also described in detail.

Experimentelle Methoden zur Prüfung der Auswirkungen von Neurotrophic Peptide, ADNF-9, gegen den Alkohol-induzierte Apoptose während der Schwangerschaft in C57BL / 6 Mäuse

Experimental designs for investigating the effects of prenatal alcohol exposure during early embryonic stages in fetal brain growth are challenging. This ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation of the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient for the expression of foreign genes into neuronal cells. In this manuscript we provide a method that demonstrates uniquely how to electroporate DNA into the avian hindbrain at E2.75 in order to specifically label a subset of neuronal progenitors, and how to follow their axonal projections and synaptic targets at much advanced stages of development, up to E14.5. We have utilized novel genetic tools including specific enhancer elements, Cre/Lox - based plasmids and the PiggyBac-mediated DNA transposition system to drive GFP expression in a subtype of hindbrain cells (the dorsal most subgroup of interneurons, dA1). Axonal trajectories and targets of dA1 axons are followed at early and late embryonic stages at various brainstem regions. This strategy contributes advanced techniques for targeting cells of interest in the embryonic hindbrain and for tracing circuit formation at multiple stages of development.

How neuronal networks are established in the embryonic brain is a fundamental question in developmental neurobiology. Here we combined an electroporation technique with novel genetic tools, such as Cre/Lox&#x2013;plasmids and PiggyBac-mediated DNA transposition system in the avian hindbrain to label dorsal interneurons and track their axonal projections and synaptic targets at various developmental stages.

Elektroporation des Hinterhirn zu Axonal Trajectories und Synaptic Treffer in der Embryo-Küken Trace

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In Vivo Zwei-Photonen-Imaging Of Experience-abhängigen molekularen Veränderungen in kortikalen Neuronen

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

A Method to Make a Craniotomy on the Ventral Skull of Neonate Rodents

The use of a craniotomy for in vivo experiments provides an opportunity to investigate the dynamics of diverse cellular processes in the mammalian brain in adulthood and during development. Although most in vivo approaches use a craniotomy to study brain regions located on the dorsal side, brainstem regions such as the pons, located on the ventral side remain relatively understudied. The main goal of this protocol is to facilitate access to ventral brainstem structures so that they can be studied in vivo using electrophysiological and imaging methods. This approach allows study of structural changes in long-range axons, patterns of electrical activity in single and ensembles of cells, and changes in blood brain barrier permeability in neonate animals. Although this protocol has been used mostly to study the auditory brainstem in neonate rats, it can easily be adapted for studies in other rodent species such as neonate mice, adult rodents and other brainstem regions.

A surgical method is described to expose the ventral skull in neonate rats. Using this approach it is possible to open a craniotomy to perform acute electrophysiology and two-photon microscopy experiments in the brainstem of anesthetized pups.

Eine Methode, um eine Kraniotomie auf der Bauch Schädel des Neugeborenen Nagetiere Stellen

The use of a craniotomy for in vivo experiments provides an opportunity to investigate the dynamics of diverse cellular processes in the mammalian brain ...

An Inexpensive, Scalable Behavioral Assay for Measuring Ethanol Sedation Sensitivity and Rapid Tolerance in Drosophila

Alcohol use disorder (AUD) is a serious health challenge. Despite a large hereditary component to AUD, few genes have been unambiguously implicated in their etiology. The fruit fly, Drosophila melanogaster, is a powerful model for exploring molecular-genetic mechanisms underlying alcohol-related behaviors and therefore holds great promise for identifying and understanding the function of genes that influence AUD. The use of the Drosophila model for these types of studies depends on the availability of assays that reliably measure behavioral responses to ethanol. This report describes an assay suitable for assessing ethanol sensitivity and rapid tolerance in flies. Ethanol sensitivity measured in this assay is influenced by the volume and concentration of ethanol used, a variety of previously reported genetic manipulations, and also the length of time the flies are housed without food immediately prior to testing. In contrast, ethanol sensitivity measured in this assay is not affected by the vigor of fly handling, sex of the flies, and supplementation of growth medium with antibiotics or live yeast. Three different methods for quantitating ethanol sensitivity are described, all leading to essentially indistinguishable ethanol sensitivity results. The scalable nature of this assay, combined with its overall simplicity to set-up and relatively low expense, make it suitable for small and large scale genetic analysis of ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila.

An Inexpensive, Scalable Behavioral Assay for Measuring Ethanol Sedation Sensitivity and Rapid Tolerance in Drosophila

Straightforward assays for measuring ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila facilitate the use of this model organism for investigating these important ethanol-related behaviors. Here, a relatively simple, scalable assay for measuring ethanol sensitivity and rapid tolerance in flies is described.

Eine preiswerte, skalierbare Behavioral Assay zur Messung von Ethanol Sedierung Empfindlichkeit und Rapid Toleranz in<em&gt; Drosophila</em

Alcohol use disorder (AUD) is a serious health challenge. Despite a large hereditary component to AUD, few genes have been unambiguously implicated in ...

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the development of more effective treatments is the relative lack of understanding of the molecular underpinnings of the effects of ethanol on behavior. The nematode, Caenorhabditis elegans (C.&#160;elegans), provides a useful model in which to generate and test hypotheses about the molecular effects of ethanol. Here, we describe an assay that has been developed and used to examine the roles of particular genes and environmental factors in behavioral responses to ethanol, in which locomotion is the behavioral output. Ethanol dose-dependently causes an acute depression of crawling on an agar surface. The effects are dynamic; animals exposed to a high concentration demonstrate an initial strong depression of crawling, referred to here as initial sensitivity, and then partially recover locomotion speed despite the continued presence of the drug. This ethanol-induced behavioral plasticity is referred to here as the development of acute functional tolerance. This assay has been used to demonstrate that these two phenotypes are distinct and genetically separable. The straightforward locomotion assay described here is suitable for examining the effects of both genetic and environmental manipulations on these acute behavioral responses to ethanol in C.&#160;elegans.

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay.

Ein Test zur Messung der Wirkung von Ethanol auf die Fortbewegungsgeschwindigkeit der<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

Video Imaging and Spatiotemporal Maps to Analyze Gastrointestinal Motility in Mice

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central nervous system. Changes in ENS function are a major cause of GI symptoms and disease and may contribute to GI symptoms reported in neuropsychiatric disorders including autism. It is well established that isolated colon segments generate spontaneous, rhythmic contractions known as Colonic Migrating Motor Complexes (CMMCs). A procedure to analyze the enteric neural regulation of CMMCs in ex vivo preparations of mouse colon is described. The colon is dissected from the animal and flushed to remove fecal content prior to being cannulated in an organ bath. Data is acquired via a video camera positioned above the organ bath and converted to high-resolution spatiotemporal maps via an in-house software package. Using this technique, baseline contractile patterns and pharmacological effects on ENS function in colon segments can be compared over 3-4 hr. In addition, propagation length and speed of CMMCs can be recorded as well as changes in gut diameter and contraction frequency. This technique is useful for characterizing gastrointestinal motility patterns in transgenic mouse models (and in other species including rat and guinea pig). In this way, pharmacologically induced changes in CMMCs are recorded in wild type mice and in the Neuroligin-3R451C mouse model of autism. Furthermore, this technique can be applied to other regions of the GI tract including the duodenum, jejunum and ileum and at different developmental ages in mice.

This article describes a video imaging technique and high-resolution spatiotemporal mapping to identify changes in the neural regulation of colonic motility in adult mice. Subtle effects on gastrointestinal (GI) function can be detected using this approach in isolated tissue preparations to advance our understanding of GI disease.

Video Imaging und Raum-Zeit-Karten zur Analyse Gastrointestinale Motilität bei Mäusen

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central ...

Paddelstange: Verwaltung Alkohol zu Flies

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