This work was supported by the National Institute on Aging (AG039768) to MHK. We thank Drs. Thomas Sharkey and Honggao Yan for generously providing the instruments, as well Sean Weise and Yan Wu for technical assistance.

1. Preparazione dei reagenti <ol><li> Preparare buffer di aggregazione (20 mM Tris, pH 7,4, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM). Conservare a temperatura ambiente, stabile per mesi. Supplemento 1 ditiotreitolo mm (DTT) prima dell&#39;uso. NOTA: tampone-HEPES (10 mM HEPES, pH 7,5, 0,1 mM EDTA, 5 mM DTT) produce anche risultati simili in aggregazione tau. </li><li> Preparare tioflavina T o thioflavin soluzione S stock (3 mm, disciolto in tampone aggregazione), e il filtro da 0,22 micron unità filtro sterile. Conservare a -20 ° C in un tubo rivestito da un foglio di alluminio, stabile per mesi. </li><li> Preparare eparina soluzione madre (300 micron, disciolti in tampone di aggregazione). Conservare a -20 ° C, stabile per mesi. </li><li> Preparare ditiotreitolo (DTT) stock (1 M, sciolto in acqua). Aliquota in provette da 1,5 ml. Conservare a -20 ° C. Prima di metodiche di aggregazione, scongelare la soluzione 1 M a RT. Da questo 1,000x magazzino, preparare una aliquota di 100 mm magazzino lavorano con acqua deionizzata. Lascia sul ghiacciofino al momento. </li><li> Rimuovere tau da -80 ° C freezer. Scongelare su ghiaccio. Regolare tau a concentrazione prefissata con il tampone di aggregazione. Spin in una microcentrifuga a 20.800 xg per 10 min a 4 ° C per rimuovere grandi aggregati preformati. Questa fase di pre-filatura aumenta coerenza nella successiva misura della fluorescenza di ciascun lotto della preparazione proteine. Trasferire il surnatante in un&#39;altra provetta; lasciare in ghiaccio fino al momento di montare la reazione di aggregazione. </li></ol> 2. No-dye, Assay Terminal NOTA: La reazione aggregazione di questa analisi viene effettuata in assenza del colorante fluorescente. Dopo la miscelazione di tutti i componenti, la reazione viene lasciata procedere a predeterminati intervalli di tempo. Aliquote vengono poi portati fuori della reazione aggregazione e mescolati con ThT o ThS per vincolante prima della lettura della fluorescenza amiloide. Il volume iniziale della reazione aggregazione dipende dal numero di punti temporali necessari. Questo approccio può require una grande quantità di proteina tau, ma è veloce, semplice, e può essere fatto in un fluorimetro o un lettore di piastre a più pozzetti (vedi Discussione). Di seguito è riportato il funzionamento passo-passo, con l&#39;ISA SPEX FluoroMax-2 spettrofluorimetro compatto per la fluorescenza quantificazione. <ol><li> Impostare la miscela aggregazione in 1,5 ml provette Eppendorf come in Tabella 1. Ciascuna colonna rappresenta gli ingredienti necessari per una reazione di 100 microlitri, che è sufficiente per una misurazione time-point. Regolare la quantità per l&#39;intera miscela aggregazione in base ai punti di tempo necessari per la particolare esperimento. Aggiungere ulteriore 10% di ciascun componente per dare spazio a pipettaggio errore. La tipica reazione contenente eparina qui illustrato può essere sostituito da acido arachidonico o buffer di aggregazione. Aggiungere DTT 1 mM alla miscela di reazione. Se l&#39;intera reazione dura più di un giorno, integrare fresco DTT quotidiana (1 mm) per garantire un ambiente riducente. </li><li> Invertire la provetta un paio di volte per mescolare. PlaCe ogni reazione in un incubatore o bagnomaria 37 ° C. L&#39;agitazione non è necessario per l&#39;aggregazione tau. </li><li> Prima di misurare la fluorescenza, accendere la spettrofluorimetro (lampada, poi computer). NOTA: La lampada ad arco allo xeno che può essere utilizzato immediatamente. Tuttavia, per i migliori risultati permettono alla macchina di riscaldare per circa 10 minuti prima di leggere la fluorescenza. </li><li> Avviare il software sul computer. <ol><li> Scegli Tempo reale modalità di visualizzazione in Instrument Control Center, impostare l&#39;eccitazione lunghezza d&#39;onda di 450 nm (slit a 2 nm) e lunghezza d&#39;onda di emissione di 510 nm (fessura di 5 nm). Chiudere la finestra Modalità di visualizzazione tempo reale per tornare al Centro di controllo dello strumento. </li><li> Scegli Constant chiave analisi Lunghezza d&#39;onda, premere Aggiungi &gt;&gt; nel frame superiore per aggiungere lunghezze d&#39;onda set. Impostare i parametri di acquisizione di errore standard a 1 e Trials massimo a 3, quindi fare clic su Aggiungi. Fare clic su Go! Per aprire la visualizzazione di datifinestra. </li><li> Nella finestra di visualizzazione dei dati, fare clic su Start Acq per aprire la finestra di dialogo Nuovo campione. Scegliere &quot;sconosciuto&quot; per tipo di campione. </li></ol></li><li> Per ogni miscela aggregazione 100 ml, aggiungere 98 microlitri di buffer di aggregazione e 2 pl 3 mM thioflavin T. Dispensare più volte per mescolare. </li><li> Trasferire la miscela in una provetta (FCA3, la dimensione esterna, WxLxH = 12,5 millimetri x 12,5 millimetri x 45 mm). Posizionare la cuvetta nel portacampioni nel campione-vano e chiudere il coperchio. Fare clic su Esegui per raccogliere i dati di fluorescenza. Registrare i dati. </li><li> Rimuovere la cuvetta e decantare la soluzione. Sciacquare la cuvetta da acqua distillata 3 volte. Dry soffiando aria dentro e fuori la cuvetta. </li></ol> 3. Con-dye, continua Modalità Assay on a Plate Reader SpectraMax M2 NOTA: Questo test differisce dalla precedente in quanto il colorante fluorescente ThT o ThS è incluso nel aggregareazione zione. Questo permette la misura continua della stessa serie di reazioni. A causa dell&#39;uso ripetitivo della reazione, questo metodo è migliore fatto con un lettore automatico piastra multi-pozzetto (come mostrato di seguito il funzionamento del SpectraMax M2). Un fluorimetro regolare funziona anche, ma la frequenza di misura delle reazioni veloci aggregazione è piuttosto limitata, a causa della natura manuale dell&#39;operazione. <ol><li> Impostare il mix di aggregazione in una piastra a 96 pozzetti (96 pozzetti nero piastra solida, ben volume 360 ml, fondo piatto), come nella tabella 2. Ogni colonna rappresenta gli ingredienti necessari per una reazione di 200 ml, che è sufficiente per una misurazione del tempo-point. Mescolare bene pipettando più volte. Supplemento fresco 1mM DTT ogni giorno nel corso di esperimenti. </li><li> Incubare la piastra a 96 pozzetti a 37 ° C. </li><li> Ad ogni punto di tempo prima della misurazione della fluorescenza, accendere il lettore di micropiastre multi-mode e il computer. Lasciare il tempo sufficiente per la machine per stabilizzare, circa 10 min. </li><li> Avviare il software sul computer. Temperatura impostata a 37 ° C e scegli fluorescenza intensità modalità (FI-Top Read), impostare la lunghezza d&#39;onda di eccitazione a 450 nm ed emissione lunghezza d&#39;onda a 510 nm. </li><li> Inserire la piastra a 96 pozzetti nel cassetto e premere il tasto per avviare la misurazione LEGGI. </li><li> Dopo aver letto, rimuovere la piastra e tornare indietro al C incubatore 37 °. Copiare i dati e incollare in un foglio di calcolo Excel per l&#39;analisi dei dati e la stampa. </li></ol> 4. Con-dye, continua la modalità del test su un Compact Spettrofluorimetro <ol><li> Impostare la miscela aggregazione in 1,5 ml provette Eppendorf come nella Tabella 3. Ciascuna colonna rappresenta gli ingredienti necessari per una reazione di 200 microlitri, che è sufficiente per una misurazione time-point. </li><li> Invertire la provetta un paio di volte per mescolare. </li><li> Accendere il spettrofluorimetro e impostare il software in passi 2.3 e 2.4. </li><li> Trasferire la miscela toa cuvetta. Posizionare la cuvetta nel portacampioni nel campione-vano e chiudere il coperchio. Fare clic su Esegui per raccogliere i dati di fluorescenza. Registrare i dati. </li><li> Continua a leggere ad intervalli appropriati facendo clic su Esegui e la registrazione dei dati. Se l&#39;aggregazione deve essere controllata ad una frequenza elevata (ad esempio, ogni 30 o 60 sec), lasciano la reazione nella cuvetta e nella macchina fino a quando la misura è terminato, o quando vi è tempo sufficiente per scambiare reazioni o cuvette. </li><li> Rimuovere la cuvetta e decantare la soluzione. Sciacquare la cuvetta da acqua distillata 3 volte. Dry soffiando aria dentro e fuori la cuvetta. </li></ol>

We have nothing to disclose.

Questo protocollo dimostra diverse condizioni e strumenti che rilevano i tau veloce cinetica di aggregazione fosforilazione-dipendente saggio. Nel saggio terminale, il colorante fluorescente ThT viene aggiunto ad una porzione della reazione rimossa dal master mix ad ogni tempo. Amiloide legame-Induced Fluorescence viene poi misurato 26. Nel secondo, con colorante modalità, aggregazione tau viene effettuata in presenza di ThT o ThS, rendendo questo tipo di reazione adatto per la valutazione automatica in temp...

La malattia di Alzheimer (AD) è uno di una grande collezione di malattie neurodegenerative noti come taupatie. Il taupatia patologia sottostante per eccellenza sono i grovigli neurofibrillari, NFTs, in neuroni, astrociti e microglia 1-4. La densità NFT correlato con deterioramento cognitivo 3,5 e neurone perdita 6. NFT contiene proteine ​​tau principalmente iperfosforilata (denominato &quot;p-tau&quot; d&#39;ora in poi) che forma filamenti elicoidali diritte o appaiati (PHF) 7,8. Tau è una proteina associata ai microtubuli che facilita il trasporto assonale che è essenziale per la segnalazione neuronale e il traffico di 9,10. Ogni molecola tau contiene 2-3 fosfati nel cervello normale, ma il contenuto fosforil aumenta di diverse pieghe in pazienti taupatia 11. Più chinasi sono suscettibili di contribuire al tau iperfosforilazione compreso GSK3β (glicogeno sintasi chinasi 3β) e CDK5 (ciclina-dechinasi pendent 5) 12,13, ma il grilletto diretto per la fosforilazione patologico rimane sfuggente 14. Fosforilazione anormale nella zona di motivi microtubuli vincolante dissocia tau dal microtubuli 15, e causa tau mis-localizzazione al comparto Somatodendritic, dove p-tau oligomerizes in filamenti elicoidali diritti o coppie che può eventualmente polimerizzare in inclusioni NFT. Il legame stretto tra tau iperfosforilazione, formazione NFT, e neurodegenerazione ha portato ad una ipotesi prevalente che grovigli p-tau inducono risposte citotossiche apoptotici e altri, e, quindi, è la causa di fondo per taupatia neurodegenerazione 16,17. Schermi di droga e primi test clinici basati su questo presupposto sono stati lanciati 18. Tuttavia, questa ipotesi deve affrontare sfide 19,20. Ad esempio, SantaCruz et al. Hanno mostrato che le funzioni cognitive di topi transgenici possono essere migliorate sopprimendo l&#39;espressione di un mutantetau umana, anche se NFTs continuato a formare da molecole di tau esistenti 21. In un modello di Drosophila, NFT ha dimostrato di sequestrare il citosolico tau tossico per proteggere le cellule neuronali sottostanti 22,23. Chiaramente, il ruolo patogenesi di NFT, se presente, urterà notevolmente la direzione di sviluppo terapie taupatia. In alte concentrazioni, proteina tau cervello ricombinante o normale spontaneamente ma lentamente polimerizza in una struttura PHF-come in vitro, come indicato dal legame dei diversi coloranti β-sheet preferiti fluorescenti, microscopia elettronica, e la luce spettroscopia di scattering 24-27. L&#39;aggiunta di eparina o acido arachidonico, un acido grasso abbondante nel cervello umano, accelera drasticamente la formazione di PHF tau in isoform- e modi di concentrazione-dipendente induttore 28-32. Curiosamente, tau iperfosforilata purificato da cervelli AD o preparato esaustivo in reazioni di fosforilazione in vitro unggregates più veloce ed efficiente 26,33-35. Questi risultati sono in eccellente accordo con i ruoli patologiche di p-tau. Un sistema in vitro basato sull&#39;aggregazione di p-tau può quindi servire come un potente strumento per lo screening di stupefacenti AD. Data la stretta associazione tra l&#39;aggregazione di tau e la neurodegenerazione progressiva di AD, così come il recente fallimento nello sviluppo di farmaci mira la targa Ap, un altro tasto marcatore istologica di AD 36-38, l&#39;interesse per la scoperta di farmaci che controllano l&#39;aggregazione di tau è in aumento. Infatti, diversi gruppi hanno già iniziato schermi di droga a velocità differenti, utilizzando in vitro le reazioni di aggregazione tau, come il test primario. Sono stati trovati una serie di sostanze chimiche per esporre le attività inibitoria o di inversione di aggregazione tau in vitro 39-42. Tuttavia, tutti gli schermi attuali regolatore di aggregazione tau usano tau non modificato che manca il bersaglio patologico chiave di fosforoylation, sollevando una preoccupazione per la specificità e l&#39;efficacia di utilizzo di questi composti in trattamento dC. Uno dei principali ostacoli di sviluppare metodiche di aggregazione per la caratterizzazione biochimica e screening di farmaci AD è la produzione di quantità sufficienti di fisiopatologicamente relativa proteina tau iperfosforilata. Utilizzando il sistema di catalisi Zippers-assistita in cui l&#39;isoforma 1N4R del tau e la chinasi GSK-3β sono co-espressi in E. coli come proteine ​​di fusione leucina cerniera, abbiamo superato questa sfida (. Sui et al, ha presentato, vedere la Figura 1 per i prodotti finali di tau e P-tau, anche vedere 43 di pronuncia caratterizzazione spettrometria di massa di p-tau). Da un gruppo di nove anticorpi specifici per i diversi siti di fosforilazione di tau, segnali positivi sono stati osservati in otto posizioni (dati non riportati). Qui di seguito, descriviamo protocolli e strumentazioni in grado di differenziare l&#39;aggregazione d cineticaifferences tra tau non modificato e specie p-tau. Questi test sono stati modificati da protocolli pubblicati che misuravano l&#39;aumento della fluorescenza del tioflavina T (ThT) o thioflavin S (ThS) su amiloide (aggregati tau) vincolante 26. Nel primo &quot;terminale&quot;, approccio senza colorante, reazioni aggregazione sono assemblati e incubate in assenza del colorante amiloide. A tempi diversi, un&#39;aliquota di ogni reazione viene rimosso e mescolato con un volume uguale di tampone contenente ThT fermare aggregazione e consentire di impegnare ThT aggregati tau. La fluorescenza è misurata da un IAP FluoroMax-2 fluorimetro. Nel secondo &quot;con-dye&quot; continuo monitoraggio del dosaggio, ThT o ThS è incluso nelle reazioni di aggregazione. Fluorescenza può essere misurato continuamente durante l&#39;intero esperimento manualmente oppure utilizzando un lettore multi-piastra. Inoltre, descriviamo un metodo che utilizza una concentrazione quasi fisiologica di tau e P-tau per l&#39;aggregazione nel mo misura continuade. L&#39;effetto di fosforilazione rimane facilmente rilevabile. Qui di seguito, descriveremo step-by-step procedure operative, e mostrano risultati rappresentativi di questi test. Discussione di alcuni dei pro e contro di ogni approccio, così come le potenziali applicazioni di screening di stupefacenti seguiranno. Ad una concentrazione elevata, tau aggregati in strutture amiloidi simili spontaneamente. Tuttavia, in laboratorio, tau fibrillization è tipicamente accelerato da tali induttori come eparina (peso molecolare medio, 6.000 g / mol) e acido arachidonico. Gli esempi riportati qui sono 30 micron eparina. La formazione di tau aggregati amiloidi è monitorata dalla fluorescenza risultante di legarsi da tioflavina T (ThT) o thioflavin S (ThS) amiloide. Al legame aggregati tau, ThT presenta uno spostamento rosso della fluorescenza (eccitazione: 450 nm; picco di emissione: 485 nm). ThS, d&#39;altra parte, ha debole emissione a 510 nm (eccitazione a 450 nm) prima dell&#39;associazione amiloide, ma questo fluorescence aumenta significativamente in presenza di una proteina amiloide come la tau aggregato 44. Entrambi i coloranti funzionano bene nel rilevare tau e P-tau aggregazione. A causa del picco forte e relativamente ampio emissione di ThT (vedi Figura 2), vi è solo il 30% di riduzione in unità di fluorescenza a 510 nm. Per comodità, usiamo la stessa combinazione di lunghezze d&#39;onda di eccitazione / emissione (ad esempio, 450 nm / 510 nm) per monitorare l&#39;aggregazione di tau quando si utilizza dye. Tau aggregazione può essere effettuata in presenza o assenza del colorante, a seconda dello scopo del dosaggio e la disponibilità di proteina tau. Entrambe le modalità di reazione sono riportati di seguito. Inoltre, abbiamo dimostrato il funzionamento di due strumenti diversi - un fluorimetro singolo campione (ISA-SPEX FluoroMax-2) e un lettore multidisco (SpectraMax M2). I lettori dovrebbero essere in grado di adattarsi questi protocolli per soddisfare le loro esigenze specifiche e la disponibilità dello strumento.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="449">
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:116px;">Name of the reagent</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:103px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:103px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:116px;">Trizma&#160;base</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">T1503</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:116px;">NaCl</td>
			<td style="width:128px;">Macron Fine Chemicals</td>
			<td style="width:103px;">MAL-7581-06</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:116px;">Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:103px;">15576-028</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:116px;">Thioflavin T</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">T3516</td>
			<td style="width:103px;">Stored in dark</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:116px;">Thioflavin S</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">T1892</td>
			<td style="width:103px;">Stored in dark</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:116px;">heparin</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">H3393</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:116px;">DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">D9779</td>
			<td style="width:103px;">Stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:116px;">96-well plate</td>
			<td style="width:128px;">Corning</td>
			<td style="width:103px;">3917</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:116px;">ISA SPEX FluoroMax-2</td>
			<td style="width:128px;">Horiba</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:116px;">SpectraMax M2 Multi-Mode Microlate Reader</td>
			<td style="width:128px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:116px;">Mouse Anti-Tau Monoclonal Antibody</td>
			<td style="width:128px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:103px;">MAB3494</td>
			<td style="width:103px;">Stored at &#8211;80&#176;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer's disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.

Utilizzando ricombinante tau e P-tau (Figura 1), abbiamo stabilito due protocolli per confrontare la cinetica di aggregazione di tau e P-tau, sfruttando la forte emissione di fluorescenza di ThT e ThS dal legame di amiloide aggregati proteici, compresi tau e p-tau (Figura 2). Con o senza colorante fluorescente nella reazione aggregazione, abbiamo osservato miglioramento consistente di aggregazione tau da hyperphosphorylation (figure 3-5). Questa stimolazione è indipend...

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In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Proteine ​​tau non modificate e iperfosforilata sono stati utilizzati in due metodiche di aggregazione in vitro per rivelare la cinetica di aggregazione veloce iperfosforilazione-dipendente. Questi test aprono la strada per schermi future per i composti che possono modulare la propensione di tau iperfosforilata a formare fibrille che sono alla base della progressione della malattia di Alzheimer.

In Vitro aggregazione Assays Utilizzando iperfosforilata Tau Protein

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

18.3K Views.  Michigan State University.  Proteine ​​tau non modificate e iperfosforilata sono stati utilizzati in due metodiche di aggregazione in vitro per rivelare la cinetica di aggregazione veloce iperfosforilazione-dipendente. Questi test aprono la strada per schermi future per i composti che possono modulare la propensione di tau iperfosforilata a formare fibrille che sono alla base della progressione della malattia di Alzheimer. 

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

La colorazione delle proteine ​​in gel con Coomassie G-250, senza solventi organici acido acetico e

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

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Biologia

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Utilizzando il sistema GELFREE 8100 Frazionamento per peso molecolare basata su Frazionamento con recupero della fase liquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Rapida rilevazione omogenea dei saggi biologici Utilizzando Magnetic biopercezione sistema di modulazione

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

Analisi di Schwann-astrociti Interazioni utilizzo In Vitro Saggi

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with good spatial and temporal resolution. Here we describe how to perform FRAP and FLIP assays of chromatin proteins, including H1 and HP1, in mouse embryonic stem (ES) cells. In a FRAP experiment, cells are transfected, either transiently or stably, with a protein of interest fused with the green fluorescent protein (GFP) or derivatives thereof (YFP, CFP, Cherry, etc.). In the transfected, fluorescing cells, an intense focused laser beam bleaches a relatively small region of interest (ROI). The laser wavelength is selected according to the fluorescent protein used for fusion. The laser light irreversibly bleaches the fluorescent signal of molecules in the ROI and, immediately following bleaching, the recovery of the fluorescent signal in the bleached area - mediated by the replacement of the bleached molecules with the unbleached molecules - is monitored using time lapse imaging. The generated fluorescence recovery curves provide information on the protein's mobility. If the fluorescent molecules are immobile, no fluorescence recovery will be observed. In a complementary approach, Fluorescence Loss in Photobleaching (FLIP), the laser beam bleaches the same spot repeatedly and the signal intensity is measured elsewhere in the fluorescing cell. FLIP experiments therefore measure signal decay rather than fluorescence recovery and are useful to determine protein mobility as well as protein shuttling between cellular compartments. Transient binding is a common property of chromatin-associated proteins. Although the major fraction of each chromatin protein is bound to chromatin at any given moment at steady state, the binding is transient and most chromatin proteins have a high turnover on chromatin, with a residence time in the order of seconds. These properties are crucial for generating high plasticity in genome expression1. Photobleaching experiments are therefore particularly useful to determine chromatin plasticity using GFP-fusion versions of chromatin structural proteins, especially in ES cells, where the dynamic exchange of chromatin proteins (including heterochromatin protein 1 (HP1), linker histone H1 and core histones) is higher than in differentiated cells2,3.

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

We describe photobleaching methods including Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) to monitor chromatin protein dynamics in embryonic stem (ES) cells. Chromatin protein dynamics, which is considered to be one of the means to study chromatin plasticity, is enhanced in pluripotent cells.

Fotodecolorazione saggi (FRAP e FLIP) per misurare la dinamica delle proteine ​​della cromatina in Living cellule staminali embrionali

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D Imaging di aggregazione proteica in cellule vive

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Saggi accoppiati per il monitoraggio delle proteine ​​in ripiegamento<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

Nella migrazione delle cellule in vitro e saggi Invasion

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

In vitro metilazione Assay per studiare proteine ​​Arginina Metilazione

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-base Espressione Proiezione di proteine ​​di membrana in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...