これらのプロトコルの多くの改善への貢献のために明ミン·リー、キャスリンPlichta、ビクトリアミランダ·トンプソンとサム·キュッキム：著者は、在庫ラボの過去のメンバーに感謝したい。この作品は、SP株に国立科学財団の助成金IOS-0840932およびIOS-0724978によって部分的に資金を供給された

彼らのSymboitic細菌と昆虫病原線虫の1。 インビボ飼育<ol><li> 100×15ミリメートルのプラスチックシャーレを反転し、皿のふたにろ紙（90ミリメートル）の2つのディスクを配置します。 </li><li>均等に濾紙上（1,000〜2,000 IJ / mlの濃度で）IJ（感染少年）水懸濁液1mlを分配する。 注：IJSは表面殺菌する必要はありません。 </li><li>皿に大きなwaxmothのハチノスツヅリガの10終齢幼虫を追加します。目標は、約100〜200 IJS /幼虫を提供することにある。 </li><li>ペトリ皿（ 図1）の底部とふたをカバーし、ペトリ皿にラベルを付ける。以下の情報に言及：線虫種名（既知の場合）;コー​​ド/指定を隔離する。日付感染トラップが設定されました。 </li><li> （水分を節約するために）緩く密封されたビニール袋の中に皿を置き、どちら室温または20〜25℃の間のインキュベーター内で暗所に保管してください。毎日の料理をチェックする 注：それは土壌中に自然感染状態を模倣として闇は、線虫の感染を容易にします。 </li><li> 3〜5日後に、変更されたホワイトトラップ7への線虫感染の兆候で死体を取り除く。 注：死体が腐敗の臭い場合、これは培養が成功しなかった、および/または汚染があったことを示す可能性があります。線虫および昆虫の新しいバッチで新しい感染室を設定します。 </li></ol>彼らの共生細菌を持つ昆虫病原線虫の2 のin vitro飼育<ol><li>肝臓、腎臓天法9,19 <ol><li>小片（2 cm 3程度以下）に肝臓と腎臓をみじん切りにし、NaCl、寒天と水300mlでブレンダーに入れ、肉が液体パルプ、濃厚なペーストやピューレになるまでブレンドする。その後、1 Lの三角フラスコに移し、混合物。 </li><li>ブレンダー容器に水の最終200ミリリットルを加え、中に残っているメディアをデカント三角フラスコ。 121°Cで15分間オートクレーブ。許可オートクレーブ後の寒天注ぐ前に触れて冷却する。 注：この培地は、肉の塊を持っている傾向があるため、媒体のピペッティングは推奨されません。 </li><li>手の攪拌または間の三角フラスコを旋回がより均質なメディアに注ぐながら5（または6）cmのペトリ皿に寒天〜20ミリリットルを注ぐ。必要になるまで寒天は4℃で固化し、店の食器を許可する 注：ペトリ皿に注ぎ、肉のいずれかの大きな塊を破壊する火炎滅菌金属スパチュラを使用してください。 </li></ol></li><li>脂質天法9,19 <ol><li>栄養ブロス、寒天及び酵母エキスを一緒に混合することにより、脂質寒天培地を準備し、2リットルの三角フラスコに混ぜ注ぐ。 121℃で15分間、H 2 OおよびMgCl 2•6H 2 O、オートクレーブ蒸留追加。 </li><li>コー​​ン油、コーンシロップミックスの無菌ミックスを加え、攪拌または均等に油滴を分散させるために積極的かつ頻繁に渦巻く。 <br/&gt;注：UVクロスリンカーに必要な容積を配置することによって、コーン油及びシロップを滅菌する。オイルが液体に溶解するが、それは小さな液滴中にあることを確認することはありません。 </li><li> 5（または6）cmのペトリ皿上に〜20ミリリットル寒天を注ぎ、必要になるまで寒天4℃で固化し、店の料理をすることができます。 </li><li>ストリークは、脂質寒天プレートに共生細菌を希望し、24〜48時間、28℃でプレートをインキュベートする。 注：一晩（12-16時間）のLBサブカルチャーの100〜200μlのスプレッド。 </li><li>翌日は、約0.4ミリリットル表面殺菌し、線虫懸濁液（卵や感染少年）のを追加し、暗いまたは22±3℃のインキュベーター内で、室温でプレートをインキュベートする。 注：それは、線虫の成長に好ましくない過度に湿潤環境を作成することができますように線虫懸濁液を超える0.4ミリリットルを追加しないでください。 </li><li>毎日文化を監視します。培養物は、約12日間（ 図2）にIJSの新世代を生成する必要があります。</li><li>線虫が変更ホワイトトラップにディッシュ（ 図3A）の側面をクロール見ているときIJS（ 図3B）を収穫する（オロスコら 12参照）寒天でボトムディッシュを転送します。メディアの汚染を減らすために、層流フードの下に、この手順を実行します。 </li><li>出現時に変更されたホワイトトラップからIJSを収集し、あらゆる媒体破片を除去するIJサスペンションをすすぐ。ストア（コールド温度インキュベーターまたは低温室）で10℃での滅菌蒸留水にIJまたは必要に応じてすぐに使用しています。 注：研究の目的に応じて、シンビオント·保菌またはaposymbiotic線虫のいずれかでプレートをシード。 </li></ol></li></ol> 3 インビトロ Aposymbioticの飼育（共生フリー）昆虫病原線虫<ol><li> 10-20 G.に感染希望線虫種のIJSとmellonella幼虫 （セクション1を参照）。 3または4日後（この時点でIJSは成熟しているはず第一世代の成人に）死体を収集します。 注：卵の適切な数を得るために必要な雌の成熟度と数に時間が種によって異なります。より多くのGを感染させるmellonella幼虫必要であれば、彼らは右の発達段階にあるかどうかを評価するために、早ければ48時間後に感染症などの解剖を開始します。 </li><li>生理食塩水（M9バッファ18）とのペトリ皿に個別に死体を置きます。先端の細い鉗子で頭を引いて、死体を解剖。 </li><li>細い針（好ましくはL字型）で、少なくとも20（内側卵）妊娠、女性を集め、M9バッファー（ 図4A）の10ミリリットルを含む時計皿に置いてください。 </li><li>以下の成分を考慮してaxenizing溶液を調製：蒸留水6.75ミリリットル、1.25ミリリットル5NのNaOH、および2.25ミリリットルの市販の漂白剤溶液を3％の次亜塩素酸を希釈した。 注：NaOHを塩基性溶液、手袋、ゴーグルや他の適切な保護である衣服は着用してください。 注：漂白剤は、光の中で分解する、新鮮なaxenizing液を毎回準備します。 axenizing液のいくつかのバッチを用意し、複数の時計皿に卵の表面殺菌や収穫を行う。 </li><li> M9バッファは緩衝液で時計皿を充填し、ピペットを用いてバッファを吸い取って、女性には少なくとも3回洗浄します。女性は時計皿に残っていることを確認します。このステップをさらに2回繰り返します。 </li><li>すぐにaxenizingソリューションを追加し、女性は10〜15分を超えないために、この溶液中に残存することができます。 （axenizing液に抵抗性である）卵は無傷のままでいる間に崩壊し始めて線虫の組織を観察します。 </li><li>手動で針またはメス（ 図4B、C）でそれらを切断することによって、プロセスをスピードアップするために女性の身体を破壊する。未溶解組織を加える避け、1.5mlのマイクロチューブにそれらをピペッティングすることにより、卵を除去します。 注：Mとして使用卵を収集し、卵の生存能力として、迅速に作業するために、必要に応じて、任意のマイクロチューブはaxenizing溶液への曝露の長期間にわたって減少します。 </li><li> 「高速設定」を使用して15秒間ボルテックスチューブは、更に、卵に付着線虫組織を除去した。別の方法として、渦が利用できない場合、解決策を上下にピペットを数回。 </li><li>で約18000グラムで2分間の遠心分離によってペレット卵。卵は十分にペレットされない場合は速度を上げてください。 axenizing液を取り出し、1分間900×gで滅菌蒸留水と遠心機1のより多くの時間をマイクロチューブに充填することにより二回すすいでください。 </li><li>最後の洗浄後、滅菌蒸留水300〜500μlの卵を再懸濁し、滅菌3センチメートルペトリ皿または滅菌時計皿に置いてください。卵は今表面殺菌であることを忘れないでください、そう卵の清浄度を維持するために、滅菌ピペットおよび/またはpippetterのヒントや水を使用しています。 </li><li>彼らは（ 図4D）は無傷であることを確認するために解剖顕微鏡（30-50X倍率）の下で卵を調べ、肝臓、腎臓寒天と5cmのプレートに移す（セクション2.1を参照） 注：それは寒天が過度に濡れになりますので、プレート上の卵の懸濁液の400以上のμLを追加しないでください。 </li><li>適切な情報をラベルプレート、28℃の暗所で直立に格納します。卵の孵化することは明白で、一晩でなければなりません。 注：水は皿の蓋の上に凝縮することがありますが、それは1日または2日後に蒸発する。この時、寒天の水分を保持し、その乾燥を避けるために、ビニール袋に皿を置く。 </li><li>定期的に料理を守り、真菌や細菌汚染の兆候を示すあらゆる料理を捨てる。 IJSがペトリ皿の壁を移行見たら、ふたを取り外して、修正されたホワイトトラップ12に寒天でボトムディッシュを転送します。 modifieに皿を転送する際に、無菌状態を考慮してくださいdはホワイトトラップが露出メディアの汚染を回避する。 </li><li>必要に応じてホワイトトラップと収穫IJの​​監視を続けます。 注：Aposymbiotic線虫は何日あっても数週間ホワイトトラップの水の中に移動していきます。 </li></ol>

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	<li>Akhurst, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+functional+dimorphism+in+Xenorhabdus+spp.,+bacteria+symbiotically+associated+with+the+insect+pathogenic+nematodes,+Neoaplectana+and+Heterorhabditis.">Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus spp., bacteria symbiotically associated with the insect pathogenic nematodes, Neoaplectana and Heterorhabditis.</a> J. Gen. Microbiol. 121, 303-309 (1980).</li><li>Dunphy, G. B., Webster, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+monoxenic+culture+of+Neoaplectana+carpocapsae+DD+136+and+Heterorhabditis+heliothidis.">The monoxenic culture of Neoaplectana carpocapsae DD 136 and Heterorhabditis heliothidis.</a> Revue Nematol. 12, 113-123 (1989).</li><li>Boemare, N., Gaugler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology,+taxonomy+and+systematics+of+Photorhabdus+and+Xenorhabdus.">Biology, taxonomy and systematics of Photorhabdus and Xenorhabdus.</a> Entomopathogenic Nematology. , (2002).</li><li>Boemare, N. E., Akhurst, R. A., Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K. -. H., Stackebrandt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genera+Photorhabdus+and+Xenorhabdus.">The Genera Photorhabdus and Xenorhabdus.</a> The Prokaryotes. , 473-488 (2002).</li><li>Ehlers, R. U., Wulff, A., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenicity+of+axenic+Steinernema+feltiae.+Xenorhabdus+bovienii.+and+the+bacto-helminthic+complex+to+larvae+of+Tipula+oleracea+(Diptera)+and+Galleria+mellonella+(Lepidoptera).">Pathogenicity of axenic Steinernema feltiae. Xenorhabdus bovienii. and the bacto-helminthic complex to larvae of Tipula oleracea (Diptera) and Galleria mellonella (Lepidoptera).</a> Journal Invertebrate Pathology. 69, 212-217 (1997).</li><li>Gaugler, R., Kaya, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Entomopathogenic Nematodes in Biological Control. Boca. , (1990).</li><li>Heungens, K., Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Xenorhabdus+nematophila+genes+required+for+mutualistic+colonization+of+Steinernema+carpocapsae+nematodes.">Identification of Xenorhabdus nematophila genes required for mutualistic colonization of Steinernema carpocapsae nematodes.</a> Molecular Microbiology. 45, 1337-1353 (2002).</li><li>Kaya, H. K., Gaugler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entomopathogenic+nematodes.">Entomopathogenic nematodes.</a> Annual Review of Entomology. 38, 181-206 (1993).</li><li>Kaya, H. K., Stock, S. P., Lackey, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+in+insect+nematology.">Techniques in insect nematology.</a> Manual of techniques in insect pathology. , 281-324 (1997).</li><li>Koppenh&#246;fer, H., Nguyen, K. B., Hunt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Symbionts+of+Steinernema+and+Heterorhabditis.">Bacterial Symbionts of Steinernema and Heterorhabditis.</a> Entomopathogenic Nematodes: Systematics, Phylogeny and Bacterial Symbionts. , 735-759 (2007).</li><li>Lunau, S., Stoessel, S., Schmidt Peisker, A. J., Ehlers, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+monoxenic+inocula+for+scaling+up+in+vitro+cultures+of+the+entomopathogenic+nematodes+Steinernema+spp+and+Heterorhabditis+spp.">Establishment of monoxenic inocula for scaling up in vitro cultures of the entomopathogenic nematodes Steinernema spp and Heterorhabditis spp.</a> Nematologica. 39, 385-399 (1993).</li><li>Orozco, R. A., Lee, M., Stock, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soil+sampling+and+isolation+of+entomopathogenic+nematodes+(Steinernematidae,+Heterorhabditidae).">Soil sampling and isolation of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae).</a> J. Vis. Exp. (89), (2014).</li><li>Poinar, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presence+of+Achromobacter+nematophilus+in+the+infective+stage+of+a+Neoaplectana+sp+(Steinernematidae:+Nematoda).">The presence of Achromobacter nematophilus in the infective stage of a Neoaplectana sp (Steinernematidae: Nematoda).</a> Nematologica. 12, 105-108 (1966).</li><li>Poinar, G. O., Thomas, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+Achromobacter+nematophilus+sp.+nov.+(Achromobacteriaceae:+Eubacteriales)+associated+with+a+nematode.">Significance of Achromobacter nematophilus sp. nov. (Achromobacteriaceae: Eubacteriales) associated with a nematode.</a> Int. Bull. Bacteriol. Nomencl. Taxon. 15, 249-252 (1966).</li><li>Sicard, M., Brugirard-Ricaud, K., Pag&#232;s, S., Lanois, A., Boemare, N. E., Breh&#233;li, M., Givaudan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+infection+during+the+tripartite+interaction+between+Xenorhabdus+nematophila,+its+nematode+vector,+and+insect+hosts.">Stages of infection during the tripartite interaction between Xenorhabdus nematophila, its nematode vector, and insect hosts.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 6473-6480 (2004).</li><li>Sicard, M., Hinsinger, J., LeBrun, N., Pag&#232;s, S., Boemare, N., Moulia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecific+competition+between+entomopathogenic+nematodes+(Steinernema)+is+modified+by+their+bacterial+symbionts+(Xenorhabdus).">Interspecific competition between entomopathogenic nematodes (Steinernema) is modified by their bacterial symbionts (Xenorhabdus).</a> BMC Evolutionary Biology. 6, 68-78 (2006).</li><li>Snyder, H., Stock, S. P., Kim, S. K., Flores-Lara, Y., Forst, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+colonization+and+release+processes+of+Xenorhabdus+nematophila+and+the+morphology+and+ultrastructure+of+the+bacterial+receptacle+of+its+nematode+host,+Steinernema+carpocapsae.">New insights into the colonization and release processes of Xenorhabdus nematophila and the morphology and ultrastructure of the bacterial receptacle of its nematode host, Steinernema carpocapsae.</a> Applied and environmental microbiology. 73, 5338-5346 (2007).</li><li>Stiernagle, T., ed, C. .. e. l. e. g. a. n. s. .. W. o. r. m. B. o. o. k. .. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Stock, S. P., Goodrich-Blair, H., Lacey, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nematode+parasites,+pathogens+and+associated+of+insects+and+invertebrates+of+economic+importance.">Nematode parasites, pathogens and associated of insects and invertebrates of economic importance.</a> Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , 373-426 (2012).</li></ol>

利害関係が宣言されていない。

適当な宿主を使用すると、EPNの生体内で飼育することに成功するための重要な要因である。通常、両方steinernematidsとheterorhabditidsを再現することができますし、正常に高いワックス蛾、 ハチノスツヅリガ （鱗翅目：メイガ）の幼虫で、そのライフサイクルを完了。しかし、異なるファミリーおよび/または指図から他の昆虫種が考えられる。現在記載され線虫種のいくつか...

昆虫病原性線虫（EPN）SteinernemaとHeterorhabditis属 。 （Steinernematidae、Heterorhabditidae）とそれらの細菌の共生、XenorhabdusとのPhotorhabdus属（腸内細菌）が陸生動物-微生物共生関係2-4,6,10,19。XenorhabdusとのPhotorhabdus属の創発モデルと考えられている。また、感染性若年性（IJ）として知られている線虫の唯一の自由生活段階、または第3段階感染幼若8,10,13の腸内に共生として保有されている。細菌線虫ペアは昆虫の広い範囲の病原性であり、成功裏に6,8、世界中の生物学的制御と統合された害虫管理プログラムに実装されています。 ここで私たちは、生体内で 、頻繁に実験室条件下でEPNの飼育のために行使されたインビトロ技術での選択を示している。 私をnは、生体内の方法は、線虫の飼育用の昆虫宿主を企図している。通常、さまざまな昆虫の受注（ すなわち鱗翅目 、 甲虫目 、 双翅目 、 等 ）の未成熟な段階は、適切なホストとみなされます。メソッドは、通常、実験室での線虫の培養物の維持のために考慮されるインビボ 。線虫の量産を考慮した場合、この方法は適切でないかもしれない。昆虫宿主の大量のは、より多くの時間と昆虫飼育に関連する追加費用を要求して、この目的のために必要な場合があります。 昆虫病原性線虫には、いくつかのメディアに対してインビトロで培養することができる。研究の目的に応じて、 インビトロ法で 、またはメディア内共生細菌の混入を考慮することができる。この発表では、EPNの伝播のための2つの一般的に使用される方法が記載されている。培地の成分は、共生細菌aの栄養素の供給源を提供ND線虫用のステロール源。 インビトロ法は、昆虫宿主なしで優位にEPNの飼育を提供します。 適切な昆虫宿主が利用できない場合、もともと開発されたインビトロでのメディアの多くは、EPNの乗算のために使用した。しかし、過去数年間にわたり、in vitroでの飼育方法が広くEPNとその共生細菌17,19間の共生関係を理解することを目指して研究に採用になっている。 このプレゼンテーションで詳述技術は、さまざまな著者によって記載され、証券研究所、アリゾナ大学（ツーソン、アリゾナ州、米国）によって洗練ものに対応する。これらの技術は、害虫管理の目的のためにこれらの生物の大量生産に使用される技法の本体から区別される。

<table><tbody><tr><td colspan="4">For &lt;em&gt;In vivo&lt;/em&gt; Infections</td></tr><tr><td>100 x 15 Petri dishes</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper, 9 cm grade 1 cellulose</td><td>Whatman/VWR</td><td>28450-081</td><td>Grade 1 filter paper recommended</td></tr><tr><td>Insect hosts</td><td>Timberline</td><td>http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG</td><td>&lt;em&gt;Galleria mellonella&lt;/em&gt; are recommended</td></tr><tr><td colspan="4">For Liver-kidney Agar (for 500 ml)</td></tr><tr><td>60 x 15 mm Petri dishes</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>Beef liver, 50 g</td><td>Locally sourced; butcher or supermarket</td><td></td><td>Remaining may be stored frozen and thawed for future use</td></tr><tr><td>Beef kidney, 50 g</td><td>Locally sourced; butcher or supermarket</td><td></td><td>Remaining may be stored frozen and thawed for future use</td></tr><tr><td>Sodium chloride 2.5 g (0.5% final concentration)</td><td>Acros/VWR</td><td>200002-434</td><td>any research grade NaCl can be used</td></tr><tr><td>Agar, 7.5 g (1.5% agar, final concentration)</td><td>HiMedia/VWR</td><td>95026-642</td><td>any media grade agar can be used</td></tr><tr><td>500 ml distilled H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">For Lipid Agar (for 1 L)</td></tr><tr><td>100 x 15 Petri dishes</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>Nutrient broth, 8 g</td><td>BD/VWR</td><td>90002-660</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract, 5 g</td><td>EMD/VWR</td><td>EM1.03753.0500</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate 10 ml (0.2 g/ml)</td><td>EMD/VWR</td><td>EM-MX0045-1</td><td></td></tr><tr><td>Corn oil, 4 ml</td><td>Any brand</td><td>Locally source; supermarket</td><td>Any brand of corn oil can be used</td></tr><tr><td>Corn syrup, 96 ml combine 7 ml corn syrup in 89 ml heated H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O and swirl for homogeneity</td><td>Karo</td><td>Locally sourced; supermarket</td><td></td></tr><tr><td>Agar, 15 g</td><td>HiMedia/VWR</td><td>95026-642</td><td>any media grade agar can be used</td></tr><tr><td>Distilled H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 890 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo and in vitro rearing of entomopathogenic nematodes (steinernematidae and heterorhabditidae)

昆虫病原性線虫（EPN）（SteinernematidaeとHeterorhabditidae）は 、腸内細菌科にグラム陰性ガンマプロテオバクテリアと共生のパートナーシップを持っている。 フォトルハブダスは heterorhabditidsの共生している間Xenorhabdus細菌がsteinernematids線虫に関連付けられています。一緒線虫や細菌は親密で、特定の提携で昆虫種の広い範囲を殺す強力な殺虫複合体を形成する。ここで、私たちは、生体内で 、一般に実験室条件下で、これらの線虫の飼育に使用されるインビトロ技術で実証している。さらに、これらの技術は、EPN培養の確立に成功するための重要なステップを表し、また、研究のために、これらの生物を利用する他のバイオアッセイの基礎を形成する。 aposymbiotic（シンビオントフリー）線虫の生産は、多くの場合、深いと共生の研究に多面的なアプローチのために重要である。このプロトコルは、抗生物質の添加を必要とせず、標準的な実験装置を用いて短時間で行うことができる。貯蔵におけるそれらの生存が使用される種に依存して変化し得るが、このようにして製造線虫は、比較的ロバストである。このプレゼンテーションで詳述技術は、P株価の研究所、アリゾナ大学（ツーソン、アリゾナ州、米国）により、さまざまな著者によって記載され、洗練されたものに対応する。これらの技術は、害虫管理の目的のためにこれらの生物の大量生産に使用される技法の本体から区別される。

in vivoでの飼育方法は、線虫の成長と再生のための宿主としてのライブ昆虫を使用しています。感染室は昆虫のIJSを露出させるための効率的な方法である。これは別の昆虫宿主から細菌共生ベクトル線虫のライフサイクルにおける唯一のステージである。1は感染室だけでなく、このチャンバーを構築するために必要な材料のために設定示しています。 イン?...

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In vivo and In vitro Rearing of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae and Heterorhabditidae

このプレゼンテーションの目的は、 生体内および昆虫病原性線虫の飼育のためのインビトロ技術に実証することである。 インビトロ法は、リッチ寒天培地を利用し、一方、 インビボの方法は、昆虫宿主でこれらの線虫の飼育を考えてみましょう。

in vivoおよび昆虫病原線虫の体外飼育には（SteinernematidaeとHeterorhabditidae）

Entomopathogenic nematodes (EPN) (Steinernematidae and Heterorhabditidae) have a mutualistic partnership with Gram-negative Gamma-Proteobacteria in the ...

in-vivo-vitro-rearing-entomopathogenic-nematodes-steinernematidae

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vivo and In vitro Rearing of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae)

20.4K ビュー.  University of Arizona. このプレゼンテーションの目的は、 生体内および昆虫病原性線虫の飼育のためのインビトロ技術に実証することである。 インビトロ法は、リッチ寒天培地を利用し、一方、 インビボの方法は、昆虫宿主でこれらの線虫の飼育を考えてみましょう。 

ビデオ: In vivo and In vitro Rearing of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae and Heterorhabditidae

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to two families: Steinernematidae and Heterorhabditidae. Until now, more than 70 species have been described in the Steinernematidae and there are about 20 species in the Heterorhabditidae. The nematodes have a mutualistic partnership with Enterobacteriaceae bacteria and together they act as a potent insecticidal complex that kills a wide range of insect species.
Herein, we focus on the most common techniques considered for collecting EPN from soil. The second part of this presentation focuses on the insect-baiting technique, a widely used approach for the isolation of EPN from soil samples, and the modified White trap technique which is used for the recovery of these nematodes from infected insects. These methods and techniques are key steps for the successful establishment of EPN cultures in the laboratory and also form the basis for other bioassays that consider these nematodes as model organisms for research in other biological disciplines. The techniques shown in this presentation correspond to those performed and/or designed by members of S. P. Stock laboratory as well as those described by various authors.

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae, Heterorhabditidae

Entomopathogenic nematodes are soil-inhabiting roundworms that parasitize a wide range of insects. We demonstrate sampling methods used for the isolation of these nematodes from the soil using two techniques: the insect baiting and the modified White trap, for the recovery of nematodes from soil samples and infected insect cadavers, respectively.

土壌のサンプリングと昆虫病原線虫の分離（Steine​​rnematidae、Heterorhabditidae）

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to ...

環境学

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the intestine the primary location for disease. The nematode intestine structurally and functionally mimics mammalian intestines and is transparent making it amenable to microscopic study of colonization. Here we show that pathogens can cause disease and death. We are able to identify microbial mutants that show altered virulence. Its conserved innate response to biotic stresses makes C. elegans an excellent system to probe facets of host innate immune interactions. We show that hosts with mutations in the dual oxidase gene cannot produce reactive oxygen species and are unable to resist microbial insult. We further demonstrate the versatility of the presented survival assay by showing that it can be used to study the effects of inhibitors of microbial growth. This assay may also be used to discover fungal virulence factors as targets for the development of novel antifungal agents, as well as provide an opportunity to further uncover host-microbe interactions. The design of this assay lends itself well to high throughput whole-genome screens, while the ability to cryo-preserve worms for future use makes it a cost-effective and attractive whole animal model to study.

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Here, we present the nematode Caenorhabditis elegans as a versatile host model to study microbial interaction.

線虫の宿主微生物間相互作用を研究する多彩なIn Vivoモデル

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

遺伝学

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

Root-knot nematodes (genus Meloidogyne) are obligate plant parasites. They are extremely polyphagous and considered one of the most economically important plant parasitic nematodes. The microscopic second-stage juvenile (J2), molted once in the egg, is the infective stage. The J2s hatch from the eggs, move freely in the soil within a film of water, and locate root tips of suitable plant species. After penetrating the plant root, they migrate towards the vascular cylinder where they establish a feeding site and initiate feeding using their stylets. The multicellular feeding site is comprised of several enlarged multinuclear cells called 'giant cells' which are formed from cells that underwent karyokinesis (repeated mitosis) without cytokinesis. Neighboring pericycle cells divide and enlarge in size giving rise to a typical gall or root knot, the characteristic symptom of root-knot nematode infection. Once feeding is initiated, J2s become sedentary and undergo three additional molts to become adults. The adult female lays 150-250 eggs in a gelatinous matrix on or below the surface of the root. From the eggs new infective J2s hatch and start a new cycle. The root-knot nematode life cycle is completed in 4-6 weeks at 26-28&deg;C.
Here we present the traditional protocol to infect plants, grown in pots, with root-knot nematodes and two methods for high-throughput assays. The first high-throughput method is used for plants with small seeds such as tomato while the second is for plants with large seeds such as cowpea and common bean. Large seeds support extended seedling growth with minimal nutrient supplement. The first high throughput assay utilizes seedlings grown in sand in trays while in the second assay plants are grown in pouches in the absence of soil. The seedling growth pouch is made of a 15.5 x 12.5cm paper wick, folded at the top to form a 2-cm-deep trough in which the seed or seedling is placed. The paper wick is contained inside a transparent plastic pouch. These growth pouches allow direct observation of nematode infection symptoms, galling of roots and egg mass production, under the surface of a transparent pouch. Both methods allow the use of the screened plants, after phenotyping, for crossing or seed production. An additional advantage of the use of growth pouches is the small space requirement because pouches are stored in plastic hanging folders arranged in racks.

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

Two distinct methods to screen plants with root-knot nematodes are described. The described approaches include high-throughput screens with nematodes in a nondestructive manner facilitating the use of these plants in breeding programs.

根こぶ線虫、高および低スループット画面サツマイモ属。</em

Root-knot nematodes (genus Meloidogyne) are obligate plant parasites. They are extremely polyphagous and considered one of the most economically important ...

免疫・感染学

Rapid Isolation of Wild Nematodes by Baermann Funnel

Beyond being robust experimental model organisms, Caenorhabditis elegans and its relatives are also real animals that live in nature. Studies of wild nematodes in their natural environments are valuable for understanding many aspects of biology, including the selective regimes in which distinctive genomic and phenotypic characters evolve, the genetic basis for complex trait variation, and the natural genetic diversity fundamental to all animal populations. This manuscript describes a simple and efficient method for extracting nematodes from their natural substrates, including rotting fruits, flowers, fungi, leaf litter, and soil. The Baermann funnel method, a classical nematology technique, selectively isolates active nematodes from their substrates. Because it recovers nearly all active worms from the sample, the Baermann funnel technique allows for the recovery of rare and slow-growing genotypes that co-occur with abundant and fast-growing genotypes, which might be missed in extraction methods that involve multiple generations of reproduction. The technique is also well suited to addressing metagenetic, population-genetic, and ecological questions. It captures the entire population in a sample simultaneously, allowing an unbiased view of the natural distribution of ages, sexes, and genotypes. The protocol allows for deployment at scale in the field, rapidly converting substrates into worm plates, and the authors have validated it through fieldwork on multiple continents.

This protocol outlines a method for efficiently extracting live nematodes from natural substrates in the field.

ベアマン・ファネルによる野生の線虫の迅速な分離

Beyond being robust experimental model organisms, Caenorhabditis elegans and its relatives are also real animals that live in nature. Studies of wild ...

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on earth, nematodes and bacteria form a wide array of symbiotic associations that range from beneficial to pathogenic 1-3. One such association is the mutually beneficial relationship between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, which has emerged as a model system of symbiosis 4. Steinernema nematodes are entomopathogenic, using their bacterial symbiont to kill insects 5. For transmission between insect hosts, the bacteria colonize the intestine of the nematode's infective juvenile stage 6-8. Recently, several other nematode species have been shown to utilize bacteria to kill insects 9-13, and investigations have begun examining the interactions between the nematodes and bacteria in these systems 9.
We describe a method for visualization of a bacterial symbiont within or on a nematode host, taking advantage of the optical transparency of nematodes when viewed by microscopy. The bacteria are engineered to express a fluorescent protein, allowing their visualization by fluorescence microscopy. Many plasmids are available that carry genes encoding proteins that fluoresce at different wavelengths (i.e. green or red), and conjugation of plasmids from a donor Escherichia coli strain into a recipient bacterial symbiont is successful for a broad range of bacteria. The methods described were developed to investigate the association between Steinernema carpocapsae and Xenorhabdus nematophila 14. Similar methods have been used to investigate other nematode-bacterium associations 9,15-18and the approach therefore is generally applicable.
The method allows characterization of bacterial presence and localization within nematodes at different stages of development, providing insights into the nature of the association and the process of colonization 14,16,19. Microscopic analysis reveals both colonization frequency within a population and localization of bacteria to host tissues 14,16,19-21. This is an advantage over other methods of monitoring bacteria within nematode populations, such as sonication 22or grinding 23, which can provide average levels of colonization, but may not, for example, discriminate populations with a high frequency of low symbiont loads from populations with a low frequency of high symbiont loads. Discriminating the frequency and load of colonizing bacteria can be especially important when screening or characterizing bacterial mutants for colonization phenotypes 21,24. Indeed, fluorescence microscopy has been used in high throughput screening of bacterial mutants for defects in colonization 17,18, and is less laborious than other methods, including sonication 22,25-27and individual nematode dissection 28,29.

To study the mutualism between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, methods were developed to monitor bacterial presence and location within nematodes. The experimental approach, which can be applied to other systems, entails engineering bacteria to express the green fluorescent protein and visualizing, using fluorescence microscopy bacteria within the transparent nematode.

蛍光顕微鏡を用いて線虫の中の細菌の可視化

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

生物学

Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria

Caenorhabditis elegans (C. elegans)&#160;has proven to be an excellent model for studying host-microbe interactions and the microbiome, especially in the context of the intestines. Recently, ecological sampling of wild Caenorhabditis nematodes has discovered a diverse array of associated microbes, including bacteria, viruses, fungi, and microsporidia. Many of these microbes have interesting colonization or infection phenotypes that warrant further study, but they are often unculturable. This protocol presents a method to enrich the desired intestinal microbes in C. elegans and related nematodes and reduce the presence of the many contaminating microbes adhering to the cuticle. This protocol involves forcing animals into the dauer stage of development and using a series of antibiotic and detergent washes to remove external contamination. As dauer animals have physiological changes that protect nematodes from harsh environmental conditions, any intestinal microbes will be protected from these conditions. But, for enrichment to work, the microbe of interest must be maintained when animals develop into dauers. When the animals leave the dauer stage, they are singly propagated into individual lines. F1 populations are then selected for desired microbes or infection phenotypes and against visible contamination. These methods will allow researchers to enrich unculturable microbes in the intestinal lumen, which make up part of the natural microbiome of C. elegans and intracellular intestinal pathogens. These microbes can then be studied for colonization or infection phenotypes and their effects on the host fitness.

Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria

Wild Caenorhabditis nematodes are associated with many microbes, often in the gut lumen or infecting the intestine. This protocol details a method to enrich unculturable microbes colonizing the intestine, taking advantage of the resistance of the dauer cuticle.

腸内微生物叢細菌を濃縮する野生の カエノアハブディティス 線虫の選択的洗浄

Caenorhabditis elegans (C. elegans)&#160;has proven to be an excellent model for studying host-microbe interactions and the microbiome, especially in the ...

Culturing and Genetically Manipulating Entomopathogenic Nematodes

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic of their life cycle is the mutualistic association with the bacteria Photorhabdus and Xenorhabdus, respectively. The nematode parasites are able to locate and enter suitable insect hosts, subvert the insect immune response, and multiply efficiently to produce the next generation that will actively hunt new insect prey to infect. Due to the properties of their life cycle, entomopathogenic nematodes are popular biological control agents, which are used in combination with insecticides to control destructive agricultural insect pests. Simultaneously, these parasitic nematodes represent a research tool to analyze nematode pathogenicity and host anti-nematode responses. This research is aided by the recent development of genetic techniques and transcriptomic approaches for understanding the role of nematode secreted molecules during infection. Here, a detailed protocol on maintaining entomopathogenic nematodes and using a gene knockdown procedure is provided. These methodologies further promote the functional characterization of entomopathogenic nematode infection factors.

Entomopathogenic nematodes live in symbiosis with bacteria and together they successfully infect insects by undermining their innate immune system. To promote research on the genetic basis of nematode infection, methods for maintaining and genetically manipulating entomopathogenic nematodes are described.

昆虫病原性線虫の培養と遺伝子操作

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic ...

Isolation and Selection of Entomopathogenic Fungi from Soil Samples and Evaluation of Fungal Virulence against Insect Pests

Entomopathogenic fungi (EPF) are one of the microbial control agents for integrated pest management. To control local or invasive pests, it is important to isolate and select indigenous EPF. Therefore, the soil bait method combined with the insect bait (mealworm, Tenebrio molitor) system was used in this study with some modifications. The isolated EPF were then subjected to the virulence test against the agricultural pest Spodoptera litura. Furthermore, the potential EPF strains were subjected to morphological and molecular identifications. In addition, the conidia production and thermotolerance assay were performed for the promising EPF strains and compared; these data were further substituted into the formula of effective conidia number (ECN) for laboratory ranking. The soil bait-mealworm system and the ECN formula can be improved by replacing insect species and integrating more stress factors for the evaluation of commercialization and field application. This protocol provides a quick and efficient approach for EPF selection and will improve the research on biological control agents.

Here we present a protocol based on the&#160;mealworm (Tenebrio molitor)-bait system that was used for isolating and selecting entomopathogenic fungi (EPF) from soil samples. An effective conidia number (ECN) formula is used to select high stress tolerant EPF based on physiological characteristics for pest microbial control in the field.

土壌サンプルからの病原性真菌の単離と選択と昆虫害虫に対する真菌性毒性の評価

Entomopathogenic fungi (EPF) are one of the microbial control agents for integrated pest management. To control local or invasive pests, it is important ...

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant matter, especially rotten fruits like apples or on compost heaps. It is also associated with certain invertebrate hosts such as slugs and woodlice. These habitats are rich in microbes, which serve as food for C. elegans and which can also persistently colonize the nematode gut. To date, the exact diversity and consistency of the native C. elegans microbiota across habitats and geographic locations is not fully understood. Here, we describe a suitable approach for isolating C. elegans from nature and characterizing the microbiota of worms. Nematodes can be easily isolated from compost material, rotting apples, slugs, or attracted by placing apples on compost heaps. The prime time for finding C. elegans in the Northern Hemisphere is from September until November. Worms can be washed out of collected substrate material by immersing the substrate in buffer solution, followed by the collection of nematodes and their transfer onto nematode growth medium or PCR buffer for subsequent analysis. We further illustrate how the samples can be used to isolate and purify the worm-associated microorganisms and to process worms for 16S ribosomal RNA analysis of microbiota community composition. Overall, the described methods may stimulate new research on the characterization of the C. elegans microbiota across habitats and geographic locations, thereby helping to obtain a comprehensive understanding of the diversity and stability of the nematode's microbiota as a basis for future functional research.

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is one of the main model species in biology, yet almost all research is performed in the absence of its naturally associated microbes. The methods described here will help to improve our understanding of the diversity of associated microbes as a basis for future functional C. elegans research.

モデル線虫の天然微生物叢の分離と特性評価

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant ...

<meta charset="utf8"></head><body>Pinus pinasterにおけるマツノボウセンチュウ感染の最適化

Infection of In Vivo and In Vitro Pines with the Pinewood Nematode Bursaphelenchus xylophilus and Isolation of Induced Volatiles

The pinewood nematode (PWN) is a phytoparasite that causes pine wilt disease (PWD) in conifer species. This plant parasitic nematode has heavily contributed to pine deforestation in Asian countries, e.g., Japan, China, and Korea. Over the last two decades, in Europe, Portugal and Spain have been greatly affected. Research on the mechanisms of PWN infection and/or PWD progression in susceptible host species relies on the controlled infection of pine seedlings under greenhouse conditions. This technique is laborious and mobilizes substantial economic and human resources. Additionally, it can be prone to variability that results from the genetic diversity associated with some pine species but also from the interference of external factors. As an alternative, in vitro co-cultures of pine with PWNs offer a more advantageous system for studying biochemical changes since they a) allow controlling single environmental or nutritional variables, b) occupy less space, c) require less time to obtain, and d) are&#160;free from contamination or from host genetic variation. The following protocol details the standard in vivo PWN infection of Pinus pinaster, the maritime pine, and the establishment of the novel in vitro co-cultures of pine shoots with the PWN as an improved methodology to study this phytoparasite influence on pine volatiles. PWN-induced volatiles are extracted from in vivo and in vitro infected pines by hydrodistillation and distillation-extraction, and the emitted volatiles are captured by solid phase microextraction (SPME), using fiber or packed column techniques.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:宿主の揮発性応答を研究するためのマツノコとマツノザイセンチュウのin vitro共培養システム

The protocol describes the in vivo and in vitro pinewood nematode infection of Pinus pinaster and their volatilome analysis through Gas Chromatography (GC) and GC coupled to Mass Spectrometry (GC-MS).

in vivoおよび昆虫病原線虫の体外飼育には（SteinernematidaeとHeterorhabditidae）

要約

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土壌のサンプリングと昆虫病原線虫の分離（Steinernematidae、Heterorhabditidae）

線虫の宿主微生物間相互作用を研究する多彩なIn Vivoモデル

根こぶ線虫、高および低スループット画面サツマイモ属。

ベアマン・ファネルによる野生の線虫の迅速な分離

蛍光顕微鏡を用いて線虫の中の細菌の可視化

腸内微生物叢細菌を濃縮する野生のカエノアハブディティス線虫の選択的洗浄

昆虫病原性線虫の培養と遺伝子操作

土壌サンプルからの病原性真菌の単離と選択と昆虫害虫に対する真菌性毒性の評価

モデル線虫の天然微生物叢の分離と特性評価

マツノザイセンチュウ Bursaphelenchus xylophilus によるIn vivoおよびIn vitroマツの感染と誘導揮発性物質の単離

in vivoおよび昆虫病原線虫の体外飼育には（SteinernematidaeとHeterorhabditidae）

要約

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土壌のサンプリングと昆虫病原線虫の分離（Steine​​rnematidae、Heterorhabditidae）

線虫の宿主微生物間相互作用を研究する多彩なIn Vivoモデル

根こぶ線虫、高および低スループット画面サツマイモ属。

ベアマン・ファネルによる野生の線虫の迅速な分離

蛍光顕微鏡を用いて線虫の中の細菌の可視化

腸内微生物叢細菌を濃縮する野生の カエノアハブディティス 線虫の選択的洗浄

昆虫病原性線虫の培養と遺伝子操作

土壌サンプルからの病原性真菌の単離と選択と昆虫害虫に対する真菌性毒性の評価

モデル線虫の天然微生物叢の分離と特性評価

マツノザイセンチュウ Bursaphelenchus xylophilus によるIn vivoおよびIn vitroマツの感染と誘導揮発性物質の単離

土壌のサンプリングと昆虫病原線虫の分離（Steinernematidae、Heterorhabditidae）

腸内微生物叢細菌を濃縮する野生のカエノアハブディティス線虫の選択的洗浄